子宮内膜症の異種マウスモデルで病巣の大きさの非侵襲的モニタリング

要約

ここでは、マウスに移植した蛍光に分類されたひと子宮内膜片のライブ イメージングのためのプロトコルを提案する.メソッドは、リアルタイムの蛍光レポーターによって放出される蛍光の定量化と監視によって子宮内膜症の病巣の大きさの選択の薬の影響を研究します。

要約

ここでは、子宮内膜症の進行を注入された異所性ひと子宮内膜組織によって放出される蛍光の非侵襲的モニタリングを通じてリアルタイムで評価される異種マウス モデルの実装のプロトコルについて述べる。このため、ひと子宮内膜の生検はドナー女性寄付継続的な卵から取得されます。ひと子宮内膜断片アデノ レポーター蛍光タンパク質 mCherry の cDNA を表現するために設計の前で培養されます。可視化、時に感染症はその後選ばれた受信者マウスに注入した後、蛍光の最適な速度と組織をラベル付けします。注入術前 1 週間は、受信者マウスが経時およびエストラジ オールのペレットは、生存と病変の成長を維持するために皮下配置されます。手術の日にマウスが麻酔をかけられたと腹膜キャビティ白線. (1.5 cm) の小さな切開を通してアクセス蛍光に分類されたインプラントが tweezed、簡単に接着剤に浸漬し、腹膜の層に接続されています。切開、縫合、動物と日のカップルのための回復します。臓インプラントによって放出される蛍光は通常非侵襲的インビボ イメージング システムと 4 週間毎の 3 日間が監視されます。臓インプラントのサイズの変化は、mCherry 信号と最大蛍光強度を示す初期の時点に対する正規化の数量化によるリアルタイムで推定できます。

子宮内膜症モデルの伝統的な臨床齧歯動物はリアルタイムで病変の非侵襲的モニタリングを許可しないが、むしろ終点で薬の効果の評価になります。このプロトコルは、リアルタイムで病変を追跡することができ、子宮内膜症モデルで臨床薬の治療の可能性を探索するより便利です。このように生成されたモデルの主な制限は、非侵襲的モニタリングが不可能である広告ウイルス episomal 式のための時間の長い期間にわたってです。

概要

子宮内膜症は、子宮腔外機能性子宮内膜の着床による慢性婦人科疾患です。異所性の病変は、成長し、慢性の骨盤の痛みや不妊症の¹につながる炎症性プロセスを誘発します。10-15% の生殖年齢の女性には受けないこと endometriosis2、推定されている、不妊女性³の約 40-50% であります。子宮内膜症の現在の薬理学的治療法は病変を完全に根絶することができないと副作用^4、5の自由ではないです。効率的な治療法の研究は人間の病変を適切にまねることができます、その化合物の他の中の病巣の大きさに及ぼす影響を密接に評価することができますこのような方法で子宮内膜症の既存の動物モデルの洗練が必要です。

打ち込むこと異所性病変の組織学的に同一と人間^6,7,8; のように似たようなサイトでは、子宮内膜症を模倣する霊長類モデルを使用されています。ただし、倫理的な問題や高度の経済コストに関連する制限の霊長類での実験の使用⁹。その結果、子宮内膜症の生体モデルの実施のため特に齧歯動物、小動物の使用は、個人^10,11の大きい数を用いる調査のためそれを支持する続けています。子宮内膜症によって誘導されうるこれらの動物の齧歯類子宮角 (「相同モデル」)^12,13の部分または異所性サイト (異種モデル) ヒトの子宮内膜・子宮内膜症組織を移植¹⁴.人間と対照をなして齧歯動物は自分の子宮内膜組織を流したか、それにより子宮内膜症が開発されない自発的にこれらの種の。したがって、子宮内膜症のモデルと異所性マウス子宮組織を注入したという事実のために批判されている同種のマウスはひと子宮内膜症病変¹⁵の特性を反映しません。

子宮内膜症の適切な生理は、子宮内膜症免疫不全動物に新鮮なひと子宮内膜の断片を注入する、異種モデルでまねることができます。異種従来終了点では、興味の化合物の治療効果一般的ノギス¹⁶を使って病巣の大きさの評価によって評価されます。明白な制限など、エンドポイント動物モデルは許可されている注入ダイナミクスや時間の経過とともに子宮内膜症病変を勉強します。追加の制限は、キャリパーの使用は、病巣の大きさの正確な測定を許可しないことです。確かに、キャリパーによって提供される標準誤差は、サイズが実際の変化を検出するこれらのツールの容量を制限する、マウスに注入病変の大きさと同じ範囲 (ミリメートルなど) でです。

