Adipo-Clear: Um método de compensação por imagem tridimensional do tecido adiposo tecido

Resumo

Devido ao alto teor lipídico, o tecido adiposo tem sido desafiador para visualizar usando métodos histológicos de tradicionais. Adipo-Clear é um tecido de limpeza técnica que permite que a rotulagem robusto e alta resolução imagem fluorescente volumétrica do tecido adiposo. Aqui, descrevemos os métodos para a preparação da amostra, pré-tratamento, coloração, limpeza e montagem para a imagem latente.

Resumo

Tecido adiposo desempenha um papel central na homeostase de energia e termorregulação. Ele é composto de diferentes tipos de adipócitos, bem como precursores dos adipócitos, células do sistema imunológico, fibroblastos, vasos sanguíneos e projeções de nervo. Embora o controle molecular da especificação do tipo de célula e como interagem estas células foram delineados cada vez mais, uma compreensão mais abrangente destas células adiposo-residente pode ser alcançada através da visualização de sua distribuição e arquitetura em todo o tecido todo. As abordagens existentes de imuno-histoquímica e imunofluorescência para analisar histologia tecido adiposa dependem de seções finas de parafina. No entanto, seções finas captura apenas uma pequena porção de tecido; Como resultado, as conclusões podem ser influenciadas por qual parte do tecido é analisada. Portanto, nós desenvolvemos um tecido adiposo, limpeza técnica, Adipo-Clear, para permitir a completa visualização tridimensional de padrões moleculares e celulares nos tecidos adiposos. Adipo-Clear foi adaptado de iDISCO / iDISCO +, com modificações específicas feitas para remover completamente os lipídios armazenados no tecido, preservando a morfologia do tecido nativo. Em combinação com microscopia de fluorescência de luz-folha, vamos mostrar aqui o uso de Adipo-Clear método para obter imagens de alta resolução volumétricas, de um tecido adiposo inteira.

Introdução

Até recentemente, tecido adiposo foi concebido como uma coleção amorfa de células de gordura. Ao longo das últimas décadas, nosso entendimento tem crescido mais sofisticado, com gordura agora reconhecida para ser um órgão complexo que contém diferentes tipos de adipócitos, bem como precursores dos adipócitos, células do sistema imunológico, fibroblastos, a vasculatura e projeções de nervo. Interações entre estas células adiposo-residente tem pronunciado efeitos no tecido adiposo e a fisiologia e fisiopatologia¹. Embora estudos emergentes têm desvendados importantes mecanismos moleculares subjacentes a certas interações, uma compreensão mais abrangente requer perfil estrutural confiável do tecido inteiro em três dimensões (3D).

Nosso conhecimento atual da morfologia do tecido adiposo é amplamente baseado na análise histológica de seções finas (5 μm), com imagens relativamente alta ampliação (mais de 10 X)^2,3. No entanto, esta abordagem tem várias limitações significativas. Primeiras, intricadas estruturas filamentosas como nervos simpáticos e a vascularização, que são conhecidas por desempenhar um papel importante na função do tecido adiposo^4,5,6,7, são difíceis de avaliar através de seções finas. Em segundo lugar, devido à sua forma aparentemente amorfa e a falta de unidades estruturais representativas para focar, é difícil apreciar o tecido adiposo estruturas baseadas apenas na coloração de seção. Em terceiro lugar, o tecido adiposo tem um muito alto teor lipídico, criando desafios na obtenção de secções seriais consistentes que são adequadas para a reconstrução anatômica 3D, um método convencional usado para estudar o cérebro inteiro morfologia⁸. Tendo em conta estes factores, há uma grande necessidade de uma abordagem de conjunto de montagem que pode fornecer a visualização 3D de um depósito de tecido adiposo inteira e ainda alcançar a resolução do celular.

