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요약

이 글의 전반적인 목표, 특성화, 고립과 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포 (CSCs)의 분화에 대 한 프로토콜을 표준화 하입니다. 여기, 우리가 murine CSCs 분리 밀도 그라데이션 원심 분리 방법 및 CSC, 확산, 문화와 cardiomyocytes로 차별화에 대 한 정교한 방법을 설명 합니다.

초록

심근 경색 (MI)는 병 적 상태와 사망률 세계 각국의 주요 원인입니다. 재생 의학의 주요 목표는 미 후 죽은 심근을 보충. 여러 전략 심근을 다시 생성 하는 이용 되었다, 줄기 세포 치료는 내 심장의 죽은 심근을 보충 하는 주요 접근 남아 있다. 증거를 축적 성인 심장 및 심장 재생, paracrine 또는 내 분 비 효과에서 주민 심장 줄기 세포 (CSCs)의 존재를 제안 합니다. 그러나, CSC 절연 특성 및 심근 세포, 특히 cardiomyocytes 향해 차별화 기술 도전 남아 있습니다. 현재 연구에서 우리는 절연, 특성, 및 성인 마우스 마음에서 CSCs의 차별화에 대 한 간단한 방법을 제공. 여기, CSCs, 심장 0.2% 콜라 II 솔루션에 의해 소화 된다의 절연에 대 한 밀도 그라데이션 방법을 설명 합니다. 격리 CSCs 특성, 우리는 Sca 1, NKX2-5, 및 GATA4, CSCs/심장 마커 및 pluripotency/stemness 마커 OCT4, SOX2, 및 Nanog 식 평가. 우리는 또한 배양 접시에 배양 하 고 확산 표식 기-67의 식을 평가 하 여 절연된 CSCs의 확산 가능성을 결정. CSCs의 감 별 법 잠재력을 평가, 우리는 7-10 일 교양 CSCs 선택. 우리는 cardiomyocyte 차별화 매체와 새로운 접시에 그들을 전송. 그들은 셀 문화 인큐베이터에서 12 일 동안 incubated는 차별화 매체는 3 일 마다 변경 하는 동안. 차별화 된 CSCs 익스프레스 cardiomyocyte 특정 마커: actinin와 분 나. 따라서,이 프로토콜 절연 CSCs stemness 있고 심장 마커, 그리고 그들은 확산 및 cardiomyocyte 혈통으로 차별화에 대 한 가능성.

서문

허 혈 성 심장 질환, 심근 경색 (MI)를 포함 하 여 세계1주위 죽음의 주요 원인입니다. 죽은 심근 재생을 위한 줄기 세포 치료는 미 심장2,3,,45의 심장 기능을 개선 하는 주요 접근 남아 있다. 다른 종류의 줄기 세포 죽은 심근을 보충 하 고는 내 심장의 심장 기능을 개선 하기 위해 사용 되었습니다. 그들은 광범위 하 게 배아 줄기 세포6 및 성인 줄기 세포로 분류 될 수 있습니다. 성인 줄기 세포에서 다양 한 종류의 줄기 세포 사용 되었습니다, 단 세포 골 수에서 파생 된7,8, 골9,10, 지방 조직 에서에서 파생 된 중간 엽 줄기 세포 등 11,12및 탯13, CSCs14,15. 줄기 세포 심장 재생 paracrine 또는 내 분 비 작업16,17,18,,1920를 통해 홍보할 수 있습니다. 그러나, 줄기 세포 치료의 주요 한계 확산 수 있는 특정 심장 혈통21,22향해 분화 줄기 세포의 적절 한 번호를 얻는 이다. 헌 및 allogenic 이식 줄기 세포의 줄기 세포 치료9에 있는 중요 한 도전 이다. 그들은 마음에서 파생 하기 때문에 그들은 분화 될 수 있다 더 쉽게 심장 계보에 비 심장 줄기 세포 보다 CSCs 심장 재생을 위한 더 나은 방법은 수 있습니다. 따라서, 기형종의 위험을 줄여줍니다. 또한, 내 분 비 및 paracrine 효과 CSCs의 exosomes 등 miRNAs는 CSCs에서 파생 된 줄기 세포의 다른 유형 보다 더 효과적인 수 있습니다. 따라서, CSCs는 심장 재생23,24에 대 한 더 나은 옵션을 남아 있다.

