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要約

この記事の全体的な目標は、分離と性質、大人マウス心臓から心臓の幹細胞 (CSCs) の分化のためのプロトコルを標準化することです。ここでは、マウス CSCs を分離する密度勾配遠心法と心筋細胞への分化、増殖、文化 CSC の精緻な方法について述べる。

要約

心筋梗塞 (MI) は、罹患率と世界中の死亡の主要な原因です。再生医療の主な目的は、MI 後死んだ心筋を補充するためにです。いくつかの戦略は、心筋を再生する使用されている幹細胞療法まま俺の心死んだ心筋を補充するために主要なアプローチになります。成人の心臓と心筋再生に内分泌やパラクリン効果で居住者心臓幹細胞 (CSCs) の存在を示唆証拠の蓄積します。しかし、CSC 分離特性と特に心筋心筋細胞へ分化技術的課題が残っています。本研究では分離と性質、CSCs の成体マウスの心から差別化の簡単な方法を提供します。ここでは、CSCs、0.2% コラゲナーゼ II ソリューションによって心を消化する場所の隔離のための濃度勾配法について述べる。分離 CSCs を特徴付ける、CSCs/心臓マーカー Sca 1、NKX2-5、および、GATA4 および多能性/未分化マーカー OCT4、SOX2, Nanog の発現を評価しました。シャーレで培養増殖マーカー Ki 67 の式を評価することにより分離 CSCs の拡散可能性も決定。CSCs の微分の潜在性を評価するため、我々 は 7 に 10 日間培養 CSCs を選択しました。我々 は心筋細胞分化培地と新しいプレートにそれらを転送します。彼らは 12 日細胞文化のインキュベーターで培養分化培地は 3 日ごとに変更中。差別化された CSCs エクスプレス心筋細胞特異的マーカー: アクチニンとトロポニン私。したがって、このプロトコルで分離された CSCs ある未分化と心臓マーカー、増殖や心筋細胞系列へ分化する可能性があります。

概要

虚血性心臓病、心筋梗塞 (MI) などは世界の1のまわりの死の主要な原因です。死んだ心筋を再生のための幹細胞療法のまま、MI の心2,の3,4、5の心機能を改善するために主要なアプローチです。異なったタイプの幹細胞は、死んだ心筋を補充するために、俺の心の心機能を改善するために使用されています。胚性幹細胞6と成人幹細胞に大きく分類することができます。大人の幹細胞の骨髄由来単核細胞7、8骨髄9,10,脂肪組織由来間葉系幹細胞などさまざまな種類の幹細胞を使用しているされて11,12、および臍帯13、CSCs14,15。幹細胞は、内分泌やパラクリン アクション16,17,18,19,20による心筋再生を昇格できます。しかし、幹細胞療法の主要な制限が増殖したり、特定の心臓系統21,22の方向へ分化する幹細胞の十分な数を取得します。自家および同種幹細胞移植は幹細胞療法9で重要な課題です。CSCs は、中心部から派生しているため、彼らすることができますより簡単に区別する心臓系統に非心臓幹細胞よりも心臓再生のためのより良いアプローチにかもしれない。したがって、奇形のリスクが軽減されます。また、エクソソームなど、CSCs から派生した Mirna CSCs の内分泌とパラクリンの効果は幹細胞の他のタイプよりも効果的かもしれません。従って、CSCs 残る心臓再生23,24のためのより良いオプションです。

CSCs は心臓起源のため MI 心心筋再生に適して、CSCs の主要な制限は効率的な分離方法の不足のため以下の収量。別の制限は、心筋細胞系列2,25,26,27に向かって CSCs の障害者差別化で可能性があります。これらの制限を回避するために CSC の分離、特性評価、心臓系統への分化に効率的なプロトコルを開発することが重要です。CSCs の単一の許容可能なマーカーがない、CSCs の特定細胞表面マーカーに基づく分離が少ない CSCs を得られます。ここでは、費用対効果は、CSCs の増加収量結果マウス心臓から CSCs を分離するための単純な勾配遠心法アプローチを標準化します。これらの孤立した CSCs は、蛍光活性化細胞を短絡すること特定の細胞表面マーカーの選択できます。CSCs の分離に加えて CSC 文化、特性評価、心筋細胞系列への分化にプロトコルを提供します。したがって、分離し、文化を特徴付ける成体マウスの心 (図 5) から CSCs を区別するエレガントな方法を提案する.