Imagem em 3D volumétrica de um órgão inteiro é um desafio devido aos efeitos obscuring de dispersão de luz. Uma importante fonte de dispersão de luz no tecido biológico vem de interfaces lipid-aquosa. Apesar dos esforços para eliminar a dispersão através da remoção de lipídios foram em curso para mais de um século, tem havido um grande número de recentes inovações⁹. Um tal método de limpeza de tecidos recém-desenvolvido é uma imagem de 3D habilitado para immunolabeling de órgãos solvente-desmarcada (iDISCO / iDISCO +)^10,11. No entanto, o tecido adiposo apresenta um desafio particular, dado o seu alto nível de lipídios e portanto, modificações adicionais para o iDISCO / iDISCO + protocolo são necessário para extrair totalmente os lipídios, protegendo o tecido de entrar em colapso. O protocolo modificado que desenvolvemos, agora chamado Adipo-Clear, emprega baseada em metanol/diclorometano delipidation do tecido adiposo para alcançar a transparência ideal apropriada para imagiologia volumétrica de alta resolução¹². Porque o delipidation passo largamente sacia endogenamente expressas proteínas fluorescentes como GFP e RFP, visualização de tais proteínas deve ser alcançada por immunolabeling. Em geral, este protocolo simples e robusto pode ser aplicado para estudar a organização nível de tecido adiposo-residente células, rastreamento de linhagem de células progenitoras de adipócitos e tecido adiposo morfogênese durante o desenvolvimento.

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Protocolo

Experimentação e cuidados com animais foram realizadas de acordo com procedimentos aprovados pelo Comitê de uso na Universidade Rockefeller e cuidados institucionais do Animal.

1. tecido preparação

1. Execute padrão perfusão intracardíaca com ~ 20 mL de 1x solução salina tamponada fosfato (PBS) a 4 ° C até que o sangue é completamente removido do tecido.
2. Alterne o perfusato para ~ 20 mL da solução de fixador (paraformaldeído 4% (PFA) em PBS 1x) a 4 ° C até o pescoço e a cauda significativamente foi uma brincadeira.
   Atenção: O PFA é tóxico. Evite o contacto com a pele, olhos e mucosas. Soluções devem ser feitas dentro de uma coifa.
3. Disse as almofadas de gordura de interesse cuidadosamente para retirar o forro de gordura todo sem danificá-lo. Use fórceps sem corte-terminado para evitar comprimir ou apertar o tecido. Evite a contaminação do tecido dissecado com qualquer pele.
4. Fixar o tecido em 4% PFA em 1X PBS durante a noite a 4 ° C. Para cada almofada gorda, fixe com ~ 10 mL da solução de fixação em um tubo cônico de 15 mL.
5. Lave o tecido 3 vezes (1h cada) com PBS 1x à temperatura ambiente (RT).
6. Armazenar o tecido para a curto prazo (até 2 semanas) em PBS 1x a 4 ° C e protegido da luz. Para armazenamento a longo prazo (por exemplo, 1-2 anos), alterne o buffer para 1X PBS com 0,05% de azida sódica (como conservante).
   Atenção: A azida de sódio é altamente tóxica quando ingerido oralmente ou absorvido pela pele. Concentrado de soluções (em 5% ou maior) devem ser tratadas sob uma coifa de azida de sódio.