CSCs는 그들의 심장 근원 때문에 미 마음에 심장 재생을 위한 더 나은 후보자, CSCs는 주요 한계는 효율적인 절연 방법의 부족으로 인해 더 적은 수확량. 또 다른 한계는 cardiomyocytes 리니지2,25,,2627향해 CSCs의 장애인된 차별 될 수 있습니다. 이러한 한계를 회피, CSC, 특성화, 고립과 심장 혈통으로 차별화에 대 한 효율적인 프로토콜을 개발 하는 것 중요 하다. CSCs에 대 한 단일 허용 마커 없는 고는 특정 세포 표면 마커 기반 격리 CSCs의 적은 CSCs 수익률. 여기, 우리는 비용 효율적 이며 CSCs의 증가 수확량에서 결과 마우스 심장 CSCs 격리 하기 위해 간단한 그라데이션 원심 접근 표준화. 이러한 격리 CSCs 형광 활성화 셀 단락에 의해 특정 세포 표면 표식에 대 한 선택할 수 있습니다. CSCs 격리, 뿐만 아니라 우리는 CSC, 특성화, 문화와 cardiomyocyte 혈통으로 차별화에 대 한 프로토콜을 제공 했습니다. 따라서, 우리는 격리, 성격, 문화, CSCs 성인 마우스 마음 (그림 5)에서 분화 하는 우아한 방법 제시.

프로토콜

주택, 마 취, 그리고 마우스의 희생은 네브라스카 대학 의료 센터의 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 하는 것을 수행 했다.

1입니다. 자료

  1. 사용 10-에 12 주 된 C57BL/6J 블랙 남성 쥐, CSCs CSCs의 격리에 대 한 제도적 동물 시설에서 사내 보관 수도 비 임신 여성 쥐에서 격리 되어야.
  2. 모든 필요한 수술 악기, 수술가 위, 등 정밀한 수술가 위, 곡선된 칼 집게, 외과 블레이드, 압력가 마로 소독 하 여 소독 마우스의 안락사 전에 그들.
  3. 멸 균된 상태에서 CSC 절연 버퍼를 준비 하 고 얼음에 4 ° C에서 저장. 이 버퍼는 polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 솔루션 1.077 g/mL의 조밀도를 조정, 불완전 한 Dulbecco의 수정이 글의 중간, 1 x 햄의 소금물 (HBSS), 균형 및 문화-학년 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 셀. 1% 콜라 II 재고 솔루션 (필터링 및 소독)와 0.2% 작업 솔루션 HBSS에서 준비 합니다.
  4. 캐비닛, 10 mm 페 트리 접시, 등 6 잘 플레이트, 24-잘 접시, T-25 및 T-75 문화 플라스 크, 15 mL 및 50 mL 원뿔 튜브, 일회용 serological 펫 40 µ m와 100는 biosafety에 멸 균된 상태에서 조직 문화 자료를 유지 -0.22 μ m 필터 µ m 세포 멤브레인.
  5. 10 µ L, 200 µ L, 및 1000 µ L 피 펫 팁 오토 클레이 브 소독.
  6. 파우더 프리 니트 릴 장갑, 70% 에탄올을 사용 하 여 실험을 통해 무 균 상태를 유지 하기 위해.
  7. 10% 표 백제를 사용 하 여 살 균 제로.
  8. 사용 하 여 상용 CSC 유지 보수 매체 cardiomyocytes 차별화 매체 문화, CSCs의 차별화에 대 한 각각.