プロトコル

住宅、麻酔科とマウスの犠牲をネブラスカ大学医療センターの承認された IACUC プロトコルに従って行った。

1. 材料

  1. オスの鼠の動物機関 CSCs。 CSCs を分離するために社内保管することができますも使用 10-12 週齢 c57bl/6 j ブラックは非妊娠したメスマウスから分離されます。
  2. オートクレーブに入れることによって外科はさみ、微細手術用はさみ、湾曲したシャンク鉗子、外科ブレードを含む必要なの手術器械を滅菌するマウスの安楽死させる前に。
  3. 滅菌状態で CSC 分離バッファーを準備し、氷の上の 4 ° C で保存します。これらのバッファーは、polysucrose、diatrizoate のナトリウム溶液 1.077 グラム/mL の濃度に調整、不完全なダルベッコ改変イーグル培地、1 x ハムの平衡塩溶液 (HBSS) と細胞培養グレード 1 をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x。1% コラゲナーゼ II 在庫ソリューション (フィルター、滅菌) と HBSS で 0.2% 実用的なソリューションを準備します。
  4. 内閣は、10 mm のペトリ皿、6 ウェル プレート、24 ウェル プレート、T-25 と T-75 培養フラスコ、15 mL と 50 mL の円錐管、40 μ m と 100 使い捨て血清ピペットを含む、バイオ セーフティにおける滅菌状態で培養材料を保つ-μ m セル ストレーナー 0.22 μ m フィルターを使用します。
  5. 10 μ L、200 μ L、オートクレーブによって 1,000 μ L ピペット チップを消毒します。
  6. パウダー フリーのニトリル手袋と 70% エタノールを実験を通じて無菌状態を維持するために使用します。
  7. 消毒剤として 10% の漂白剤を使用します。
  8. それぞれ、文化や CSCs の分化の市販 CSC 培地と心筋細胞分化培地を使用しています。

