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要約

リーフ スプレー質量分析は、サンプルの準備を最小限に抑え、排除クロマトグラフィー、小分子植物組織からの迅速な検出を可能にする直接の化学分析手法です。

要約

植物は、その化学的性質の多様である小分子の数千を生成します。質量分析 (MS) は、高い感度と特異性の分子量であるため植物代謝産物の分析のための強力な手法です。リーフ スプレー MS は、エレクトロ スプレー、クロマトグラフィー プロセスから排除することを介して直接化学分析用植物組織が使用されている周囲のイオン化技術です。代謝物質を抽出するこの方法は、同時に必要な試料の量を最小限に抑え、そのまま植物組織から検出される幅広い化学の授業にできます。高解像度、正確な質量 MS に使用する時リーフ スプレー MS 興味の代謝物の迅速な検出を容易に。また、化合物の同定を容易にするためにこの手法を持つタンデム質量断片化データを収集することが可能です。正確な質量測定と断片化の組み合わせは、化合物の id を確認するのに有益です。リーフ スプレー MS 技術は nanospray イオン源のごく一部だけを必要とし、さらに質量分析計の機能を拡張する有用なツールです。ここでは、セレチウム tortuosum (Aizoaceae)、南アフリカ共和国から伝統的な薬用植物から新鮮な葉組織を分析します。多数の mesembrine アルカロイドは、リーフ スプレー MS で検出されます。

概要

植物には、多様な化学的性質を持つ小さな分子の広い範囲が含まれています。MS はそれは代謝産物1の同定のため高い感度と特異性の元素組成を提供できるため、植物の化合物を分析するための強力な手法です。最も一般的に、MS は MS 分析1前クロマトグラフィーによる分離溶媒抽出のサンプルで実行されます。しかし、液体クロマトグラフィー (LC) の使用は長い解析時間を必要とする、広範なサンプル準備1に関連付けられて多くの場合。対照的に、クロマトグラフィーを回避、そのまま組織の直接の化学分析は非常に急速な技術は、最小限のサンプル準備2が必要です。したがって、ガスクロマト グラフの手順を実行することができます forgone する場合、直接の化学分析は非常に有利なすることができます。

自然な製品とメタボロミクス研究のための典型的な LC MS は、複数の組織や細胞の種類3を含む乾燥または冷凍植物材料の長い一括抽出に依存します。また、植物組織の代謝物 MS 検出などの直接の化学分析は種類の細胞を分離し、避ける準備アイテム4できます。リーフ スプレー MS、組織スプレー5,6とも呼ばれますは、本質的にサンプル準備5,7を必要と直接周囲のイオン化質量テクニックです。リーフ スプレー MS は紙スプレー MS、蒸着、紙7検体の検出では、エレクトロ スプレー イオン化の特性を持つ周囲のイオン化法に密接に関連。名前に反してリーフ スプレー MS 植物組織の様々 なタイプに適用されます、葉だけではなく、されている6,8,9、果実、種子、根、花組織および塊茎、他の中で示される 10、11,12。技術は、検出8の質量分析計に植物材料から直接内因性植物化学物質のイオン化を促進します。リーフ スプレー MS は、植物13の異なる組織型の化学物質の空間分布に関する情報も提供できます。リーフ スプレー MS は溶媒抽出 LC-MS と比較すると、結果は毛13などユニークなセル型から表面代謝物の迅速な検出は、MS リーフ スプレーをお勧めします。図 1は、リーフ スプレー MS の実験の設定を示しています。直接エレクトロ スプレー イオン化はマイナーなソース変更のみに発生します。金属クランプを介して植物組織に高電圧を印、植物の自然の液体や溶剤の appl から発生するイオン化とさんエレクトロ スプレーのイオン注入口にイオンを運ぶテイラー コーンを形成高帯電液滴のスプレーを生産植物の表面に ied。組織に先の尖った先端エレクトロ スプレーを容易し、することができます自然発生するまたは作成された切断することによって。

