裏打ちクリア: 組織の脂肪組織の三次元イメージング法をクリア

要約

高脂質含量のため従来の組織学的方法を使用して視覚化する脂肪組織にチャレンジしております。裏打ちクリアは、堅牢なラベリングと脂肪組織の高分解能体積蛍光イメージングができるテクニックをクリア組織です。ここでは、試料調製、前処理、染色、クリア、およびイメージング用取付方法をについて説明します。

要約

脂肪組織は、エネルギー代謝と体温調節に中心的な役割を果たしています。それは脂肪細胞と同様、脂肪細胞の前駆物質、免疫細胞、線維芽細胞、血管、神経投射の種類で構成されます。その分布と建築の可視化によるこれらの居住者の脂肪細胞のより包括的な理解を実現できますが、特定の細胞の分子制御とこれらの細胞の相互関係をますます線引きされている,全体全体の組織。脂肪組織を分析する既存の免疫組織染色と蛍光抗体法のアプローチは、薄いパラフィン埋め込まれたセクションに依存します。ただし、薄片組織の小さな部分のみをキャプチャします。その結果、結論は組織のどの部分を分析によってバイアスすることができます。したがって全体の脂肪組織における分子・細胞パターンの包括的三次元視覚化を許可する技術、裏打ちクリアをクリア脂肪組織を開発しました。裏打ちクリア iDISCO から適応された/iDISCO + は、特定の変更に対するネイティブの組織形態を維持しながら、組織に格納されている脂質を完全に削除します。光シート蛍光顕微鏡と組み合わせて、ここで全体の脂肪組織の高分解能の 3次元濃淡画像の取得に裏打ちクリア メソッドを使用を示します。

概要

最近まで、脂肪組織は、脂肪細胞の非晶質のコレクションとしての考案されました。過去数十年間は、我々 の理解は脂肪の脂肪細胞と脂肪細胞の前駆物質の種類、免疫細胞、線維芽細胞、血管、および神経投射を含む複雑な器官であると認め今より洗練されたきました。これらの居住者の脂肪細胞間の相互作用は、脂肪組織と個体の生理学と病態生理学¹に及ぼす影響を発音しています。新興の研究は、特定の相互作用の基礎となる重要な分子メカニズムを解明している、信頼性の高い構造プロファイリング 3 次元 (3 D) で全体の組織のより包括的な理解が必要です。

脂肪組織の形態の私達の現在の知識は薄いセクション (5 μ m) を比較的高倍率 (10 倍以上) の組織学的分析に基づいて^2,3。ただし、この方法には、いくつかの重要な制限があります。交感神経や血管、脂肪関数^4,5,6,7で重要な役割を再生する知られているなどまず、複雑な糸状構造が評価することは困難薄いセクションで。第二に、その一見アモルファス形状とに集中する代表的な構造の単位の不足、セクション染色のみに基づいて脂肪組織構造を理解することは困難です。第三に、脂肪組織が 3 D 解剖学的再建、従来の全脳形態⁸を研究するために使用に適した一貫性のある連続切片を得ることに課題を作成する、非常に高い脂質含量です。これらの要因を考えると、携帯電話の解像度を実現しながら全体の脂肪デポの 3次元可視化を提供することができますマウント全体アプローチのための大きい必要性があります。

臓器全体の体積の 3 D イメージングによる光の拡散効果のあいまいに挑戦しています。生体内光散乱の主な原因は、脂質水溶液の界面から来ています。脂質を除去することによって散乱を除去するために努力は、世紀以上にわたっての継続されていますが、最近の技術革新の⁹の数が多いがありました。そのような新しく開発された組織のクリア メソッドは溶媒消去臓器の反応が有効な 3 D イメージング (iDISCO/iDISCO +)^10,11。ただし、脂肪組織が脂質の高レベルを与えられた特定の課題を提示し、したがって、iDISCO に修正を加える/iDISCO + プロトコルは完全に崩壊から組織を保護しながら脂質を抽出するために必要な。裏打ち-クリアと呼ばれる、開発した修正されたプロトコルでは、高分解能体積画像¹²に適した最適な透明度を達成するために脂肪の脱脂をメタノール/ジクロロ メタン ベースを採用しています。脱脂は、GFP や RFP など主として内生表現渇き蛍光タンパク質ステップので、そのようなタンパク質の可視化は、反応によって達成されなければなりません。全体的にみて、このシンプルで堅牢なプロトコルは居住者の脂肪細胞の組織レベルの組織を研究に適用できる脂肪細胞の前駆細胞と脂肪の形態の開発中にトレースする血統。