2. Delipidation e permeabilização

Tempo: 1-2 dias

1. Prepare-se 20%, 40%, 60% e 80% gradiente de metanol com B1n buffer (tabela 1) (v/v), por exemplo, para reserva de 20% de metanol/B1n, misture 20 mL de metanol e 80 mL de tampão de B1n. Armazenar todos os buffers a 4 ° C. Cristais de glicina irão precipitar de buffers de metanol/B1n 60% e 80% devido à saturação. Evite remover os cristais; Use a solução líquida para as lavagens seguintes.
   Atenção: O metanol é volátil, irritantes e inflamáveis. Evite a pele ou olhos.
2. Remova cuidadosamente o cabelo da amostra sob um microscópio de dissecação. Qualquer cabelo, fiapos ou detritos anexado à amostra causará sombras durante a imagem latente. Transferi a amostra limpa para um tubo novo.
3. Execute todas as etapas seguintes no gelo ou a 4 ° C a menos que indicado de outra forma. Para pequenas amostras (por exemplo, posteriores almofadas de gordura subcutânea/perigonadal de jovens ratos magras), utilizar 2 mL microcentrifuga tubos com 1,6 mL da solução. Para amostras grandes ou as amostras com alto teor lipídico (por exemplo, almofadas de gordura de ratos obesos), usar tubos de 5 mL com 4 mL de solução.
   1. Coloque os tubos contendo as amostras horizontalmente em um agitador orbital de ~ 100 rpm. Certifique-se que as amostras podem circular livremente no interior do tubo.
4. Desidrate a amostra em uma série graduada de 20%, 40%, 60%, 80% e 100% metanol/B1n buffer para a hora indicada (tabela 2). Minimize a solução de reporte.
5. Delipidate a amostra com o diclorometano (DCM) de 100% (3 vezes), cada um com o tempo de incubação indicado na tabela 2. A amostra deve afundar até o fundo do tubo no final das segunda e terceiros lavagens de DCM. Se não, estender o tempo de incubação para garantir delipidation completo (por exemplo, estender de 30 min a 1-2 h).
   Cuidado: DCM deve ser tratado dentro de uma coifa. Use recipientes de vidro para armazenamento e microcentrifuga tubos que são feitos de polipropileno para incubação do. Os tubos de microcentrifuga não devem ser utilizados para armazenamento a longo prazo do DCM. Placas de Petri e pipetas que são feitas de poliestireno não são compatíveis com DCM. DCM é altamente volátil. Transferi a amostra para solução fresca rapidamente para evitar a dessecação.
6. Lave duas vezes com 100% de metanol para a hora indicada (tabela 2).
7. Opcional: Se a amostra não é bem perfundida, a cor da hemoglobina das células vermelhas do sangue restantes pode causar forte autofluorescência. Descorar com 5% H₂O₂ em metanol (1 volume de 30% H₂O₂ a 5 volumes de metanol) durante a noite a 4 ° C.
8. Reidratar a amostra em uma série de amortecedor invertido metanol/B1n: 80%, 60%, 40%, 20% metanol/B1n e 100% B1n tampão (2 vezes) para a hora indicada (tabela 2).
9. Lavar a amostra com buffer de PTxwH (tabela 1) para 2 h em RT
10. Armazenar a amostra de deslipemizado no buffer de PTxwH a 4° C (até 1 ano) ou proceder de imediato à etapa de imunocoloração.

3. toda montagem imunocoloração

Tempo: 8-10 dias

Nota: Todas as etapas a seguintes devem ser efectuadas em RT salvo indicação em contrário, com a agitação e a proteção da luz. Para pequenas amostras, use 2 mL microcentrifuge tubos com 1,6 mL de solução. Para amostras grandes, use tubos de 5 mL com 4 mL de solução. Recomenda-se primeiro validar os anticorpos em pequenos pedaços de tecido ou secções de tecido Tratado de metanol.

1. Dilua o anticorpo primário no buffer de PTxwH, na concentração recomendada. Centrifugue a solução diluída de anticorpo em ~ 20.000 x g durante 10 minutos evitar a introdução de anticorpo precipitados ou agregações.
2. Incube a amostra deslipemizado com a solução de anticorpo primário durante o tempo indicado (tabela 2).
3. Lavar a amostra com buffer de PTxwH em uma série de etapas de incubação: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1h, 2h, 4h e durante a noite.
4. Dilua o anticorpo secundário no buffer de PTxwH, na concentração recomendada. Centrifugue a solução diluída de anticorpo em ~ 20.000 x g durante 10 minutos evitar a introdução de anticorpo precipitados ou agregações.
   Nota: Para evitar o fundo elevado causado por tecido autofluorescência, anticorpos secundarios conjugados com fluorophores que emitem luz nas regiões do vermelhas e far-red são recomendados. Dependendo do número de linhas de laser disponíveis em um microscópio, até 3-4 marcadores pode ser fotografada simultaneamente em uma amostra.
5. Incube a amostra com a solução de anticorpo secundário durante o tempo indicado (tabela 2).
6. Amostra de lavagem com buffer de PTxwH em uma série de etapas de incubação: 5 min, 10 min, 15 min, 20 min, 1h, 2h, 4h e durante a noite.
7. Opcional: Para tipos de tecido que são frágeis, fixe o tecido manchado com 4% PFA em 1X PBS durante a noite a 4 ° C, para ajudar a preservar a morfologia do tecido.
   Nota: Este passo pode aumentar a imagem de fundo. Não é necessário efectuar este passo para o tecido adiposo.
8. Lavar a amostra com PBS 1x em uma série de etapas de incubação: 5 min, 10 min e 30 min.
9. Remova cuidadosamente o fiapo da amostra sob um microscópio de dissecação.

