JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Лист спрей масс-спектрометрия является метод прямого химического анализа, который минимизирует пробоподготовки и устраняет хроматографии, позволяя для быстрого обнаружения малых молекул из растительных тканей.

Аннотация

Растения производят тысячи маленьких молекул, которые являются различными в их химических свойств. Масс-спектрометрия (МС) – это мощный метод для анализа метаболитов завод, потому что он обеспечивает молекулярным весом с высокой чувствительностью и специфичностью. Лист спрей MS это техника окружающего ионизации где растительной ткани используется для прямого химического анализа через электроспрей, устраняя хроматографии из процесса. Этот подход к выборки метаболитов для широкого круга химических классов позволяет обнаружить одновременно с нетронутыми растительных тканей, свести к минимуму количество пробоподготовки требуется. При использовании с высоким разрешением и точной массы MS, лист спрей MS облегчает быстрое обнаружение метаболитов интерес. Это также возможно для сбора тандем массового фрагментации данных с этой техникой, чтобы облегчить составные идентификации. Сочетание точных измерений массы и фрагментации является полезным в подтверждающие составного удостоверения. Лист спрей MS техника требует лишь незначительных изменений в источник ионизации наноспрей и является полезным инструментом для дальнейшего расширения возможностей масс-спектрометр. Здесь свежих листьев ткани из Sceletium tortuosum (Аизовые), традиционное лекарственное растение из Южной Африки, анализируется; многочисленные Мезембрин алкалоиды обнаружены с листьев спрей МС.

Введение

Растения содержат широкий спектр малых молекул с различными химическими свойствами. MS – это мощный метод для анализа соединений растений, потому что он может предоставить элементарный композиции с высокой чувствительностью и специфичностью для обнаружения и идентификации метаболитов1. Чаще всего MS выполняется растворителя извлечены образцы, которые разделены хроматографии до MS анализ1. Однако использование жидкостной хроматографии (LC) требует длительного анализа раз и часто ассоциируется с обширной выборки подготовка1. В отличие от прямой химический анализ нетронутыми тканей, который обходит хроматографии это очень быстрый метод, требующих минимальной образца подготовка2. Таким образом в случаях, где может быть неполученный хроматографического шаги, прямой химический анализ может быть весьма выгодным.

Типичный LC-MS для натуральных продуктов и метаболомики исследования опирается на длительных массового извлечения сушеных или замороженных растительных материалов, содержащих несколько тканей и клеток типа3. Кроме того прямой химический анализ, например MS обнаружения метаболитов из растительной ткани, можно изолировать типы клеток и избежать подготовки артефакты4. Лист спрей МС, также упоминается как ткани спрей5,6, является прямой окружающего ионизации MS метод, который требует по существу не образца подготовка5,7. Лист спрей, который МС тесно связана с бумаги спрей МС, окружающего ионизации технику с характеристиками электроспрей ионизации, которая позволяет для обнаружения аналитов, залегают на бумаге7. Несмотря на название, лист спрей MS для различных видов растительных тканей, не только листья и был продемонстрирован на фрукты, семена, корни, цветочные ткани и клубни, среди других,6,8,9 10,,1112. Техника способствует ионизации эндогенного фитохимические непосредственно из растительного сырья в масс-спектрометр для обнаружения8. Лист спрей MS также может предоставить информацию о пространственном распределении химических веществ в ткани различных типов растений13. Когда лист спрей MS сравнивается с жидкостной экстракции и LC-MS, результаты предполагают спрей листьев, MS позволяет для быстрого обнаружения поверхностных метаболитов из типов уникальных клеток например трихом13. Рисунок 1 иллюстрирует экспериментальной установки MS спрей листьев. Прямые электроспрей ионизации происходит после лишь незначительные источника изменения. Высокое напряжение применяется к заводе ткани через металлический зажим, производства спрей высоко заряженных капель, образуя Тейлор конус, который несет ионов на входе ионов электроспрей г-жа ионизация происходит от естественной жидкости завода или растворителя appl СВУ на поверхности растений. Заостренным кончиком на ткани облегчает электроспрей и может быть естественно происходя или созданного путем разрезания.