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プロトコル

動物の世話や実験は動物介護の施設およびロックフェラー大学の使用委員会によって承認された手続きに従って行われました。

1. ティッシュの準備

1. 血液が組織から完全に削除されるまでは、4 ° C でリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 〜 20 ml 標準心内血流を実行します。
2. 首と尾が大幅補強まで固定液 (1 × PBS で 4% パラホルムアルデヒド (PFA)) 4 ° c の ~ 20 mL に、出納を切り替えます。
   注意: PFA は有毒です。皮膚、目、粘膜との接触を避けます。ヒューム フード内ソリューションで行われる必要があります。
3. 慎重にそれを損なうことがなく全体の脂肪パッドを削除する興味の脂肪パッドを解剖します。摘心や組織の圧迫を避けるために鈍終了鉗子を使用します。任意の毛皮と切り裂かれたティッシュが汚れない。
4. 後 4% PFA 1x PBS では 4 ° C で一晩で組織を修正します。それぞれの脂肪パッド 〜 10 ml の 15 mL の円錐管に固定の解決の修正後。
5. 常温 (RT) 組織 1 × PBS に 3 回 (1 h) を洗います。
6. 4 ° C で 1 × PBS で短期 (2 週間まで) の組織を保存し、光から保護されています。長期的なストレージ (例えば1-2 年)、(防腐剤) として 0.05% アジ化ナトリウムと 1x PBS にバッファーを切り替えます。
   注意: アジ化ナトリウムは経口摂取したり、皮膚から吸収されると非常に有毒です。アジ化ナトリウム (5% 以上) のソリューションは、ヒューム フードの下処理必要がありますに集中しました。

2. 脱脂・透過

タイミング: 1-2 日

1. 20%、40%、60%、80% メタノール グラデーション B1n バッファー (表 1) (v/v)、例えば20% メタノール/B1n のバッファーを用意し、メタノール 20 mL、80 mL の B1n バッファーをミックスします。4 ° C ですべてのバッファーを保存します。グリシン結晶を飽和のための 60% と 80% のメタノール/B1n バッファーから沈殿させます。結晶; を削除しないように次の洗浄溶液を使用します。
   注意: メタノールは揮発性、刺激性、可燃性です。皮膚や眼との接触を避けます。
2. 優しく解剖顕微鏡の下でサンプルから髪を削除します。毛や糸くず、破片のサンプルに添付画像の中に影を引き起こすが。新しい管に洗浄のサンプルを転送します。
3. 特に明記しない限り、次のすべての手順を氷の上または 4 ° C で実行します。(例えば、若い無駄のないマウスから後部の perigonadal/皮下脂肪パッド) の小さいサンプル ソリューションの 1.6 ml 2 mL 遠心管を使用します。大規模なサンプルや高脂質のコンテンツ (例えば、肥満マウスの脂肪パッド) とサンプル溶液 4 mL と 5 mL の管を使用します。
   1. 設定軌道シェーカーに水平にサンプルを含むチューブを配置 ~ 100 rpm。チューブ内のサンプルが自由に移動できることを確認します。
4. 指定された時間 (表 2) の 20%、40%、60%、80%、100% のメタノール/B1n バッファーの傾斜シリーズのサンプルを脱水します。キャリー オーバー ソリューションを最小限に抑えます。
5. Delipidate 100% ジクロロ メタン (DCM) でサンプル (3 回)、インキュベーション時間をそれぞれ表 2に示されています。サンプルは、2 番目と 3 番目の DCM 洗浄の端に管の底に沈む必要があります。そうでない場合は完全脱脂を確実にインキュベーション時間を延長 (例えば1-2 h を 30 分延長)。
   注意: DCM は、ヒューム フード内部処理必要があります。ガラス容器を使用して、ストレージと遠心チューブの孵化用ポリプロピレンから作られています。マイクロ遠心チューブ用は、DCM の長期保管に使用しないでください。ペトリ皿とポリスチレンから作られた血清ピペットは DCM と互換性がありません。DCM は、揮発性の高い。乾燥を防ぐために迅速に新鮮なソリューションには、サンプルを転送します。
6. 指定された時間 (表 2) の 100% メタノールで二回洗います。
7. オプション: サンプルをよく灌流できない場合は、残りの赤血球からヘモグロビンの色可能性があります蛍光が強い。4 ° C で一晩メタノール (メタノールの 5 冊を 30% H₂O₂の 1 巻) で 5% H₂O₂でブリーチします。
8. 逆メタノール/B1n バッファー シリーズのサンプルを水分補給: 80%、60%、40%、20% メタノール/B1n、100 %b1n バッファー (2 回) に示されている (表 2)。
9. 室温 2 時間 PTxwH バッファー (表 1) とサンプルを洗う
10. 4 ° c (最大 1 年間) PTxwH バッファーに脱脂サンプルを格納またはすぐに染色手順に進みます。