4. tecido clareira

Tempo: 1-2 dias

1. Opcional: Incorpore a amostra em agarose para facilitar a montagem de amostra para microscopia de luz-folha.
   Nota: Este passo é fortemente recomendado para tecido adiposo estabilizar sua forma durante a imagem latente.
   1. Prepare a solução de encastre com agarose a 1% em 1X PBS (p/v). Esfriar a solução incorporação de ~ 40 ° C para evitar a exposição da amostra ao calor excessivo.
   2. Colocar a amostra limpa em um molde (por exemplo, placa de Petri ou barco de pesagem) e organizá-lo para a posição desejada. Evite qualquer transição líquida. Delicadamente, despeje a solução de incorporação da amostra. Evite quaisquer bolhas de ar.
   3. Deixe o agarose totalmente solidificar no RT. corte para fora de um bloco que contém a amostra.
      Nota: Todas as etapas seguintes, incluindo a incubação do durante a noite devem ser efectuadas RT, com agitação e proteção da luz. Para pequenas amostras, use 2 mL microcentrifuge tubos com 1,6 mL de solução. Para amostras grandes, use tubos de 5 mL com 4 mL de solução.
2. Desidrate a amostra em gradiente de metanol com H₂O: 25%, 50%, 75% e 100% (3 vezes) para a hora indicada (tabela 2).
   Nota: Amostra pode ser deixada durante a noite no passo metanol 100%.
3. Incube a amostra em 100% o DCM para 1 h com agitação (3 vezes). Amostra deve afundar até o fundo do tubo na extremidade de cada lavagem de DCM. Se não, estender o tempo de incubação para assegurar a remoção completa de metanol. Amostra pode ser deixada durante a noite no passo DCM 100%.
4. Incube a amostra em éter dibenzyl (DBE) durante a noite com agitação suave para alcançar o índice de refração de correspondência.
   Nota: Amostra vai eventualmente se tornar transparente à luz visível.
   Atenção: O DBE é perigosa. Evite qualquer contacto com a pele. Lidar com isso dentro de uma coifa com duas camadas de luvas. Descarte as luvas quando está contaminado com DBE. Use recipientes de vidro para armazenamento e microcentrifuga tubos (polipropileno) para incubação do. Os tubos de microcentrifuga não devem ser utilizados para armazenamento a longo prazo do DBE. Placas de Petri e pipetas que são feitas de poliestireno não são compatíveis com o DBE. Limpe qualquer vazamento com 100% de etanol.
5. Incubar a amostra com DBE fresco com leve agitação por 2 h. loja da amostra RT no escuro ou proceder diretamente à imagem.
   Nota: As amostras são recomendadas para ser fotografada dentro de um mês. Embora certas fluorophores são mais estáveis do que outros, armazenamento a longo prazo das amostras nesta fase não é recomendado.