Лист спрей MS это быстрый метод для качественного и полуколичественного анализа нетронутыми растительных тканей, которые нашли утилита для широкого ряда приложений. Например этот метод был использован для обнаружения эндогенных соединений различать родственных видов и даже для оценки изменений в того же вида, выращиваемые в различных условиях. Предыдущие исследования показали этот подход путем измерения метаболитов в Бьютиберри (Callicarpa L.) 12 и американский женьшень (Panax quinquefolium L.) 6. в последнем примере, гинзенозиды, аминокислоты и олигосахариды могут быть обнаружены после смачивания ткани сырой женьшень. Диких и культивируемых американский женьшень были дифференцированы от клубней ломтиками6. Женьшень клубней целостность был грядущие спрей лист MS, что позволило за последующие инспекции морфологических и микроскопических6. Кроме того может быть также обнаружен экзогенных соединений на образцы растений. Количество пестицидов (ацетамиприд, дифениламина, уничтожения, linuron и ботвы) были обнаружены в кожуре или целлюлозно фрукты и овощи9. Хотя эти исследования и многие другие показали полезность листьев спрей MS для различных конкретных целей, подробный протокол уже не сообщалось ранее.

Здесь описание протокола не будет сосредоточена на оптимизации метода для конкретной ткани или соединения. Скорее, обнаружение алкалоидов Мезембрин из Sceletium tortuosum (L.) N.E.Br. (Аизовые) используется в качестве примера для обсуждения необходимости оптимизации мер, которые следует использовать при создании листа спрей MS эксперимент для видов, ткани, или Compound(s) в первый раз. S. tortuosum это сочные эндемик полузасушливых Karroo региона Южной Африки. Традиционной медицины Сан и общины кой кой народов, он был использован для аппетита и жажда подавления, а также его психотропных и обезболивающий эффекты14,15. В настоящее время стандартизированные экстракты используются для лечения психоневрологических и нейропсихологические расстройства16,17. Основных соединений интерес включают алкалоид Мезембрин и его производные, многие из которых также находятся в смежных видов Sceletium 15. Популяций диких и культивируемых S. tortuosum имеют переменную концентрации Мезембрин алкалоидов, представляя таким образом проблема контроля качества18. Метод для быстрого обнаружения Мезембрин алкалоидов, например лист спрей МС, может быть полезным в мониторинге Sceletium продукции. Потому, что ранее было не подробный визуальный экспериментальный протокол для листьев спрей MS технику, мы проиллюстрируем метод, с помощью примера S. tortuosumи описан ниже: модификация наноспрей источника, отбор и подготовка растительных тканей, приобретение данных, интерпретация результатов и оптимизации параметров MS.

протокол

1. изменения наноспрей источник для листьев спрей MS

  1. Используйте измененный наноспрей источник для листьев спрей МС. Как не аэрогидродинамических компоненты необходимы для листьев спрей MS, измените источник, удалив LC зонд из источника.
  2. Соберите листьев спрей MS провод, который будет применяться к растительной ткани с соответствующим ПИН-код для подключения к источнику напряжения. Припой булавку, чтобы один конец изолированные провода; припой зажим в противоположном конце провода.
    Примечание: Зажим (Аллигатор клип тип) может иметь или не иметь зубы. Для небольших ткани зажим без зубов является предпочтительным. Необязательный flex руку с зажимом могут быть добавлены к источнику наноспрей для оказания помощи в позиционировании тканей растений. Обратите внимание, что этот протокол конкретно описано выполнение листьев спрей MS на гибридные квадрупольного ионная ловушка массового анализатор системы MS (см. Таблицу материалов); Однако другие MS систем могут быть изменены для выполнения этот метод6. Муфта листьев спрей MS с портативных масс-спектрометр реального времени химический анализ может выполняться на месте без необходимости транспортировки растительного материала в лаборатории19,20.
  3. Позиция антистатический коврик на полу ниже источник для уменьшения электрического разряда, которое может произойти от источника при использовании высоких напряжений.