リーフ スプレー MS は、さまざまなアプリケーションのためのユーティリティを発見した生きた植物組織の定性・半定量分析のための高速化手法です。たとえば、関連種を区別するために、さまざまな条件下で栽培した同じ種の変化を評価するためにも内因性化合物を検出する手法が使用されています。以前の研究は、ムラサキシキブ (誉めそやさl.) の代謝物を測定することによってこのアプローチを示しています。12アメリカ人参(人参 quinquefolium l.)6。 濡れ生人参の組織後検出できる後者の例では、オリゴ糖、アミノ酸、ジンセノ サイド。野生および栽培のアメリカ人参は、塊茎スライス6から区別されました。高麗人参の塊茎の整合性は、その後の形態学的および顕微鏡検査6許可承継リーフ スプレー MS、保たれていた.さらに、植物のサンプルの外因性化合物も検出できます。皮や果物や野菜の9のパルプの農薬 (殺虫剤アセタミプリド、ジフェニルアミン、イマザリル、リニュロン、チアベンダゾール) の数が検出されました。一方、これらの研究や他の多くは、様々 な特定の目的のためリーフ スプレー MS の有用性を示している、詳細なプロトコルが以前報告されていません。

ここでは、プロトコルの説明が特定の組織または複合法の最適化に焦点を。葉種、組織、スプレー MS の実験を設定するときに取られるべき必要な最適化の対策を議論するための例として (Aizoaceae)セレチウム tortuosum (l.) N.E.Br から mesembrine アルカロイドの検出を使用する代わりに、または初めての化合。S. tortuosumは、南アフリカ共和国の半乾燥のベル ト領域にジューシーな流行です。San の伝統医学とコーイ コーイの人々、その向精神と鎮痛効果14,15に関しては同様の食欲と渇望抑制に使われていました。現在、標準化された抽出物は、神経と神経心理学的障害16,17の治療に使用されます。アルカロイド mesembrine およびその誘導体、関連セレチウム種15も、多くの関心の主な化合物が含まれます。S. tortuosumの野生および栽培個体群は、品質管理の挑戦18を提示する mesembrine アルカロイドの可変濃度を持っています。リーフ スプレー MS などの mesembrine アルカロイドの迅速な検出法は、セレチウム製品を監視に役立ちます可能性があります。以前は、リーフ スプレー MS 技術の詳細な視覚実験的プロトコルがなかった、 s. tortuosumの例を使用する方法を紹介します、次の説明: nanospray ソースの変更、選択と植物組織の準備、データの取得、結果の解釈、MS パラメーターの最適化。

プロトコル

1. 葉の Nanospray ソースに変更スプレー MS

  1. リーフ スプレー MS に変更した nanospray ソースを使用します。流体部品をリーフ スプレー MS に必要なしと、ソースを変更するには、ソースから LC プローブを削除します。
  2. ソースに接続するための適切なピンと植物組織に電圧を適用するリーフ スプレー MS ワイヤを組み立てます。絶縁線; の一方の端にピンをはんだ付けワイヤーの反対側の端にクランプをはんだ付けします。
    メモ: クランプ (ワニ口クリップ タイプ) には、歯がない可能性があります。小さい組織、歯なしクランプが適しています。クランプで省略可能なフレックス アームは、植物組織の配置を支援する nanospray のソースに追加可能性があります。注このプロトコルは、具体的には、ハイブリッド四重極イオン トラップ質量分析計 MS システムでリーフ スプレー MS を実行する方法を記述 (材料の表を参照)。ただし、このテクニック6を実行する他の MS のシステム改変すること。リーフ スプレーをカップリング ポータブル質量分析計のリアルタイム分析と MS 実行できます敷地内研究室19,20植物材料を輸送する必要なし。
  3. 放電の高電圧を使用する場合は、ソースから発生する可能性を減らすためにソースの下の階に帯電防止床マットを置きます。

2. リーフ スプレー MS の MS システムの準備

  1. システムで使用している、それを触ると冷却し、任意の代替ソースとスイープ コーンを削除を許可します。Nanospray リーフ スプレー MS ソースを添付します。
  2. 適切なイオン化パラメーターを次のように設定で曲ファイルを作成: シース、補助、掃引ガス 0;スプレー電圧が 2-5 kV;キャピラリー温度 150-250 ° c;50 S レンズ RF レベル。目的のパラメーター8,13曲ファイルを保存します。電圧と組織の最高の電離と関心の化合の温度を最適化します。
    注: 良い出発点は、4 kV、200 ° C
  3. リーフ スプレー MS 曲ファイルを含むメソッド ファイル: 正と負完全 MS;解像度 70,000。1 x 106の AGC ターゲット最大 200 ms; のそれ必要なスキャン範囲z/z は m。また、のみ 1 極性を使用します。