2. 分離心筋幹細胞法

  1. 4 ~ 5 成人男性 (または非妊娠中の女性) を安楽死させる CO2チャンバーを用いたマウス。ピンや粘着テープで別郭清の段ボールにそれぞれのマウスの腕を固定します。
  2. 外の細菌を取り除くし、心の収穫時に滅菌状態を維持するマウスの 70% エタノールをスプレーします。腹部の真ん中、ハサミで切開をして直線で胸部までの腹部から皮膚をカットします。皮膚と毛の腹部領域をオフに中間カットの両側から皮膚を削除します。はさみやピンセットを使用して、胸郭の下の横隔膜をカットします。
  3. フード内側胸部を切断することによってマウスの胸腔を開きます。心を公開し、中心部の血液を削除します。中心部近傍の血を取り除く氷冷 PBS の心臓の周辺を洗います。
  4. 外科はさみとピンセットを使用して心臓を解剖します。10 mL の氷冷 PBS を含む 100 mm のペトリ皿に中心を配置します。
  5. 湾曲したシャンク鉗子を用いた心です、心の中の残血を取り外します。
  6. CSCs の隔離のための全体の中心を使用します。
  7. すべての 4 つまたは 5 つの全心を冷たい HBSS 10 ml、50 mL の円錐管に転送します。さらに処理まで氷の上の管を保ちます。
  8. バイオセイフティ内外キャビネット滅菌環境を作成する 70% エタノールを拭きます。心を含む管と 70% のエタノールとその他の必要な材料を殺菌します。さらに処理のキャビネット、バイオ セーフティに心臓を含む管を配置します。
  9. 心の中を冷たい HBSS の 10 mL を含む 100 mm のペトリ皿に転送します。心の中の任意の残留血液を削除する触診で再度心を洗います。血液の完全な除去を確保するため各洗浄後 HBSS ソリューションを変更します。
  10. HBSS ソリューションの 5-7 mL を含む 100 mm のペトリ皿に微細外科はさみまたは外科ブレードを使用して細かく心をカットします。鉗子のペアでそれぞれの心を押し、2-4 mm の部分に心をカットする手術の細かいはさみまたは外科ブレードのペアを使用します。頻繁に確認して血無料 HBSS HBSS ソリューションを変更します。HBSS ソリューションで心をミンチします。
  11. 500 x gで 5 分破棄のための 4 ° C でみじん切りにした組織培養上清を遠心し、ペレットを維持します。
  12. 0.2% コラゲナーゼ II ソリューション 50 mL の円錐管に 5-6 mL にペレットを再懸濁します。コラゲナーゼ溶液の量をほぼ 1.5 〜 2 倍にペレットのボリュームとはずです。
    注: の組織、私と 2.5 U/mL dispase ソリューションは、0.2% コラゲナーゼ II を置き換えることができます 0.2% コラゲナーゼの消化力。当期、コラゲナーゼの解決策のほぼ等しい量を使用して私のソリューションです。
  13. 37 ° C で 45-60 分の間 (75 x) gシェーカーでチューブを揺動、チューブの攪拌によりペレットを 0.2% コラゲナーゼ II ソリューションで徹底的にミックスします。換散を強化するすべての 20-30 分後チューブを手で積極的に振る。
  14. 5 mL の血清ピペット、1 mL のピペット チップを使用して単一細胞懸濁液に組織塊を分離する分離組織ミックス カップ刻んだ。
    注: CSCs の最大回復を得るには、少なくとも 5 分間溶解ミックスをカップ刻んだ。ティッシュの固まりが比較的大きく、ハサミ、外科ブレード 1 mL ピペット チップの先端をカットし、製粉のために使用します。
  15. 市販 CSC 培地を追加することによって、組織の酵素の溶解を停止します。2.14 の手順で分離組織のボリュームとしてほぼ 2-3 x ほど培地を追加します。
  16. 任意の未消化のティッシュの部分を削除する 100 μ m セル ストレーナーを消化細胞懸濁液を通過します。
  17. 2.16 40 μ m セル ストレーナーを使用して手順を繰り返します。
  18. 密度勾配遠心分離によって細胞を分離します。細胞の分離、polysucrose、ナトリウムの diatrizoate ソリューションに濾液の等量を優しくオーバーレイします。たとえば、最初に、50 mL の円錐管に polysucrose、ナトリウムの diatrizoate 溶液 20 mL を追加し、polysucrose、ナトリウム diatrizoate ソリューション ステップ 2.17 からろ液 20 mL を追加します。
    注: Prewarm、polysucrose、前に 37 ° C でナトリウム diatrizoate ソリューションを使用セル。非常に慎重に、ゆっくりと polysucrose、ナトリウム diatrizoate ソリューションまたぎ 2.17 から濾液を追加 2 つのソリューションの任意の混合を避けるために。これは重要なステップと見なされます。
  19. 500 x gスイング バケツの遠心分離機を使用して室温で 20 分間で両方のソリューションを含むチューブを遠心します。2 つのソリューションの混合を避けるために加速と減速速度を低くし、CSCs の適切な分離の遠心分離機を設定します。これは、CSC の分離の重要なステップです。遠心分離機内にせずに非常にゆっくりとグラデーションの混合物を含んでいる管を入れ、遠心分離に設定。
  20. 15 mL 滅菌チューブに 1 mL ピペットまたはプラスチック パスツール ピペットを使用して上位層から余分なソリューションとともにバフィー コートを取り出します。このバフィー層、CSCs が含まれます。
    注: は、CSCs に有毒であるので、polysucrose、ナトリウム diatrizoate ソリューション層を取らないバフィー コートのピペッティング時に余分な予防措置を取る。
  21. ステップ 2.20 から細胞懸濁液に CSC メンテナンス中の等量を追加し、存在する場合正しく残留 polysucrose、ナトリウム diatrizoate 溶液を中和するために混ぜます。
  22. 4 ° C で 5 分間 500 x gで上記細胞懸濁液を遠心分離します。上清を捨てます。
  23. 不完全な DMEM 培地の 7-10 mL にペレットを再懸濁し、残留 polysucrose、ナトリウム diatrizoate ソリューションを取り除くために 4 ° C で 5 分間 500 × gで遠心分離します。
  24. 精製 CSCs を含んだペレットを収集します。
  25. CSC 培地 1 mL にペレットを再懸濁します、CSC 数をカウントし、文化のペレットを使用します。CSC 数を数える、トリパン ブルー染色、診断を使用します。4 つの雄マウス心 CSCs の収量は ~1.8 百万です。
  26. シード 6 ウェル培養プレートの CSCs は、0.02% ゼラチン溶液 0.5% フィブロネクチンが塗られます。播種の完全な維持培地 2 mL を使用します。5% CO2と 37 ° C でインキュベーターで培養プレートを孵化させなさい。
  27. 3 日目まで毎日完全な CSC 培地で文化 CSCs の媒体を置き換えます。その後、別の日に媒体を変更します。
  28. 顕微鏡下で観察することにより、CSCs の成長を決定します。