2. 절연 방식의 심장 줄기 세포

  1. 4-5 성인 남성 (또는 비 임신 여성) 안락사는 CO2 챔버를 사용 하 여 마우스. 핀 이나 끈 적 테이프와 함께 별도 해 부 골 판지에 각 마우스의 무기를 수정.
  2. 외부 세균을 제거 하 고 심장의 수확 하는 동안 멸 균된 상태를 유지를 마우스에 70% 에탄올을 스프레이. 복 부 중간에 위로 절 개 하 고 직선에서에서 가슴까지 복 부 피부를 잘라. 피부와 머리카락의 복 부 영역을 지우려면 중간 컷의 양쪽에서 피부를 제거 합니다. 가 위, 핀셋를 사용 하 여 흉 곽 아래 횡 경 막 잘라.
  3. 후드 안쪽 흉 곽을 절단 하 여 마우스의 흉 강을 엽니다. 마음 하 고 심장 근처 혈액을 제거. 워시는 심장 주변 모든 혈액의 제거를 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 심장의 주변 지역.
  4. 수술가 위 핀셋을 사용 하 여 심장 해 부. 얼음 처럼 차가운 PBS의 10 mL를 포함 하는 100 mm 페 트리 접시에 마음을 놓습니다.
  5. Palpitate 곡선된 칼 집게를 사용 하 여 심장 고 마음 안에 잔여 혈액을 제거 합니다.
  6. 온 마음을 사용 하 여 CSCs의 격리에 대 한.
  7. 모든 4 개 또는 5 개의 전체 마음 얼음 처럼 차가운 HBSS의 10 mL를 포함 하는 50 mL 원뿔 튜브에 전송. 추가 처리까지 얼음에 튜브를 유지.
  8. 내부와 외부는 biosafety 멸 균된 환경을 만들기 위해 70% 에탄올과 캐비닛 닦아냅니다. 심장-포함 된 튜브와 70% 에탄올과 다른 필요한 재료를 소독. 추가 처리를 위해 캐비닛에 biosafety 심장 포함 된 튜브를 놓습니다.
  9. 100 mm 페 트리 접시 얼음 HBSS의 10 mL를 포함 하는 마음을 전송 합니다. Palpating 마음 안에 어떤 잔여 혈액을 제거 하 여 다시 마음을 씻어. 혈액의 완전 한 제거를 보장 하기 위해 각 세척 후 HBSS 솔루션을 변경 합니다.
  10. 마음 HBSS 솔루션의 5-7 mL를 포함 하는 100 mm 페 트리 접시에 잘 수술가 위 또는 외과 블레이드를 사용 하 여 작은 조각으로 잘라. 집게의 쌍을 가진 각 마음을 누른 수술 잘가 위 또는 외과 블레이드를 사용 하 여 심장 2-4 밀리미터 조각으로 잘라. HBSS 솔루션 혈액 무료 HBSS을 자주 변경 합니다. HBSS 용액에 마음을 말하다.
  11. 원심 5 분 삭제 4 ° C에서 500 x g 에 다진된 조직은 상쾌한 고 펠 릿을 유지.
  12. 5-6 ml 50 mL 원뿔 튜브에 0.2% 콜라 II 솔루션의 펠 릿을 resuspend. 콜라 솔루션의 볼륨 이어야 한다 거의 1.5-에 2 배는 펠 릿의 볼륨.
    참고: 대 한 소화 조직, 0.2% 콜라 나 및 2.5 U/mL dispase 솔루션 0.2% 콜라 II를 바꿀 수 있습니다. Dispase 솔루션은 콜라의 거의 동일한 볼륨을 사용 하 여 난 솔루션.
  13. 철저 하 게 혼합 펠 릿 0.2% 콜라 II 솔루션 튜브를 교 반 또는 37 ° c.에 45-60 분에서 75 x g 통에 튜브 락 흔들어 튜브 적극적으로 손으로 세포를 향상 시키기 위해 모든 20-30 분 후.
  14. 5 mL 혈 청 학적인 피 펫 및 1 mL 피 펫 팁을 사용 하 여 단일 셀 서 스 펜 션으로 조직 덩어리를 해리 하 lysed 조직 믹스 triturate
    참고:는 CSCs의 최대 복구를 얻으려면, 적어도 5 분 동안 세포 믹스 triturate. 조직 덩어리 상대적으로 큰 경우에가 위 또는 외과 블레이드 1 mL 피 펫 팁의 끝을 잘라 고 분쇄에 대 한 그것을 사용 합니다.
  15. 상용 CSC 유지 보수 매체를 추가 하 여 조직의 효소 세포를 중지 합니다. 2.14 단계에서 lysed 조직의 볼륨으로 거의 2-3 배 많은 유지 보수 매체를 추가 합니다.