3. 計測器、溶剤および植物組織の準備

注:常に手袋を着用し、素手で処理された植物組織を使用しないでください。そうでなければ、ポリエチレング リコールなどの汚染イオン スペクトルを支配するでしょう。

  1. 解析を可能にする高速サンプリング MS システムとして同じ部屋に植物組織をもたらします。
  2. 当然のことながら先端を持たない植物組織、ガラス スライド上テーパー点 (図 2) をカットするのにかみそりの刃を使用します。測定器の感度、組織型、および関心の化合に基づいて解析に必要な組織の量を決定する (例えば、若いs. tortuosum葉の長さは 〜 5 mm)。
    1. カットs. tortuosum 10 週間で千切り各ポイントを形成するテーパー エンド後の発芽を残します。
  3. 鉗子を使用して、優しくクランプが終わりに植物の組織を選択します。クランプにそれを転送鉗子で組織を持ち、慎重に。
    注意: 電圧が存在する場合は、楽器ソースを触れないでください。
  4. MS 入口に沿って組織に配置植物組織と MS のイオン入口間の距離は三重四重極 (例えばTSQ) の 5-10 の mm のクランプとフレキシブル アームとワイヤーを調整する線形トラップ四重極 (焼入れ) と 10-イオン トラップの質量分析計 (例えばorbitrap)850 mm。
    1. ソースにワイヤーの反対側の端を差し込みます。最初の試みは、低輝度を生成する場合は、イオン注入口に近い植物組織を移動 (最適化のための議論を参照)。
  5. 方法ファイルを読み込むデータ ファイルの名前し、ファイルの保存場所を設定します。再生をクリックして MS システムをオンし、データ集録を開始する開始をクリックします。
  6. 適用 (例えばメタノール) 溶剤ゲルの読み込みヒントとピペットを使いを使用してユーザーを保護するために高電圧と手の間の距離を最大化します。
    注意: 溶剤のボリュームに必要なサイズ、乾燥、および組織のテクスチャによって異なります、通常 2 ~ 20 μ L. s. tortuosum葉は不要追加する溶剤です。慎重に溶剤を適用し、電圧がオンのとき、楽器ソースを触れないでください。LC MS グレード溶剤や酸処理をされている、洗剤の無料ガラスを使用します。いくつかの組織で植物組織の自然含水率により溶媒を添加せず信号を観察する可能性があります。ただし、大きい信号強度と低 S/N 通常溶媒を組織に適用することにより実現します。
  7. データを集録信号が解決しない限り、または十分なスペクトルを収集されている、まで通常 30-60 秒。必要な場合は、時間の長い量の高信号強度を維持するために追加の溶剤を適用します。データ集録を停止し、MS システムを一時停止します。
  8. 組織を削除し、100% メタノールと糸くずのワイプとクランプを洗ってください。ベンダーの仕様に従ってにリーフ スプレー MS による買収の約 1-2 時間後の MS イオン入口をきれいに。また、様々 な組織の分析間 MS イオン入口をきれい。

4. データ品質評価

  1. データ ファイルを開き、基本ピークの質量 chronogram を目視で確認します。信号強度が 5.0 x 10 ~1.0 x 107であることを確認8。信号が低い場合は、イオン入口に近い組織を移動します。場合は高い、MS システムのフロント エンドが汚れになる、だからイオン入口から遠い組織を移動します。
  2. 生産質量スペクトルへの関心のイオンの有無に基づいて、パラメーターを変更します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。