3. 文化や心臓の幹細胞の通路のメンテナンス

  1. 文化、市販培地で分離 CSCs。一日おきに新鮮な培地で培養液を置き換えます。CSC 文化が confluency に達したら、2.26 の手順で述べたように、新しい板ゼラチンとフィブロネクチン、コーティング、CSCs を転送します。酵素の細胞解離バッファーによって培養 CSCs をデタッチします。培養プレートから細胞解離の標準的なプロトコルに従ってください。この段階で、CSCs は 0 (P0) ステージ通路と考え。
  2. 新しいゼラチンで文化 P0 CSCs と 37 ° c 5% CO2インキュベーターでの培養維持完全な CSC フィブロネクチン コーティング プレート、合流できるように手順 3.1 液体窒素で通路 1 (P1) CSCs。 ストア P1 CSCs を取得または実験のために使用するにはメンツ。
  3. 6 ウェル プレートで 50 万セルまたは 100 万 T-25 初期段階で CSC 文化を維持するために細胞を播きます。
  4. 85%-90% の合流になるとき、CSCs を通路します。CSCs は、4 〜 6 週間までメンテナンス培地中で培養することができます。
    注意: CSCs の比較的高い (40%-50%) の初期播種密度、CSCs が平らで細長いにその形態を変更する播種密度が低いので。

4. 心臓幹細胞のキャラクタリゼーション

  1. 培養 CSCs を特徴付ける、バクテリオファージ コントラストまたは明るいフィールド顕微鏡の下で観察します。蛍光顕微鏡の目的に CSC を含むプレートを配置します。セルを集中する倍率かなり低い (10 X) を設定します。位相コントラストの絞りを使用して、セルを調べます。20 X 対物レンズを変更することによって拡大や CSCs。 増加 40 X に目的の画像や、CSCs をイメージします。2 日間で、CSCs 表示時間と 7 日間で細胞増加のサイズ、形状、ほぼ円形、CSCs はほぼ円筒形 (図 1 a ・ 1 C) で表示されます。
  2. 多能性/未分化 (OCT4、SOX2、または Nanog) 増殖 (キ-67) (図 2 a - 2 D)、および (Sca 1、NKX2 5、または GATA4) 心臓起源/前駆細胞のマーカー、CSCs の染色を行う (図 3 a - 3 C)。
    1. CSCs の是非、24 ウェル培養プレートで 10,000 CSCs をシードします。
    2. (18-24 h) 後、翌日は 10 分 4% パラホルムアルデヒドの 300 μ L で、CSCs を修正します。
    3. 氷冷 PBS の 500 μ L で CSCs を洗って 5 分間隔で 3 倍。
    4. 10 分の PBS で希釈したトリトン X-100 0.2% の 300 μ L で CSCs を permeabilize します。
    5. 氷冷 PBS の 500 μ L で CSCs を洗って 5 分間隔で 3 倍。
    6. PBST で希釈し 1 %bsa の 300 μ L で、CSCs のブロックを実行 (PBS + 0.1% Tween 20) または 10% 通常の鶏血清希釈 pbst; で 1 h 300 μ L。
    7. 4 ° C で一晩ソリューションをブロックで希釈した一次抗体を 200 μ l 添加の CSCs を孵化させなさい一次抗体を希釈するに従って標準化または抗体のデータシートで推奨されています。
    8. 氷冷 PBS の 500 μ L で CSCs を洗って 5 分間隔で 3 倍。
    9. ソリューションをブロックで希釈した二次抗体を 200 μ l 添加の CSCs を孵化させなさい (手順 4.2.6 参照) 室温で 1 時間。二次抗体を希釈するに従って標準化または抗体のデータシートで推奨されています。
    10. 氷冷 PBS の 500 μ L で CSCs を洗って 5 分間隔で 3 倍。
    11. DAPI の 200 μ L で CSCs を counterstain (1 μ g/mL) が 5 分 PBS で希釈しました。
    12. CSCs 1 を洗って氷冷 PBS の 500 μ L と x。各ウェルに、氷冷 PBS の 300 μ L を追加します。
    13. 蛍光顕微鏡を用いたイメージングを実行します。蛍光イメージング プレートに直接光を避けるなどの指示に従います。顕微鏡下で培養プレートを維持します。異なる倍率でセルをフォーカスします。位相コントラストおよび/または異なる励起フィルターの下のセルを観察し、画像を保存します。
    14. プレートは 4 ° C で暗闇の中で保管して

5. 心臓幹細胞の心筋への分化

  1. CSCs の鑑別、prewarm (37 ° C) 市販 CSC 培地 2 mL で 6 ウェル プレートで 500,000 CSCs をシードします。
  2. 37 ° C で CO2インキュベーターで CSCs を含むプレートを孵化させなさい添付し、サブ合流成長まで増殖する CSCs を許可します。培地は黄色、新鮮な培地と培養液を交換してください。
  3. 85%-90% の confluency に置き換える維持培地 2 mL prewarm (37 ° C) 心筋細胞分化培地。2-3 週間までの 37 ° C で CO2インキュベーターでプレートを孵化させなさい。
  4. すべて 2-3 d. 観察良い培養条件を確保するため変更媒体中にたびに顕微鏡下で CSCs の形態分化培地を変更します。
  5. 分化培地で CSC 文化の 12 d の後画像次の標準的な免疫染色分化マーカーの CSCs プロトコル (手順 4.2.1 - 4.2.14 参照) をします。心筋マーカー (図 4 a ・ 4 b) の表現のための蛍光画像を保存します。