3. 全体のマウント免疫染色

タイミング: 8-10 日

注: 次の手順のすべて行なう RT で揺れ光からの保護と明記しない限り。小さいサンプル 1.6 mL の溶液を 2 mL 遠心管を使用します。大規模なサンプル溶液 4 mL と 5 mL の管を使用します。組織またはメタノール処理ティッシュ セクションの小さな断片の抗体は、まず検証することをお勧めします。

1. PTxwH バッファー推奨濃度に一次抗体を希釈します。導入の抗体の沈着物や集計を防ぐために 10 分間 ~ 20,000 × g で希釈した抗体溶液を遠心します。
2. 第一抗体溶解液で脱脂サンプルを指定の時刻 (表 2) にインキュベートします。
3. 一連のインキュベーション手順 PTxwH バッファーのサンプルを洗う: 5 分、10 分、15 分、20 分、1 h、2 h、4 h、一晩。
4. 推奨濃度 PTxwH バッファー内の二次抗体を希釈します。導入の抗体の沈着物や集計を防ぐために 10 分間 ~ 20,000 × gで希釈した抗体溶液を遠心します。
   注: 組織の自家蛍光による高いバック グラウンドを避けるためには、赤、赤外領域の光を発する fluorophores が付いている二次抗体が推奨されます。レーザー顕微鏡の利用可能な回線数に応じて 3-4 マーカーまでを 1 つのサンプルで同時にイメージすることができます。
5. 二次抗体溶液とサンプルを指定の時刻 (表 2) にインキュベートします。
6. インキュベーション手順のシリーズに PTxwH を洗ってサンプル: 5 分、10 分、15 分、20 分、1 h、2 h、4 h、一晩。
7. オプション: 壊れやすい、組織タイプの 4% PFA 1x PBS で一晩組織形態を保持するために 4 ° c でのステンド グラスの組織を固定します。
   注: この手順では、画像の背景が増加します。脂肪組織に対してこの手順を実行する必要はありません。
8. 一連のインキュベーション手順 1 × PBS でサンプルを洗う: 5 分、10 分、30 分。
9. 解剖顕微鏡の下でサンプルから糸くずを注意深く取り外します。

4. 組織クリア

タイミング: 1-2 日

1. オプション: 光シート顕微鏡のサンプル実装を容易にするために agarose のサンプルを埋め込みます。
   注意: この手順がイメージング中にその形状を安定させるために脂肪組織を強く推奨します。
   1. 1x PBS (w/v) の 1% の agarose が付いて埋め込みソリューションを準備します。埋め込みソリューションのクールな 〜 過度の熱にサンプルを公開することを避けるために 40 ° C。
   2. (例えばペトリ皿、ボートの重量を量る) 金型に洗浄のサンプルを置き、目的の位置に配置します。任意の液体の持ち越しを避けてください。埋め込みソリューションをサンプルにそっと注ぐ。空気の泡を避けるため。
   3. サンプルを含むブロックを右カットで完全に固めるアガロースをしましょう。
      注: すべて夜通し孵化を含む次の手順する必要があります実施常温では、揺れと光からの保護。小さいサンプル 1.6 mL の溶液を 2 mL 遠心管を使用します。大規模なサンプル溶液 4 mL と 5 mL の管を使用します。
2. 指定された時間 (表 2) H₂o: 25%、50%、75%、100% (3 回) とメタノール グラデーションのサンプルを脱水します。
   注: サンプルは、100% メタノールのステップで一晩左することができます。
3. 振動 (3 回) で 1 時間 100 %dcm でサンプルをインキュベートします。サンプルは、各 DCM の洗浄の最後に管の底に沈む必要があります。されていない場合は、メタノールの完全除去を確保するインキュベーション時間を延長します。サンプルは 100 %dcm ステップで一晩します。
4. 屈折率整合を達成するために穏やかな揺れで一晩ジベンジル エーテル (DBE) にサンプルをインキュベートします。
   注: サンプルは透明可視光になります。
   注意: DBE は危険です。皮膚との接触を避けてください。二重の手袋で発煙のフードの中それを処理します。それが DBE で汚染されているとすぐに手袋を破棄します。・遠心チューブ (ポリプロピレン) の孵化のためのガラス容器を使用します。マイクロ遠心チューブ用は DBE の長期保管に使用しないでください。ペトリ皿とポリスチレンから作られた血清ピペットは DBE と互換性がありません。100% エタノールと任意の流出をクリーンアップします。
5. 軽度の揺れ 2 h. ストアの暗闇の中で常温サンプル新鮮な DBE でサンプルをインキュベートか画像に直接進みます。
   注: サンプルは、一ヶ月内でイメージを作成する推奨されます。特定 fluorophores が付いている他のものより安定して、この段階でサンプルの長期保存はお勧めできません。