5. タンデム質量断片化

  1. タンデム質量断片化 (MS/MS); のための興味のイオンを決定します。> 10 x 1.0 質量スペクトル信号5は MS/MS のイオンの選択のために十分な。
  2. M/zを信頼のリストと新しいメソッド ファイルを小数点以下 4 にします。包含およびグローバル リストをクリックします。[ PRM のプロパティ、選択破砕エネルギー [例えば、30 から 50 までの正規化された衝突エネルギー (NCE) は良い範囲で開始する] およびその他の MS/MS パラメーター。
    1. Mesembrine アルカロイドの MS/MS データを取得するには、次のイオン、276.1583 z/z は m、290.1742 m/z、および nce-コード 35、292.1897 m/zをフラグメントします。
      注: MS 後すぐにまたは後で、MS/MS データ集録を実行できます。同じ組織における MS 後固定多くの場合残ることができる、MS/MS データ取得で再利用できます。ただし、respraying が十分な信号が提供しない場合は、新しい組織を使用します。
  3. MS/MS メソッド ファイルと名前付きデータ ファイルを読み込みます。MS システムをオンにし、必要に応じて溶剤を追加、データの取得を開始します。十分なスペクトルを収集すると、通常 30-60 秒後集録を停止します。
  4. フラグメント イオンを割り当てるときは、たくさんの異なるエネルギーでの断片化を収集します。
    注: リーフ スプレー MS は、クロマト分離を欠いている、ので断片化スペクトルは多くのイオンを含まれ、明快さをもたらす助けとなるさまざまなエネルギーで断片化します。

6 正確な質量とタンデム質量断片化による推定同定

  1. Metlin21, ヒトのメタボローム データベース22、質量銀行23, 脂質マップ24、国立研究所などの公に利用可能な代謝物データベースから正確な質量測定を参照することによって推定される識別を行う標準および技術 MS25、フィトケミカル26、または GNPS27のための点を検索します。
  2. これらのデータベースは、網羅されていません、必要に応じて特徴付けられる化学的に植物種の追加文献を実行します。
  3. 葉から一致断片化イオン スプレー MS/MS の MS/MS 情報が利用できるとき、前述のデータベース、文献。また、MS/MS フラグメント イオンのマニュアルの解釈や直噴または LC ・ MS/MS を行い本格的な標準の断片化を使用します。

7. データ解析

  1. Proteowizard28から msConvert ツールを mzXML ファイルに MS の raw ファイルを変換します。
  2. ピーク ピッキングの R に実装されて XCM のソフトウェア パッケージを使用します。直接注入加工リーフ スプレー質量分析の方法を使用します。
    注: データ処理に使用されるよく注釈付きのスクリプトは、https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code で見つけることが。
  3. 実験的変動の会計の半定量的な測定値を得るに総イオン電流 (TIC) でできる MS の信号強度を一部の位置のわずかな変化により異なるリーフ スプレーとしての各代謝物質の強度を正規化する.葉元と葉の形やサイズの違い。
  4. また、ベンダーが提供するソフトウェア、データ分析や MZmine2 を使用して、(http://mzmine.github.io/ である) に29。

結果

10 週間後の発芽、新鮮の温室栽培の米 tortuosumの葉で葉スプレー MS によって分析されました。S. tortuosumからの代謝物を検出するための実験的ワークフロー葉リーフ スプレー MS は図 2に示します。葉を選択、ポイントを形成するテーパー エンドの薄いストリップにカット、リーフ スプレー MS ワイヤー クランプ装置で固定します。イ...

ディスカッション

このプロトコルの使用の成功は、植物の種、組織型、および興味のターゲット化合のさまざまな段階の最適化に依存します。プロトコルに記載されているパラメーターは、良い出発点を提供します。作られ、テストする必要があります次の実験的決定: かどうか使用 (1) カットまたはノーカットの組織、(2) 溶剤溶剤は、(3) どのような溶媒を使用してどのくらいのボリュームで、(4) イオン入口...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、NSF 植物ゲノム研究プログラム助成 IOS 1238812 と員生物 IOS-1400818 によって賄われていた。仕事もキャサリン A. サモンズにモンサント社の大学院学生団体によって資金を供給されました。フルブライト アフリカ研究者学者プログラム (2017-2018) が Nokwanda P. Makunga に与えられる資金の感謝の意を。ジェシカの Prenni からの nanospray ソースの寄付、コロラド州立大学でプロテオミクスとメタボロミクスの設備をお願い申し上げます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Conn PinDigi-Key elctronicsWM2563CT-NDpin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clampDigi-Key elctronics314-1018-NDCLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clampDigi-Key elctronics290-1951-NDALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrinkDigi-Key elctronicsQ2Z1-KIT-NDto cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion SourceThermo scientificNAAnother brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole OrbitrapThermo scientificNAAnother brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune SoftwareThermo scientificAnother brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur SoftwareThermo scientific
Plant of interest - S. tortousum

参考文献

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