結果

本研究では 10-12 週齢の c57bl/6 j マウス雄心から CSCs を分離しました。ここでは、簡易 CSC 分離と多能性マーカーを用いた評価法を提案しました。また、CSC 分化のエレガントな方法と心筋細胞系統に分化した CSCs の評価を発表しました。(図 1 aと1 b) 位相差顕微鏡下で 2 に 3-日-培養 CSCs の紡錘形形態を観察した.幹細胞になる時間の間?...

ディスカッション

この CSC の隔離のプロトコルの重要な手順は次のとおりです。1) 滅菌条件は、マウスから心の抽出のために維持されなければなりません。心抽出中に汚染が CSCs。 2 の品質を危険にさらす) ミンチ入りの HBSS ソリューション全体の心と心のいくつかの洗浄によって行われる心の前に血を完全に削除する必要があります。3) 心の部分は、コラゲナーゼの解決と単一細胞懸濁液に完全に分離する必?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作業は、パーツでサポート、HL 113281 とパラス ・ クマール ・ ミシュラに HL116205 国立衛生研究所の助成金によって。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
MiceThe Jackson laboratory, USAStock no. 000664
Antibodies:
OCT4-Abcamab18976 (rabbit polyclonal)OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
SOX2Abcamab97959 (rabbit polyclonal)SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NanogAbcamab80892 (rabbit polyclonal)Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Ki67Abcamab16667 (rabbit polyclonal)Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Sca IMilliporeAB4336 (rabbit polyclonal)Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NKX2-5Santa Cruzsc-8697 (goat polyclonal)NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
GATA4Abcamab84593 (rabbit polyclonal)GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
MEF2CSanta Cruzsc-13268 (goat polyclonal)MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Troponin IMilliporeMAB1691 (mouse monoclonal)Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ActininMilliporeMAB1682 (mouse monoclonal)Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ANPMilliporeAB5490 (mouse polyclonal)ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Alex Fluor-488 checken anti-rabbitLife technologyRef no. A21441
Alex Fluor-594 goat anti-rabbitLife technologyRef no. A11012
Alex Fluor-594 rabbit anti-goatLife technologyRef no. A11078
Alex Fluor-488 checken anti-mouseLife technologyRef no. A21200
Alex Fluor-594 checken anti-goatLife technologyRef no. A21468
NameCompanyCatalog NumberComments
Culture medium:
CSC maintenance mediumMilliporeSCM101Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells
cardiomyocytes differentiation mediumMilliporeSCM102
DMEMSigma-AldrichD5546
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Isolation buffer:
polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077)Sigma10771
HBSSGibco2018-03
Collagenase ISigmaC0130
Dispase solutionSTEMCELL Technologies7913
PBSLONZAS1226
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermoscientificA1110501
Other reagents:
BSASigmaA7030
Normal checken serumVector laboratoryS3000
DAPI solutionApplichemA100,0010Dapi, working concentration-1 µg/mL
Trypan blueBiorad145-0013
TrypsinSigmaT4049
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermo Fisher ScientificA1110501
FormaldehydeSigma158127
Triton X-100ACROSCas No. 900-293-1
Tween 20Fisher SceintificLot No. 160170
EthanolThermo Scientific
NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue culture materials:
100 mm petri dishThermo Scientific
6-well plateThermo Scientific
24-well plateThermo Scientific
T-25 flaskThermo Scientific
T-75 flaskThermo Scientific
15 ml conical tubeThermo Scientific
50 mL conical tubeThermo Scientific
40 µm cell stainerFisher Scientific22363547
100 µm cell stainerFisher Scientific22363549
0.22 µm filterFisher Scientific09-719C
10 mL syringBDRef no. 309604
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tipsFisher Scientific
5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipetteThermo Scientific
NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments
Centrufuge machineThermo ScientificLEGEND X1R centrifuge
EVOS microscopeLife technology
Automated cell counterBiorad
Cell counting slideBiorad145-0011
Pippte aidThermo ScientificS1 pipet filler
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical Instruments:
Surgical scissorsFine Scientific Tool
Fine surgical scissorsFine Scientific Tool
Curve shank forcepsFine Scientific Tool
Surgical bladeFine Scientific Tool

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