  16. 모든 소화 되지 않은 조직 조각을 제거를 100 µ m 셀 스 트레이너를 통해 소화 세포 현 탁 액을 전달 합니다.
  17. 2.16 40 µ m 셀 스 트레이너를 사용 하 여 단계를 반복 합니다.
  18. 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 통해 셀 구분 합니다. 세포의 분리에 대 한 polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 솔루션 위에 filtrate의 동일한 볼륨을 오버레이 부드럽게 합니다. 예를 들어 첫째, 50 mL 원뿔 튜브에 polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 솔루션의 20 mL를 추가 하 고, polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 솔루션을 통해 단계 2.17에서에서 여과 액 20 mL를 추가.
    참고: Prewarm는 polysucrose 및 전에 37 ° C에 나트륨 diatrizoate 솔루션 셀으로 사용합니다. 매우 신중 하 고 천천히는 filtrate 단계의 2.17 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 솔루션을 통해 추가 두 솔루션의 어떤 혼합을 피하기 위해. 이 중요 한 단계로 간주 됩니다.
  19. 500 x g 스윙 양동이 원심 분리기를 사용 하 여 실 온에서 20 분에서 두 솔루션을 포함 하는 튜브 원심 낮은 가속 및 감속 속도 두 가지 솔루션을 혼합 하지 마십시오 및는 CSCs의 적절 한 분리는 분리기를 설정 합니다. 이것은 CSC 격리에 중요 한 단계입니다. 튜브는 원심 분리기 내부 방해 없이 아주 천천히 그라데이션 혼합물을 포함 하 고 원심 분리에 대 한 설정 합니다.
  20. 15 mL 소독된 튜브에 1 mL 피 펫 또는 플라스틱 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 상위 계층에서 추가 솔루션 함께 버 피 코트를 꺼내. 이 버 피 레이어는 CSCs 포함 됩니다.
    참고: 주의 사항 추가 pipetting 없애려고 하지 polysucrose와 나트륨 diatrizoate 솔루션 레이어 CSCs에 독성 때문에 버 피 코트의 동안.
  21. 단계 2.20에서에서 CSC 유지 보수 매체의 동일한 볼륨 세포 현 탁 액을 추가 있는 경우 제대로 잔여 polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 솔루션, 중화를 섞는다.
  22. 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 에서 위의 세포 현 탁 액을 원심 폐기는 상쾌한.
  23. 불완전 한 DMEM 매체의 7-10 mL에 펠 릿을 resuspend 하 고 모든 잔여 polysucrose 및 나트륨 diatrizoate 솔루션의 제거를 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심.
  24. 순화 CSCs 포함 된 펠 릿을 수집 합니다.
  25. CSC 유지 보수 매체의 1 mL에 펠 릿을 resuspend, CSC 수를 계산 하 고 문화에 대 한 펠 릿을 사용 합니다. CSC 수를 계산 하려면 Trypan 푸른 얼룩과 hemocytometer를 사용 합니다. 4 남성 쥐 마음, CSCs의 수익률은 ~1.8 백만.
  26. 씨앗 6-잘 문화 접시에 CSCs 0.5 %fibronectin 포함 된 0.02% 젤라틴 솔루션과 코팅. 완전 한 유지 보수 매체의 2 개 mL를 사용 하 여 시드를 위한. 문화 접시 5% CO2와 37 ° C에서 인큐베이터에 품 어.
  27. 제 3의 날까지 매일 완전 한 CSC 유지 보수 매체와 문화 CSCs의 중간을 교체 합니다. 그 후, 다른 일에 매체를 변경 합니다.
  28. 현미경으로 관찰 하 여는 CSCs의 성장을 결정 합니다.