5. microscopia

1. Imagem com um microscópio de luz-folha que é compatível com o DBE.
   Nota: Apenas os objetivos que são aprovados para geração de imagens baseada em solvente orgânica e combinados com o índice de refração do DBE podem ser usados como mergulhando objectivos em imagiologia DBE-imerso.
   1. Monte a amostra de agarose-encaixadas em um suporte que pode impedir o movimento durante a imagem latente. Imergir a amostra em uma câmara cheia de DBE.
   2. Recolha uma z-pilha cobrindo toda a amostra (por exemplo, ampliação de X 1-2) para obter a distribuição de todo tecido/estrutura do marcador de interesse.
   3. Alternar para um objectivo com maior ampliação (por exemplo, ampliação de 4-12 X) para ampliar as regiões de interesse para estruturas detalhadas da imagem.
      Nota: O colágeno é dos principais contribuintes para a matriz extracelular do tecido adiposo, que envolve todas as células de gordura¹³. Colagénio tem um espectro de emissão típico que variam de cerca de 400 nm a 550 nm¹⁴. Imagem da amostra com a linha de 488 laser (verde) e recolher a luz emitida em um intervalo de comprimento de onda que se encontra dentro do espectro de emissão de colágeno (por exemplo, 525-550 nm) irão fornecer o sinal de autofluorescência de tecido, que anteriormente foi mostrado para delinear o contorno da célula de gordura e de arquitetura de tecido geral¹².
2. Geração de imagens com uma invertida confocal ou um microscópio de dois fotões.
   1. Coloca a amostra de agarose-incorporado em um slide de câmara com um fundo de vidro sem tocar qualquer peças de plástico (ou outra câmara de imagem compatível com o DBE que pode selar). Certifique-se de que DBE não vazar.
   2. Escolha os objectivos com longas distâncias de trabalho para alcançar penetração mais profunda.
      Nota: A imagem deve ser feita com um microscópio confocal ou dois fotões invertido através do vidro de fundo do slide câmara. Evite o contato direto entre a amostra e mergulhando objectivos que não são sugeridos para geração de imagens baseada em DBE.

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Resultados

Adipo-Clear preparado toda gordura almofadas podem ser fotografadas em 3D para analisar como interações de morfologia e celular do tecido são afetadas nos Estados magros e obesos. Esse método pode ser facilmente aplicado para analisar a estrutura geral do tecido adiposa, recolhendo o sinal de autofluorescência de tecido no canal verde. Anteriormente mostramos que a autofluorescência sinal em sobreposições de tecido adiposas favoravelmente com perilipin de coloração, um marcador ...

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Discussão

Adipo-Clear é um método simples e robusto para limpar o tecido adiposo, que pode ser facilmente executado em uma configuração de laboratório normal. Em comparação com outros métodos de limpeza à base de solvente como iDISCO / iDISCO +^10,11,12, Adipo-Clear é especialmente otimizado para limpar o tecido adiposo e outros tecidos com alto teor de gordura. A etapa de delipidation remove completamente os lipídios do adiposo...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate buffered saline	Corning	21-040-CV
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148-1KG
Methanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100-500ML
Tween 20	Sigma Aldrich	P2287-500ML
Heparin	Sigma Aldrich	H3393-100KU
Dichloromethane	Sigma Aldrich	270991
Hydrogen peroxide 30%	Fisher Scientific	325-100
Benzyl ether	Sigma Aldrich	108014
Agarose	Invitrogen	16500500
Sodium azide	Sigma Aldrich	71289-5G
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
Rabbit polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase	Millipore	AB152	1:200 dilution
Goat polyclonal anti-CD31/PECAM-1	R&D Systems	AF3628	Final concentration of 2 µg/mL
Rat monoclonal anti-CD68, Clone FA-11	Bio-Rad	MCA1957	Final concentration of 2 µg/mL
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	711-605-152	Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11077	Final concentration of 5-10 µg/mL
Donkey anti-rat IgG (H+L) Alexa Fluor 647	Jackson ImmunoResearch	712-605-153	Final concentration of 5-10 µg/mL
Imaging chamber	ibidi	80287
Light sheet microscope	LaVision BioTec	Ultramicroscope II
Imaging software	LaVision BioTec	Imspector software
Microscopy visualization software	Bitplane	Imaris