このような制限を克服するためにここで、我々 は移植人体組織が記者 m 桜の蛍光蛋白質を表現する設計は子宮内膜症の異種マウス モデルの生成をについて説明します。適切なイメージを用いた蛍光信号の検出は、リアルタイムでそのサイズの同時定量と病変の状態を非侵襲的監視できます。したがって、我々 のモデルは、病巣の大きさでより客観的、バリエーションの正確な推定を実行するリアルタイムの非侵襲的モニタリングの機会と可能性をもたらす、エンドポイントの従来モデルと比較して明確な利点を提供します。

プロトコル

人体標本の使用は、制度検討委員会と病院ウニベルシタリオ La Fe の倫理委員会によって承認されました。すべての患者には、書面によるインフォームド コンセントが用意されています。動物を含む研究は、セントロ ・ デ ・ Investigacion プリンシペ フェリペ ・ デ ・ バレンシア ・機関の動物の世話委員会によって承認され、すべてのプロシージャを行った国立衛生研究所からケアと哺乳類の使用に関するガイドラインに従う健康。

1. 子宮内膜組織の採取と前処理

1. カニューレの吸引装置に接続されているを使用して人間の子宮内膜吸引の質の良い生検を取得します。生検を滅菌生理食塩水と穏やかな手動攪拌と洗浄を 10 mL の入ったフラスコに注ぐ。
   注:質の良い生検を取得する手順については、前述の¹⁷をされています。
2. 残っている血液や粘液の生検を洗います。組織がきれいに観察されるまで必要に応じてできるだけ多く歯新鮮な生理食塩水を含むフラスコにティッシュを注ぐことによって、プロセスを繰り返します。
3. 溶液 10 mL に健康的な外観を持つ転送生検フラグメントは、10% の胎仔ウシ血清 (FBS) と 1% の抗生物質抗真菌薬ソリューション ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) 培地を完了します。
4. コンテンツを 10 cm シャーレに入れて、組織を刻んでメスのペアと 5-10 mm³個セットに進みます。

2. 子宮内膜の断片のアデノ ウイルス トランスフェクション

注:プロセスで使用しているすべての材料は事前にボンネットの導入必要があります。すべてのプロセスで使用し、漂白剤とフラスコを配置するつもりはないことを取る。アデノ ウイルスのベクトルと接触するすべての材料は、バイオハザード容器にそれを破棄する前の漂白剤で消毒する必要があります。

1. 生検はみじん切りされている、新しいシャーレを取る。全体の料理全体に広がる複数の 30-50 μ l 添加 DMEM 滴をピペットします。彼らは接触に来ていないので滴間十分なスペースを残してください。
2. 注射器の針で助けられ、それぞれの媒体の滴内のフラグメントの単一のピースを配置します。
   注:各ドロップは、子宮内膜の単一部分を含める必要があります。
3. ソリューションを準備、広告 mCherry 作業 1:20 mCherry アデノ ウイルス原液 [1 x 10¹⁰ pfu/mL] の希釈することによって) DMEM に抗生物質 (DMEM + 10 %fbs をフィルター選択) なし中。
4. フラグメントがペトリ皿滴 (手順 2.2) で利用可能な多くの井戸を埋める 96 ウェル プレートのウェルあたり広告 mCherry ソリューションの 100-200 μ L を分注します。さらに、ネガティブ コントロールとしてアデノ ウイルス無料 DMEM 培地で少なくとも 3 井戸を埋めます。
5. 注射器の針で助けられ、96 ウェル プレートで広告 mCherry ソリューションを含む井戸のそれぞれに各シャーレ (手順 2.2) でフラグメントを転送します。
6. 16 時間で 5% CO₂と 37 ° C の定温器に広告 mCherry ソリューションと子宮内膜の断片を含む 96 ウェル プレートを配置します。
7. 残りのアデノ ウイルス完全 DMEM 培地に満ちて新しい 96 ウェル プレートに組織を転送することによって媒体のうち洗浄 (抗生物質・抗アデノ ウイルス無料) 24-48 h の 5% CO₂と 37 ° C の孵化と。
   注:すべてのウェル プレートとバイオハザード容器に捨てる前に広告ウイルスと接触したヒントを漂白剤でカバーしてください。
8. インキュベーターからプレートを取り出して 568 で蛍光顕微鏡下に置く最適なラベリングをテストする nm (赤のチャネル)。
9. 最も華麗なフラグメントを選択し、新鮮な完全 DMEM 培地と新しい 96 ウェル プレート (抗生物質・抗アデノ ウイルス無料)。
10. プラスチック パラフィン フィルム、プレート シールおよび受信者動物への子宮内膜の破片の注入の動物無料病原体の特定の領域にそれをトランスポートします。