3. 유지 보수 및 심장 줄기 세포의 문화

  1. 상업적으로 사용 가능한 유지 보수 매체에 격리 CSCs 문화. 다른 일에 신선한 유지 보수 매체와 문화 매체를 교체 합니다. CSC 문화는 confluency에 도달 하면 단계 2.26에서에서 설명 했 듯이 젤라틴과 fibronectin, 코팅 새로운 플레이트는 CSCs 전송. 효소 세포 분리 버퍼 교양된 CSCs 분리 합니다. 문화 판에서 셀 분리의 표준 프로토콜을 따릅니다. 이 단계에서 CSCs는 0 (P0) 무대 통로에 간주 됩니다.
  2. 새로운 젤라틴에 문화 P0 CSCs fibronectin 코팅 접시 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 완전 한 CSC 유지 보수 매체에 confluent, 수 수와 다음 단계 통과 1 (P1) CSCs 저장소 P1 CSCs 액체 질소에 또는 experi에 대 한 그들을 사용 하 여 3.1 사항입니다.
  3. 6 잘 플레이트 또는 그것의 초기 단계에서 CSC 문화를 유지 하기 위해 T-25 1 백만 셀 씨 0.5 백만 셀.
  4. 85%-90% 합칠 때 CSCs 통로. CSCs 4 ~ 6 주까지 유지 보수 매체에 경작 될 수 있다.
    참고: 계속 CSCs 상대적으로 높은 (40%-50%)의 초기 시드 밀도 때문에, 낮은 시드 밀도 CSCs 평평 하 고 길쭉한를 그들의 형태 변경 될 수 있습니다.

4입니다. 심장 줄기 세포의 특성

  1. 교양된 CSCs 특성, 살 균 소-대조 또는 밝은 분야 현미경 관찰 합니다. 형광 현미경의 목표에 포함 하는 CSC 접시를 놓습니다. 배율을 상당히 낮은 (10 배) 셀 초점을 설정 합니다. 단계 대조 조리개를 사용 하 여 셀을 관찰. 20 X 배율 대물 렌즈를 변경 하 여 증가 하 고 이미지 CSCs. 증가 40 X 목표는 CSCs 이미지. 2 일에는 CSCs 나타납니다 거의 둥근 모양만 시간, 그리고 7 일 셀 증가의 크기, CSCs는 거의 원통 모양 (그림 1A - 1 C).
  2. Immunostaining는 CSCs의 pluripotency/stemness (OCT4, SOX2, 또는 Nanog), 확산 (기-67) (그림 2A - 2D), 그리고 심장 근원/시 조 세포 (Sca 1, NKX2-5, 또는 GATA4)의 마커를 수행 (그림 3A - 3c).
    1. CSCs의 immunostaining에 대 한 24-잘 문화 접시에 10000 CSCs 씨.
    2. 다음 다음날 (18-24 h), 10 분 동안 4 %paraformaldehyde 300 µ L에는 CSCs 수정.
    3. 얼음 처럼 차가운 PBS의 500 µ L와 CSCs 씻어 5 분 간격으로 3 배.
    4. 0.2% 트라이 톤 X-100 10 분에 대 한 PBS에 희석의 300 µ L와 CSCs permeabilize
    5. 얼음 처럼 차가운 PBS의 500 µ L와 CSCs 씻어 5 분 간격으로 3 배.
    6. 1% BSA PBST에 희석의 300 µ L로는 CSCs의 차단 수행 (PBS + 0.1% Tween 20) 또는 10% 일반 닭 혈 청 1 h PBST에 희석의 300 µ L.
    7. 1 차적인 항 체 4 ° c.에 하룻밤 솔루션을 차단에 희석의 200 µ L에서 CSCs 품 어 희석 주 항 체 또는 항 체의 표준화에 따라 데이터 시트에서 권장 하는 대로.
    8. 얼음 처럼 차가운 PBS의 500 µ L와 CSCs 씻어 5 분 간격으로 3 배.
    9. 이차 항 체 솔루션을 차단에 희석의 200 µ L에서 CSCs 품 어 (단계 4.2.6 참조) 실 온에서 1 h. 희석 이차 항 체 또는 항 체의 표준화에 따라 데이터 시트에서 권장 하는 대로.
    10. 얼음 처럼 차가운 PBS의 500 µ L와 CSCs 씻어 5 분 간격으로 3 배.
    11. DAPI의 200 µ L와 CSCs counterstain (1 µ g/mL) 5 분에 대 한 PBS에 희석.
    12. 1 CSCs 씻어 얼음 처럼 차가운 PBS의 500 µ L x. 그런 다음, 각 우물에 얼음 처럼 차가운 PBS의 300 µ L를 추가 합니다.
    13. 형광 현미경을 사용 하 여 이미지를 수행 합니다. 형광 이미징, 접시에 직접 빛을 피하는 등의 지침을 따릅니다. 현미경 문화 접시를 유지. 다른 배율에서 셀의 초점을 맞춥니다. 단계 대조 및/또는 다른 여기 필터에서 세포를 관찰 하 고 이미지를 저장.
    14. 4 ° c.에 어둠 속에서 접시를 저장