5. 顕微鏡

1. DBE と互換性のある光シート顕微鏡とイメージング。
   注: 有機溶剤ベースのイメージングのために承認され、DBE の屈折と一致する唯一の目的は、イメージングの DBE 浸漬の目的を浸漬として使用できます。
   1. イメージ投射の間の動きを防ぐことができますホルダーに agarose 埋め込まれたサンプルをマウントします。DBE で満たされた室に試料を浸します。
   2. Z スタックの (例えば1-2 X 倍率) 全体組織分布/構造の興味のマーカーを取得するサンプル全体をカバーを収集します。
   3. (例えば4-12 倍の倍率) 詳細な構造を画像に関心の領域を拡大する高倍率で客観的に切り替えます。
      注: コラーゲンはすべて脂肪細胞¹³を囲む脂肪組織の細胞外マトリックスへの主要コントリビューターであります。コラーゲンは約 400 に至るまで典型的な発光スペクトル 550 nm¹⁴nm。イメージング (緑) 488 レーザー ラインでサンプルとコラーゲン (例えば、525 550 nm) の発光スペクトルの中にある波長範囲で発光を収集は以前に示された組織の自家蛍光信号を提供します。脂肪細胞の輪郭と全体的な組織アーキテクチャ¹²を描きます。
2. 逆に共焦点イメージングまたは 2 光子顕微鏡。
   1. すべてのプラスチック部品 (またはシールすることができます他の DBE 互換イメージング室) に触れることがなくガラス底のチェンバー スライドに agarose 埋め込まれたサンプルを配置します。DBE が漏れないことを確認します。
   2. 長距離より深い浸透を達成するために作業の目的を選択します。
      注: 画像はチェンバー スライドのガラス底を通って倒立共焦点または 2 光子顕微鏡とされるべきであります。サンプルと DBE ベースのイメージングのための提案は、目標を浸漬との直接接触を避けます。

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結果

裏打ちクリア準備全体の脂肪パッドの細く、肥満の州の組織形態や細胞間相互作用の影響を分析する 3 D でイメージを作成することができます。このメソッドは、緑のチャネルで組織の自家蛍光信号を集めることによって脂肪の一般的な構造を分析する簡単に適用できます。我々 は以前に、自発蛍光染色、成熟脂肪細胞¹²をアウトラインに一般的に?...

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ディスカッション

裏打ちクリアは正規のラボ環境のセットアップで簡単に行うことができる脂肪をクリアするための簡単かつ堅牢なメソッド。IDISCO など他の溶剤ベースの清算方法と比較して/iDISCO +^10、11,12、裏打ちクリア、特に脂肪組織と他の組織と高脂肪の内容をクリアに最適化されています。脱脂ステップ脂肪から脂質を完全に削除し?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-1KG
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287-500ML
Heparin	Sigma Aldrich	H3393-100KU
Dichloromethane	Sigma Aldrich	270991
Hydrogen peroxide 30%	Fisher Scientific	325-100
Benzyl ether	Sigma Aldrich	108014
Agarose	Invitrogen	16500500
Sodium azide	Sigma Aldrich	71289-5G
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase	Millipore	AB152	1:200 dilution
Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1	R&D Systems	AF3628	Final concentration of 2 µg/mL
Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11	Bio-Rad	MCA1957	Final concentration of 2 µg/mL
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153	Final concentration of 5-10 µg/mL
Imaging chamber	ibidi	80287
Light sheet microscope	LaVision BioTec	Ultramicroscope II
Imaging software	LaVision BioTec	Imspector software
Microscopy visualization software	Bitplane	Imaris