3. 子宮内膜症マウス モデルの生成

注:6-8 週を使用して-古い無胸腺ヌード (または同様の免疫系統) 受信者の動物として、特定の病原体-無料条件で雌マウス。ホルモンの周期依存性変動と同時にエストラジ オールと燃料病変の成長を避けるためには、動物、17 βeta-エストラジ オール (17 E₂) の 18 mg を含む卵巣摘出とで配置されて 60 日リリース カプセルです。卵巣とペレットの配置は、受信者の動物に子宮内膜の断片を移植の前に、少なくとも 1 週間実行する必要。

1. 卵巣摘出術
   注:フードで手術滅菌材料を準備します。麻酔機器や手術後の回復ゾーンを同じ部屋で準備を準備します。
   1. マウスあたり 5 mg/kg の用量でモルヒネ誘導体の皮下注射を行います。マウスの鎮痛剤として薬の効果が顕れてくるので注入後 30 分の残りの部分を聞かせてください。
   2. シール麻酔室に吸入麻酔装置と酸素とイソフルラン (2 %mg/kg) 流れ、数分間を接続します。
   3. イソフルラン麻酔室に動物をご紹介します。3-5 分待つし、動物が前足のいずれかを押すことによって完全に麻酔をチェックしてください。手術領域に動物を転送および呼吸気道を覆うイソフルラン麻酔ガスの連続的な流れでマスクを配置することによって麻酔を維持します。
   4. クロルヘキシジンを使用して領域を消毒した後に、鋭いハサミで股関節の高さで約横 0.5 cm の肋切開を実行します。
   5. 腹腔内へのアクセスを取得し、卵巣を囲む白い脂肪パッドを識別解剖鉗子で卵巣を撤回筋から皮膚を分離します。
   6. 吸収性縫合糸で卵管の周り結び目を卵巣を切除する前に適切な止血を確認して締めます。
   7. 6-0 吸収性縫合糸で筋層を終了し、6-0 の非吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。消毒液で再び領域をクリーンアップします。
   8. 反対側の卵巣を削除する手順を繰り返します。
2. エストラジ オール ペレット インプラント
   注:この時点でペレットを配置する卵巣摘出手術中に麻酔をかけられ、動物、世話をします。
   1. 卵巣摘出術の手順の完了後すぐに首の周囲の消毒液で皮膚をきれいし、うなじに鋭いハサミで横皮下小 (0.5 cm) 切開を行います。
   2. はさみを使用すると、ペレットを配置するのに十分な大きさのポケットを作る筋肉から肌を分析します。
   3. 17 β-E₂の 18 mg を含有ペレットを挿入し、6-0 の非吸収性縫合糸で皮膚を縫合します。消毒液で再び領域をクリーンアップします。
   4. 回復ゾーンの動物を置き、長期的な回復期間を緩和する鎮痛の至適投与量を管理します。
3. 子宮内膜のインプラント手術
   注:少なくとも子宮内膜片移植手術を開始する前に卵巣摘出術後後の動物の完全な回復を許可するように 7 日間の検疫期間を許可します。組織のラベリングに最適な同期は、生検植の長期培養を避けるために移植手術の前に 2-3 日を収集します。
   1. 特定病原体フリー ゾーンで手術室の準備を事前に。またすべての必要な手術材料、麻酔機器や手術後の回復ゾーンとフードを準備します。
   2. 部屋に動物をもたらす、各マウスに 5 mg/kg の用量でモルヒネ誘導体の皮下注射を行います。マウス薬の鎮痛薬の効果が明らかにすることができますので注入後 30 分の残りの部分を聞かせてください。
   3. シール麻酔室に吸入麻酔装置と酸素とイソフルラン (2 %mg/kg) 流れ、数分間を接続します。
   4. 手術を開始する前に蛍光を有する板、ボンネットに (ステップ 2.10) からのフラグメントをラベルそれを開封し、フラグメントを扱いやすくするためのシャーレに注ぎを移動します。
   5. イソフルラン麻酔室に動物をご紹介します。3-5 分待つし、動物が前足のいずれかを押すことによって完全に麻酔をチェックしてください。手術領域に動物を転送および呼吸気道を覆うイソフルラン麻酔ガスの連続的な流れでマスクを配置することによって麻酔を維持します。
   6. 麻酔下の動物の場所が立ち向かいます。腹側領域を消毒します。鋭いハサミで腹部に縦 1.5 cm の切開を行うし、筋肉から皮膚を分離します。その後、腹腔内にアクセスする筋縦 1.5 cm の切開を実行します。
   7. ミニ鉗子で腹部の筋肉の壁の左端を押しながら外側に腹膜の内側の面を公開しようとすると、それを折る。
   8. ミニ ピンセットで子宮内膜のインプラントを取る、簡単に n ブチル シアノアクリ レート系接着剤に浸すし、腹膜に配置、それは接続を取得します。数秒で乾燥させます。3.3.6 と 3.3.7 腹膜の側にインプラントを配置する手順を繰り返します。
   9. 6-0 吸収性縫合糸で筋層を閉じるし、6-0 縫合糸と非吸収性皮膚を閉じます。消毒液で再び領域をクリーンアップします。
   10. 回復ゾーンの動物を置き、長期的な鎮痛の至適投与量を管理します。