5. Cardiomyocyte에 심장 줄기 세포의 분화

  1. CSCs의 차별화, prewarm (37 ° C) 상용 CSC 유지 보수 매체의 2 mL와 함께 6 잘 플레이트에 500000 CSCs 씨.
  2. 포함 하는 37 ° c.에 CO2 배양 기에서 CSCs 접시를 품 어 연결 하 고 하위 confluent 성장까지 증식 CSCs 허용. 매체 노란색, 문화 매체를 신선한 유지 보수 매체 바꿉니다.
  3. 85%-90 %confluency prewarm (37 ° C) cardiomyocytes의 2 mL와 함께 유지 보수 매체 교체 차별화 매체. 최대 2-3 주 동안 37 ° C에서 CO2 인큐베이터에 접시를 품 어.
  4. 모든 2-3 디 좋은 문화 조건 되도록 변경 매체 동안 때마다 현미경 CSCs' 형태 관찰 차별화 매체를 변경 합니다.
  5. CSC 문화 차별화 매체에서의 12 d, 후 이미지 CSCs 분화 마커 표준 immunostaining 다음에 대 한 프로토콜 (단계 4.2.1-4.2.14 참조) 합니다. Cardiomyocytes 표식 (그림 4A - 4B)의 표현에 대 한 형광 이미지를 저장 합니다.

결과

현재 연구에서 우리는 10 월에 12 주 된 C57BL/6J 남성 쥐 마음에서 CSCs 고립. 여기, 우리는 CSC 격리 및 pluripotency의 마커를 사용 하 여 특성을 위한 간단한 방법을 제시 했습니다. 우리는 또한 CSC 차별화 우아한 메서드와 CSCs cardiomyocytes 혈통으로 분화의 특성을 제시. 2-하 3-일-교양 CSCs (그림 1A 및 1B) 단계 대조 현미경의 스핀 들 모양 형태를 관?...