2. Подготовка системы MS лист спрей MS

  1. Если система недавно была в использовании, позволяют ему прохладный на ощупь и удаления любого альтернативного источника и развертки конуса. Присоедините источник MS спрей наноспрей листьев.
  2. Создайте файл настройки с параметрами соответствующие ионизации следующим: оболочка, вспомогательные и развертки газ 0; спрей напряжения 2-5 кв; капиллярные температуру до 150-250 ° C; и S-объектив РФ уровень 50. Сохраните файл настройки с нужными параметрами8,13. Оптимизируйте напряжения и температуры для лучших ионизации ткани и compound(s) интерес.
    Примечание: Хороший отправной точки являются 4 кв и 200 ° C.
  3. Сделать файл метод, включая файл настройки спрей MS листьев с: положительные и отрицательные полный МС; резолюция 70000; Целевой объект СМЖЛ 1 x 10-6; максимум это 200 мс; и желаемого сканирования диапазона m/z. Кроме того используйте только 1 полярности.

3. подготовка инструмента, растворителей и тканей растений

Примечание: Всегда надевайте перчатки и не использовать растительной ткани, который был обработан с голыми руками. В противном случае загрязнения ионы как полиэтилен гликоль будет доминировать спектры.

  1. Принесите растительных тканей для анализа в такой же комнате как MS системы для быстрой выборки.
  2. Для тканей растений, который не имеет естественно заостренным кончиком используйте лезвие бритвы на слайде стекла сократить точки конические (рис. 2). Определить количество ткани, необходимых для анализа, основанного на инструмент чувствительность, тип ткани и compound(s) интерес (например, молодой S. tortuosum лист это ~ 5 мм в длину).
    1. Вырезать S. tortuosum листья 10 недель после прорастания на тонкие полоски, каждый с коническим концом сформировать точку.
  3. Используйте щипцы для нежно выбора тканей растений в конце, что будет зажато. Проведение ткани с щипцами, тщательно передача его в зажим.
    Предостережение: Не прикасайтесь исходного документа, если напряжение на.
  4. Отрегулируйте гибкие руки и проволока с зажимом позиционировать ткани в соответствии с MS впускного, так, чтобы расстояние между растительной ткани и входе ионов МС составляет 5-10 мм для тройной четырехполюсника (например, TSQ) и линейной ловушку четырехполюсника (LTQ) и 10 -для ловушек ионной масс-анализатор (например, Орбитрэп)850 мм.
    1. Подключите противоположный конец провода источник. Если первые попытки производить сигнал низкого уровня интенсивности, переместите растительной ткани ближе к входу ионов (см. обсуждение для оптимизации).
  5. Загрузить файл метод; имя файла данных и задать место хранения файла. Затем включите систему MS, нажав играть и нажмите на старт , чтобы начать приобретение данных.
  6. Применить растворителя (например, метанол) с помощью пипетки с наконечником гель загрузки увеличить расстояние между руками и высокого напряжения для защиты пользователя.
    Примечание: Объем растворителя требуется, зависит от размера, сухости и текстуры ткани, обычно ~ 2-20 мкл. S. tortuosum листья не требуется каких-либо растворителей для добавления. Осторожно применять растворителя и не прикасайтесь исходного документа, когда напряжение на. Используйте растворители класса LC-MS и посуда, которая была кислоты промывают и бесплатно моющих средств. В некоторых тканях сигнал может наблюдаться без добавления растворителя из-за природной воды содержание растительной ткани. Однако большей интенсивности сигнала и снижение S/N, обычно достигается путем применения растворителя на ткани.
  7. Приобретение данных до тех пор, пока сигнал сохраняется или до тех пор, пока достаточное спектров были собраны, обычно 30-60 сек. При необходимости, примените дополнительные растворителя для поддержания интенсивности высокий сигнал для длительного количества времени. Остановить сбор данных и приостановки системы MS.
  8. Удаление ткани и мыть зажим с 100% метанола и ворса протрите. Очистите впускной Ион MS после примерно 1-2 ч и приобретения лист спрей MS согласно спецификациям производителя. Кроме того чистые MS Ион входе между анализ типов различных тканей.