4. の In Vivo イメージング システムと生体内蛍光イメージング

1. インビボ イメージング システム デバイスをオンに、プログラムを初期化し、数分の冷却 CCD カメラを許可します。
2. 吸入麻酔装置を準備します。イソフルラン麻酔チャンバーに分のカップルのための 2% 流れを開きます。後麻酔回復ゾーンを準備します。
3. プログラムが開始され、CCD カメラが冷えてきた後は、イメージング ウィザードツールをクリックして: チュートリアルから始まる一連の連続したウィンドウ表示、各 1 つのいくつかの関心のパラメーターに対応するオプションを選択する利用可能対応するボックスをクリックします。各ウィンドウで適切なボックスを選択してチュートリアルに進むし、パラメーター、次の一連の次のセットに移動する[ok]ボタンをクリックします。
   1. 蛍光パラメーターのEpiluminescence ボックスをオン、フィルターのペアのパラメーターにmCherry ボックスをオンにします。写真モードとフォーカスの確認ボックスを確認、露出パラメーターの自動ボックスを選択します。
4. 楽器が設定されている一度麻酔チャンバー内 1 匹の動物を移動します。完全に麻酔したとき、生体内でイメージ投射システム ケージの中の動物を転送、麻酔器に接続して尿細管中の頭側を上に置きます。蓋を閉めるし、監視の [取得] をクリックします。
5. (合計 5 枚の画像、選択フィルターのペアごとに 1 つのイメージ) を表示される画像を取得し、名前を付けて保存] をクリックしてデータを保存します。後麻酔回復の領域にマウスを移動します。残りの動物とプロセスを繰り返します。
6. 2 つの監視を繰り返す、または時間経過中に適切にフォロー アップ信号を週に 3 回します。
7. CO₂窒息によって時間のコースの終わりに動物を犠牲に進みます。

5.体内蛍光画像の定量化

1. 実際の蛍光画像の分離を介しての分離:
   1. In Vivoイメージング解析結合ソフトウェア プログラムを開きます。
   2. 分析を開始する"Sequenceinfo"ファイルを選択します。2 つのウィンドウが表示されます:「シーケンス ビュー」と「ツール パレット」。ツール パレットを選択し、メニューが表示された後は、次のオプションを選択します。
   3. 修正を選択し、適応フロリダ背景差分の発光画像データから望ましくない蛍光信号を削除するボックスをクリックします。最大の関心のしきい値を選択し、設定をクリックします。
   4. スペクトル Unmixingをクリックして、関心の分離 (ライブラリ、ガイド付き、自動または手動) を選択する方法の波長を選択し、開始 Unmixをクリックします。
   5. MCherry 信号に対応するUnmixed画像を選択し、ダブルクリックします。新しいウィンドウは、目的の信号の最終的なイメージが表示されます。
   6. 5.1.3 のステップを繰り返します。
   7. オプション: unmix 結果の代表的なイメージ (JPEG) が必要な場合は、ツール パレットで目的の設定を選択します |。画像の調整(カラーテーブル、ビニング、コントラストなど).、しエクスポート グラフィックを unmix ウィンドウで現在のイメージ ビューをイメージとしてエクスポートするをクリックします。
   8. 混じり気のないファイルを保存:ファイル |付けて保存 |フォルダーを選択 、[ok]。
   9. 監視の日の残りの部分とすべての動物とプロセスを繰り返します。
2. Roi を設定し、信号の定量化
   1. 参照] をクリックし、混じり気のないファイルを選択 (ステップ 5.1.8 を参照) 分析する興味の。新しいウィンドウが表示されます。
   2. 異なる時点でそれぞれの動物から混じり気のないすべてのファイルをインクルードし、ロードとして A グループのクリックする一覧に追加をクリックします。すべての画像はする必要があります 1 つのシーケンスとして表示されます。
   3. ツール パレットのウィンドウに行く: 同じ規模ですべてのイメージを取得する個々のスケール ボックスをオフ クリックします。
   4. シーケンスの 1 つの画像をダブルクリックし、次のシーケンスを使用して興味のゾーンに投資収益率を作成します。ROI ツールに行くとコントゥールと自動 1オプションを選択、表示される円の図形をクリックして、蛍光信号を中心に置き、表示されているウィンドウの作成をクリックします。
      注: これは自動的にバック グラウンド値 (すなわち, 病変) の上の蛍光の強度を持つピクセルを強調表示、アウトライン表示のピクセルを包含する領域を持つ図形を生成します。
   5. 作成した ROI の図形をコピーして貼り付けるバック グラウンド ゾーンに信号がないです。
   6. メジャー ・ ロワをクリックして |[すべての蛍光強度の値を表示します。マウスでデータ値を選択、右クリック、コピーを押して、スプレッドシートに貼り付けるに進みます。

6. データ (蛍光信号) の正規化

1. 信号強度は最大最初の時間ポイントを選択します。数式を使用して時間の各ポイントで信号の正規化に進みます。
   信号強度の時間の各ポイントで最大の信号強度が経過中にみ) x 100。

結果

ここで、非侵襲的なので子宮内膜症病変のアーキテクチャが、免疫不全マウスにひと子宮内膜の蛍光に分類された部分をはめ込むことによって保持されます異種モデルを作成するためのプロセスを説明します。病変の進行を監視できます。子宮内膜の断片のラベリングは、エクスプレス mCherry、近赤外領域の蛍光を発するタンパク質に設計されたアデノ ウイルスの感?...

ディスカッション

ここに詳細なプロトコル記述する子宮内膜症の病変のアーキテクチャのアーキテクチャによって維持される放出される蛍光のリアルタイム評価を同時にできるようにしながら mCherry の動物モデルの実装子宮内膜組織をラベル付けします。このプロトコルでは特定のインビボ イメージング システムとラベルの病変によって放出される蛍光を非侵襲的評価に関連するソフトウェアの使用をにつ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Endosampler™	Medgyn	22720	Cannula for sampling the uterine endometrium
DMEM Medium	VWR	HYCLSH30285.FS	Medium
Ad-mCherry	Vector Biolabs	1767	Adenoviral vector expressing mCherry
PBS, 1x solution, sterile, pH 7.4	VWR	E504-500ML	Buffer for washes
Pellets 17-B-Estradiol 18 mg/60 days	Innovative Research of America	SE-121	Hormone pellets for rodents
Vetbond™ Tissue Adhesive	3M	780-680	Tissue adhesive
Petri dishes in polystyrene crystal	Levantina	367-P101VR20	Petri dishes
Penicillin-Streptomicin	Sigma	P4333-100ML	Antibiotics
Syringes, medical 10 mL 0.5 ml	VWR	CODA626616	Syringes
Nitrile gloves, powder-free	VWR	112-2754	Gloves
Soft swiss nude mice	Charles River	SNUSSFE05S	Mice for animal experiment
Ivis Spectrum In vivo Imaging system	Perkin Elmer	124262	In vivo Monitoring equipment
Living Image® (Ivis software)	Perkin Elmer	---	In vivo monitoring software
Fetal Bovine Serum	Gibco	10082147	Enrichment serum
96-well cell culture treated plates	Life technologies	167008	Culture plates
Urine flasks	Summedical	4004-248-001	Flasks for washes
Sterile surgical blades	(Aesculap Division) Sanycare	1609022-0008	Surgical blades
Isovet 1,000 mg/g	B-BRAUN	---	Isoflurane (Anesthetic)
Buprex® 0.3 mg	Schering Plough S.A.	---	Buprenorphine (Analgesic solution)
Injectable morphine solution 10 mg/mL	B BRAUN	---	Morphine (Analgesic solution)
Monofyl® Absorbable Sutures	COVIDIEN	---	Sutures
Desinclor chlorhexidine	Promedic SA	---	Antiseptic solution
Microscopy DMi8	Leica Mycrosystems	---	fluorescence microscope
Hera Cell 150 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Incubator