토론

이 CSC 격리 프로토콜의 중요 한 단계는 다음과 같습니다. 1) 멸 균된 조건이 생쥐에서 심 혼의 추출에 대 한 유지 되어야 합니다. 심장 추출 하는 동안 어떤 오염 든 지 CSCs. 2의 품질을 손상 수 있습니다) 혈액 조각 HBSS 솔루션 전체 마음과 심장의 여러 가지 세척에 의해 이루어집니다 마음을 닦지 하기 전에 완전히 제거 해야 합니다. 3) 심장 조각은 콜라 솔루션으로 단일 셀 서 스 펜 션으로 완전히 ly...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

이 작품에서에서 지원 됩니다, 부품, HL-113281 및 HL116205 성명서 쿠마 Mishra에 건강의 국가 학회 교부 금에 의해.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
MiceThe Jackson laboratory, USAStock no. 000664
Antibodies:
OCT4-Abcamab18976 (rabbit polyclonal)OCT4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
SOX2Abcamab97959 (rabbit polyclonal)SOX2-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NanogAbcamab80892 (rabbit polyclonal)Nanog-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Ki67Abcamab16667 (rabbit polyclonal)Ki67-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Sca IMilliporeAB4336 (rabbit polyclonal)Sca I Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
NKX2-5Santa Cruzsc-8697 (goat polyclonal)NKX2-5-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
GATA4Abcamab84593 (rabbit polyclonal)GATA4-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
MEF2CSanta Cruzsc-13268 (goat polyclonal)MEF2C-Primary antibody- 1:50 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Troponin IMilliporeMAB1691 (mouse monoclonal)Troponin I-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ActininMilliporeMAB1682 (mouse monoclonal)Actinin-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
ANPMilliporeAB5490 (mouse polyclonal)ANP-Primary antibody- 1:100 dilution, Secondar antibody- 1:200 dilution, in blocking solution
Alex Fluor-488 checken anti-rabbitLife technologyRef no. A21441
Alex Fluor-594 goat anti-rabbitLife technologyRef no. A11012
Alex Fluor-594 rabbit anti-goatLife technologyRef no. A11078
Alex Fluor-488 checken anti-mouseLife technologyRef no. A21200
Alex Fluor-594 checken anti-goatLife technologyRef no. A21468
NameCompanyCatalog NumberComments
Culture medium:
CSC maintenance mediumMilliporeSCM101Note: For CSC culture, PBS or incomplete DMEM medium was used for washing the cells
cardiomyocytes differentiation mediumMilliporeSCM102
DMEMSigma-AldrichD5546
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell Isolation buffer:
polysucrose and sodium diatrizoate solution (Histopaque1077)Sigma10771
HBSSGibco2018-03
Collagenase ISigmaC0130
Dispase solutionSTEMCELL Technologies7913
PBSLONZAS1226
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermoscientificA1110501
Other reagents:
BSASigmaA7030
Normal checken serumVector laboratoryS3000
DAPI solutionApplichemA100,0010Dapi, working concentration-1 µg/mL
Trypan blueBiorad145-0013
TrypsinSigmaT4049
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentThermo Fisher ScientificA1110501
FormaldehydeSigma158127
Triton X-100ACROSCas No. 900-293-1
Tween 20Fisher SceintificLot No. 160170
EthanolThermo Scientific
NameCompanyCatalog NumberComments
Tissue culture materials:
100 mm petri dishThermo Scientific
6-well plateThermo Scientific
24-well plateThermo Scientific
T-25 flaskThermo Scientific
T-75 flaskThermo Scientific
15 ml conical tubeThermo Scientific
50 mL conical tubeThermo Scientific
40 µm cell stainerFisher Scientific22363547
100 µm cell stainerFisher Scientific22363549
0.22 µm filterFisher Scientific09-719C
10 mL syringBDRef no. 309604
10 µL, 200 µL, 1000 µL pipette tipsFisher Scientific
5 mL, 10mL, 25 mL disposible plastic pipetteThermo Scientific
NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments
Centrufuge machineThermo ScientificLEGEND X1R centrifuge
EVOS microscopeLife technology
Automated cell counterBiorad
Cell counting slideBiorad145-0011
Pippte aidThermo ScientificS1 pipet filler
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical Instruments:
Surgical scissorsFine Scientific Tool
Fine surgical scissorsFine Scientific Tool
Curve shank forcepsFine Scientific Tool
Surgical bladeFine Scientific Tool

참고문헌

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