4. данные оценки качества

  1. Откройте файл данных и визуально проверить базовый пик массовых Интеренет. Убедитесь, что интенсивность сигнала ~1.0 x 107 до 5,0 x 108. Если сигнал ниже, переместите ткани ближе к входу ионов. Если выше, передний конец системе MS станет грязной, так переместите ткани дальше входе ионов.
  2. Основываясь на наличие или отсутствие ионов интерес к массового производства спектры, измените параметры.
    Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.

5. тандем массового фрагментации

  1. Решите, какие ионы представляют интерес для массового фрагментации тандем (МС/МС); массового спектрах сигнал, что > 1,0 x 105 достаточна для выделения ионов для МС/МС.
  2. Сделать новый файл метод с включение перечня m/z , чтобы 4 десятичных разрядов. Нажмите на глобальные списки и включение. В разделе Свойства PRM, выберите фрагментации энергии [например, нормализованных столкновения энергию (Лазурный берег NCE) 30-50 является хороший выбор для начала] и другие параметры МС/МС.
    1. Для получения данных МС/МС для Мезембрин алкалоиды, фрагмент следующих ионов, 276.1583 m/z, 290.1742 m/zи 292.1897 m/z, NCE 35.
      Примечание: Получение данных MS/MS может выполняться сразу после MS или в более позднее время. Же ткани могут часто остаются зажатыми после полной МС и может быть повторно использован для приобретения данных MS/MS. Однако если повторного распыления не обеспечивают достаточного сигнала, используйте новые ткани.
  3. Загрузите файл метод МС/МС и файл данных с именем. Включите MS системы и начать приобретение данных, добавляя растворитель при необходимости. Когда собрали достаточное спектры, обычно после 30-60 сек, остановите приобретения.
  4. Соберите фрагментации на многих различных энергий при назначении фрагмент ионов.
    Примечание: Поскольку лист спрей MS отсутствует хроматографического разделения, спектры фрагментации, скорее всего, содержат много ионов, и фрагментации в различных энергий поможет внести ясность.

6. предполагаемого опознания разртвом Точная масса и тандем массового

  1. Сделать предполагаемого идентификаций, ссылаясь на точных измерений массы из публично доступных метаболит баз данных, таких как Метлин21,22человека метаболом базы данных, массы банка23, липидов карты24, Национальный институт Стандарты и технологии MS Поиск25, уважение фитохимические26или27ВНП.
  2. Эти базы данных не являются исчерпывающими, выполните обзор дополнительную литературу на химически характеризуется как необходимые виды растений.
  3. Матча фрагментации ионов из листьев спрей МС/МС в вышеупомянутой базы данных, когда МС/МС информация доступна, или к литературе. Альтернативно используйте ручной интерпретации ионов МС/МС фрагмент или фрагментация подлинный стандарт, выполняемые прямого впрыска или LC-MS/MS.

7. анализ данных

  1. Конвертировать raw файлов MS mzXML файлов с помощью инструмента msConvert Proteowizard28.
  2. Используйте пакет программного обеспечения XCMS, реализованы в R для максимальной комплектации. Используйте прямые вливания, метод для листьев спрей MS анализа обработки.
    Примечание: Хорошо аннотированных сценарии, используемые для обработки данных можно найти на https://github.com/HegemanLab/Leaf-Spray-Code.
  3. Чтобы получить полуколичественного измерения, учета для экспериментальной изменчивости, нормализовать интенсивность каждого метаболит всего текущего Ион (ТИЦ), как лист спрей, интенсивности сигнала MS может варьироваться, отчасти из-за небольшие вариации в позиционировании лист в источнике и различия в форму листьев и размер.
  4. Кроме того, использовать предоставленных поставщиков программного обеспечения для анализа данных или MZmine2 (чтобы найти на http://mzmine.github.io/)29.

Результаты

В 10 недель, листья после прорастания, свеже собранных выросли парниковых S. tortuosum были проанализированы лист спрей МС. Экспериментальный рабочего процесса для обнаружения метаболитов от S. tortuosum листья с помощью спрей листьев, которые MS проиллюстрирована на

Обсуждение

Успешное использование этого протокола опирается на оптимизации различных шагов для видов растений, тип ткани и целевой compound(s) интерес. Параметры, указанные в настоящем Протоколе обеспечивают хорошей отправной точкой. Следующие экспериментальные решения должны быть изготовлены и ис?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа финансировалась Грант программы исследований генома растений NSF IOS-1238812 и докторантура стипендий в биологии IOS-1400818. Работа финансировалась Монсанто студенческих стипендий для Кэтрин а. Сэммонс. Программа Фулбрайта для африканских исследователя ученых (2017-2018 годы) поблагодарил за финансирование присуждена Nokwanda P. Makunga. Мы высоко ценим пожертвования наноспрей источник из Джессика Prenni и протеомики и метаболомики объекта в университете штата Колорадо.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Conn PinDigi-Key elctronicsWM2563CT-NDpin will insert into Thermo Scientific source to provide voltage
small clampDigi-Key elctronics314-1018-NDCLIP MICRO ALLIGATOR COPPER 5A
large clampDigi-Key elctronics290-1951-NDALLIGATOR CLIP NARROW NICKLE 5A
Heat shrinkDigi-Key elctronicsQ2Z1-KIT-NDto cover soldering joints
NSI source Nanospray Ion SourceThermo scientificNAAnother brand will work if you are not using a Thermo instrument
Q Exactive- hybrid quadrupole OrbitrapThermo scientificNAAnother brand will work if you are not using a Thermo instrument
Tune SoftwareThermo scientificAnother brand will work if you are not using a Thermo instrument
Xcalibur SoftwareThermo scientific
Plant of interest - S. tortousum

Ссылки

  1. Pitt, J. J. Principles and applications of liquid chromatography - mass spectrometry in clinical biochemistry. The Clinical Biochemist Reviews. 30 (1), 19-34 (2009).
  2. Cooks, R. G., Ouyang, Z., Takats, Z., Wiseman, J. M. Detection technologies. Ambient mass spectrometry. Science. 311 (5767), 1566-1570 (2006).
  3. Kim, H. K., Verpoorte, R. Sample preparation for plant metabolomics. Phytochemical Analysis. 21 (1), 4-13 (2010).
  4. Takats, Z., Wiseman, J. M., Gologan, B., Cooks, R. Mass spectrometry sampling under ambient conditions with desorption electrospray ionization. Science. 306 (5695), 471-473 (2004).
  5. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  6. Chan, S. L. -. F., Wong, M. Y. -. M., Tang, H. -. W., Che, C. -. M., Ng, K. -. M. Tissue-spray ionization mass spectrometry for raw herb analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 25 (19), 2837-2843 (2011).
  7. Wang, H., Liu, J., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Paper spray for direct analysis of complex mixtures using mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition. 49 (5), 877-880 (2010).
  8. Liu, J., Wang, H., Cooks, R. G., Ouyang, Z. Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (20), 7608-7613 (2011).
  9. Malaj, N., Ouyang, Z., Sindona, G., Cooks, R. G. Analysis of pesticide residues by leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 4 (7), 1913-1919 (2012).
  10. Snyder, D. T., Schilling, M. C., Hochwender, G., Kaufman, A. D. Analytical methods profiling phenolic glycosides in Populus deltoides and Populus grandidentata by leaf spray ionization tandem mass spectrometry. Analytical Methods. 7 (3), 870-876 (2015).
  11. Falcone, C. E., Cooks, R. G. Molecular recognition of emerald ash borer infestation using leaf spray mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (11), 1304-1312 (2016).
  12. Liu, J., Gu, Z., Yao, S., Zhang, Z., Chen, B. Rapid analysis of Callicarpa L. using direct spray ionization mass spectrometry. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 124, 93-103 (2016).
  13. Freund, D. M., Martin, A. C., Cohen, J. D., Hegeman, A. D. Direct detection of surface localized specialized metabolites from Glycyrrhiza lepidota (American licorice) by leaf spray mass spectrometry. Planta. 247 (1), 267-275 (2018).
  14. Smith, M. T., Crouch, N. R., Gericke, N., Hirst, M. Psychoactive constituents of the genus Sceletium N.E.Br. and other Mesembryanthemaceae: a review. Journal of Ethnopharmacology. 50 (3), 119-130 (1996).
  15. Gerickea, N., Viljoen, A. M. Sceletium-a review update. Journal of Ethnopharmacology. 119 (3), 653-663 (2008).
  16. Terburg, D., et al. Acute effects of Sceletium tortuosum (Zembrin), a dual 5-HT reuptake and PDE4 inhibitor, in the human amygdala and its connection to the hypothalamus. Neuropsychopharmacology. 38 (13), 2708-2716 (2013).
  17. Coetzee, D. D., López, V., Smith, C. High-mesembrine Sceletium extract (TrimesemineTM) is a monoamine releasing agent, rather than only a selective serotonin reuptake inhibitor. Journal of Ethnopharmacology. 177, 111-116 (2016).
  18. Shikanga, E. A., et al. In vitro permeation of mesembrine alkaloids from Sceletium tortuosum across porcine buccal, sublingual, and intestinal mucosa. Planta Medica. 78 (3), 260-268 (2012).
  19. Pulliam, C. J., Bain, R. M., Wiley, J. S., Ouyang, Z., Cooks, R. G. Mass spectrometry in the home and garden. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (2), 224-230 (2015).
  20. Lawton, Z. E., et al. Analytical validation of a portable mass spectrometer featuring interchangeable, ambient ionization sources. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 28 (6), 1048-1059 (2017).
  21. . GNPS Available from: https://gnps.ucsd.edu/ (2018)
  22. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  23. Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Ore, M. MZmine2: modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 395 (2010).
  24. Meyer, G. M. J., Wink, C. S. D., Zapp, J., Maurer, H. H. GC-MS, LC-MS(n), LC-high resolution-MS(n), and NMR studies on the metabolism and toxicological detection of mesembrine and mesembrenone, the main alkaloids of the legal high "Kanna" isolated from Sceletium tortuosum. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407 (3), 761-778 (2015).
  25. Zhang, N., et al. Rapid detection of polyhydroxylated alkaloids in mulberry using leaf spray mass spectrometry. Analytical Methods. 5 (10), 2455-2460 (2013).
  26. Pereira, I., et al. Rapid screening of agrochemicals by paper spray ionization and leaf spray mass spectrometry: which technique is more appropriate?. Analytical Methods. 8, 6023-6029 (2016).
  27. Zhang, J. I., Li, X., Cooks, R. G. Direct analysis of steviol glycosides from Stevia leaves by ambient ionization mass spectrometry performed on whole leaves. The Analyst. 137 (13), 3091-3098 (2012).
  28. Freund, D. M., Hegeman, A. D. Recent advances in stable isotope-enabled mass spectrometry-based plant metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 43, 41-48 (2017).
  29. Wurtzel, E. T., Kutchan, T. M. Plant metabolism, the diverse chemistry set of the future. Science. 353 (6305), 1232-1236 (2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

136MSSceletium tortuosum

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены