生体外でマウス縁帯 B 細胞のせん断流動誘起移行の解析

要約

辺縁帯 B 細胞 (MZBs) は、流れを自分の移行パスを再定位せん断流の力に対応します。このプロトコルは、記録し、流体工学ユニット、ポンプ、顕微鏡イメージング システム、フリー ソフトウェアを使用して移行を分析する方法を示しています。

要約

辺縁帯 B 細胞 (MZBs) は、卵胞を包むマウス脾辺縁ゾーンに存在する B 細胞の人口です。卵胞に到達、MZBs は血流のせん断力を移行する必要があります。この流動誘起 MZB 移行を体外の解析方法をご紹介します。まず、MZBs はマウスの脾臓から分離されます。第二に、MZBs はフロー チャンバー スライドでインテグリンのリガンドに定住、せん断流れに公開され、移行中の顕微鏡イメージを作成します。第三に、MTrack2 の自動細胞 ImageJ、トラッキングのプラグインを使用して移行の MZBs のイメージを処理して結果セル トラックが Ibidi 走化性ツールを使用して量を示されます。移行データは、セルがどのように高速移動、どのくらいの頻度彼らは方向を変更、かどうかせん断流動ベクトルに影響、その移行の方向、どのインテグリンのリガンドが関与しているを明らかにします。我々 は、MZBs を使用して、メソッド簡単にせん断流の力に反応する白血球の移行を分析するために適応できます。

概要

免疫細胞は人間の体内で最も運動性細胞、しばしば血液とリンパの流れからのせん断力と争わなければなりません。ただし、白血球^1,2,3,4、5のせん断力による移動の研究は比較的少ないがあります。流れ体外への免疫細胞の応答を分析するための信頼のおける定量的プロトコルをご紹介します。アッセイを実行してもコンポーネントの作製が必要ありませんし、市販されているすべての機器および消耗品。1 日で細胞の浄化、移行の分析など、プロトコルを実行できます。最後に、辺縁帯 B 細胞 (MZBs) の移行を説明するがプロトコルを適応免疫細胞の他のタイプの流れに対して移行を分析することができます。したがって、この試金を使用して、条件の包括的なパネルと白血球の広い範囲を体系的に分析することは不可能です。

MZBs は、マウスの脾臓とシャトルでのみ発見されている B 細胞の人口卵胞の内部とマージナル ゾーン^6,7,8,9間。辺縁帯厚約 5-10 の免疫細胞細胞の層であります。細胞層卵胞を包んで、¹⁰に、MZBs とマクロファージが、また不変の自然なキラー T (iNKT) 細胞、樹状細胞 (Dc) および他の中の好中球を主に成っています。辺縁帯の細胞は、卵胞周囲辺縁洞で終了している脾動脈から発生した単方向血流にさらされています。血辺縁帯を通じて縁洞の穴から流れるは赤脾静脈洞で収集し、¹¹循環に復元します。血液の流動、MZBs を洗うし、血で運ばれる抗原にそれらを公開します。MZBs は、自動的に血液にさらされない卵胞の内側と辺縁帯間の往復で卵胞に抗原を運ぶ。したがって、MZBs へシャトルバス卵胞、として血流¹² (図 1 a) せん断力を移行する必要があります。

このプロトコルでは定量的免疫細胞など MZBs がない流れまたは生体外で高流量に対応方法を決定する方法について述べる、明らかにどのようにするためにプログラムの体内に移行します。最初のステップで MZBs は市販のキットからの抗体に結合した磁気ビーズを用いたマウス脾臓から浄化されます。新鮮単離の MZBs が流れチェンバー スライドのウェルに導入、インテグリンのリガンド、着地させて、ポンプ システム (図 2 a) を使用して移行バッファーの流れにさらされています。セルは、タイムラプス ビデオ顕微鏡システムを使用して作成されます。無料の ImageJ のプラグイン、MTrack2^13,14、自動的にセルを追跡する分析のため、画像が処理されます。トラックは、速度、真直度、マイグレーション インデックスなど様々 なパラメーターを決定する無料 Ibidi 走化性ツール¹⁵定量化することができます。これらの値は、体内の免疫細胞の動きを制御する力を理解するためにせん断流移行に関する移行阻害剤、細胞刺激、ケモカイン、および他の移行に影響を与える化学物質の影響を決定する使用できます。

プロトコル

動物の使用を含むすべての実験は、マクデブルクの OVGU 大学の医学部のすべてのガイドラインに従い Landesverwaltungsamt ハレ (ザクセン = アンハルト州)、ドイツで既に承認されています。

1. MZB 細胞精製

1. 白血球を分離します。
   1. 16 週齢マウスに 8 を犠牲にし、脾臓¹⁶を削除します。5 mL の冷たいセル バッファーで脾臓を切り離して考える [リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) + 0.5% 脂肪酸無料ウシ血清アルブミン (BSA)] 組織発生器を使用するか、そっと 6 ウェル プレートのウェルに 70 μ m セル ストレーナー メッシュで脾臓をマッシュ アップでは、5 mL シリンジのプランジャー。
   2. 15 mL の円錐管にセル ・ バッファーのセルを転送します。組織分解チューブまたは井戸のナイロン メッシュに別の 5 mL の冷たいセル バッファーを追加することによって追加のセルを収集します。セル ・ バッファーのセルの追加 5 mL をコニカル チューブに転送します。300 × g 10 分間室温 (RT、20 ° C) ので遠心し、上清を捨てます。
2. 赤血球細胞の換散を実行します。
   1. 再追加した RBC 換散バッファーの追加 1.5 mL をあらかじめ加温は赤血球 (RBC) 換散バッファー (150 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃、0.1 ミリメートルの EDTA) の 1 mL の細胞ペレットを中断し、混合旋回します。再ペレットを中断するために必要な時間を含め、2 分間の合計は室温 (20 ° C) で孵化させなさい。
   2. 7.5 mL の冷たいセル バッファーを溶解を停止する細胞懸濁液に追加します。300 x gと 10 分のための 4 ° C で遠心し、上清を捨てます。
   3. セル ・ バッファーの 1 mL の細胞ペレットを再停止し、セル ・ バッファーの追加 9 mL を追加します。30 μ m 事前色分解フィルターを介して細胞の残骸を削除する新しい 15 mL の円錐管に 10 mL の細胞懸濁液をピペットします。
   4. 300 x gと 10 分のための 4 ° C で細胞を遠心し、上澄みを廃棄します。再セル ・ バッファーを 500 μ l 添加の細胞ペレットを中断します。寒さを維持セル以降のすべてのステップの手順のフロー チャンバー スライドで孵化まで。
3. MZBs を浄化します。
   1. CD43 (非 B 細胞) で、(T 細胞上の CD4、(未熟な B 細胞)、上の CD93 Ter119 (赤血球)、上など、すべての望ましくないセルに対して市販のキットからコニカル チューブに細胞懸濁液にビオチン結合抗体の 50 μ L を追加します。振るか、ミックスはない渦のセルに優しくチューブをフリックします。円錐管をほぼフラット角度で氷と 15 分 25 rpm で岩のベッドの上で横たわっていた。
   2. 細胞懸濁液を 100 μ L の容量で抗ビオチン抗体結合磁性ビーズを追加します。セル ・ バッファー、300 × gで遠心分離の 5 mL と 10 分のための 4 ° C を追加し、上清を廃棄して 25 rpm 20 分洗浄のため氷の上で細胞懸濁液セルをロックし続けます。セル ・ バッファーの 1 mL の細胞を再停止します。
   3. 磁気の列にそれらを保持することによって磁気ビーズ結合細胞細胞懸濁液を枯渇させます。廃棄標識細胞 (すべての非 B 細胞と未熟な B 細胞)。セル ・ バッファー、5 mL の MZBs によって非特定の付着を防止するための簡単なアプリケーションで塗装されている 15 mL の円錐管に非標識細胞 (成熟 B 細胞) を収集します。
   4. セル ・ バッファーの 5 mL の細胞懸濁液を洗います。300 x gと 10 分のための 4 ° C で遠心し、上清を捨てます。再セル ・ バッファーの 90 μ L のセルの中断および抗 CD23 結合ビーズの 10 μ L を追加します。25 rpm で 20 分間氷の上に優しくロック セル中断。
   5. セル ・ バッファーの 5 mL の細胞懸濁液を洗います。300 x gと 10 分のための 4 ° C で遠心し、上清を捨てます。セル ・ バッファーの 1 mL の細胞を再停止します。
   6. 磁気の列にそれらを保持することによって磁気ビーズ結合細胞細胞懸濁液を枯渇させます。ラベル付きセル (濾胞性 B 細胞) を破棄します。セル ・ バッファーの 5 mL の簡単なアプリケーションでプレコートされて 15 mL の円錐管に非標識細胞 (MZBs) を収集します。カウントと純度をチェックのため細胞の 50 μ L を削除します。
4. 純度を確認する並べ替えられた MZBs を汚します。
   1. Fc ブロックの 50 μ L の 10,000 のセルに 10% ボリューム (5 μ L) を追加し、, B220 FITC の 0.3 μ を含むセル ・ バッファーの追加の 50 μ L を 5 分の 4 ° C で (0.15 μ g)、CD21 PE (0.06 μ g)、CD23 APC (0.06 μ g) 105 μ L (各抗体希釈 1:350) の総量、または濾胞性 B 細胞と MZBs 染色 4 ° c 15 分間暗闇の中で細胞を区別の fluorophores の他の組み合わせ。
   2. セル ・ バッファーの 1 つの mL で一度陽性細胞を洗浄します。300 x g と 5 分の 4 ° C で遠心し、上澄みを廃棄します。セル ・ バッファーの 300 μ L で再懸濁し、流れの cytometer および標準的な方法を使用してサンプルを取得します。ゲート ライブ リンパ球 [B220⁺の細胞と最後に CD23^低CD21^高細胞 (図 1 b)。
      注: 手順は通常 C57B/6 マウスから脾臓あたり 500,000 MZBs を得られます。
5. MZBs フロー移行の準備をします。
   1. 洗浄は、1-2 mL の移行の陽イオンを含むバッファーが残留イオン無料 PBS バッファーによって希釈されていないことを確認する [ハンクス平衡塩溶液 (HBSS) 含んでいる陽イオン、10 mM Hepes、0.2% 脂肪酸無料 BSA] コールド マイグレーション バッファーに一度 MZBs を精製しました。300 x gと 10 分のための 4 ° C で遠心し、上清を捨てます。再コールド移行 (フロー チェンバー スライドの 1 つの井戸で読み込まれている量に相当) 30 μ L あたり 50,000 MZBs の濃度バッファーで MZBs は中止します。
      注: 新鮮単離 MZBs をできるだけ早く使用する必要があります。しかし、彼らはまだ彼らは氷で保たれる限り、実験開始後 8 h 以上の移行が可能です。最適な温度は、他の細胞型のテスト必要があります。たとえば、移行の開始までの 37 ° C で培養 T 細胞を保つためにより良い場合があります。

(2) フロー実験

1. インテグリンのリガンドでコート スライド。
   1. 実験の前に日に雪解けの ICAM-1 (400 μ G/ml)。ICAM 1 を最終濃度 5 μ G/ml に達するに PBS で 1/80 の要因によって希釈します。必要なすべての移行の映画の流れスライドに一室に ICAM 1 の 30 μ L を追加します。4 ° C、湿気の多い室内でのスライドを一晩インキュベートします。
      注: 各スライド 6 室を含む、1 つのセッションで 8 映画まで簡単に記録できます。
2. コーティングの井戸をブロックします。
   1. 実験の日、1 つの井戸に 100 μ L の PBS を追加し 100 μ L を脱退、商工会議所の他のお部屋を洗ってください。室のブロック バッファー (PBS で BSA 脂肪酸無料 2%) 100 μ L を追加し、1.5 時間常温湿気の多い室内でスライドを孵化させなさい。
   2. 1 つも、商工会議所に、その他も、その後、追加の 100 μ L 移行バッファー脱退に 100 μ L の PBS を追加して商工会議所を洗います。実験まで、常温の湿気のある商工会議所で、スライドを保存します。
3. 流体工学ユニットを準備します。
   1. 流体ポンプをつないで、流体工学ユニットを取り付けて、ポンプ ソフトウェアを有効に。5-10 mL の移行バッファー、一度チューブを洗浄し、両方の貯水池に 11.7 mL の移行バッファーを同じように追加、空気の泡を削除します。
   2. コネクタ部分から約 10 cm のチューブをクランプします。顕微鏡を温水インキュベーション室に流体の単位を配置します。
   3. ソフトウェアの「μ スライド VI 0.4」にスライド選択と「白」チューブを設定します。必要な剪断応力 (例えば、4 dyn cm^-2) を設定します。イメージングの時間を 30 分に設定します。
   4. ML/分測定チューブ 2 mL の他の 1 つの貯水池からの流れし、2 で除算するバッファーに必要な時間を通過する流量を決定することによりチューブ キャリブレーション係数を設定します。精度のための少なくとも 4 の測定を行います。ポンプ ソフトウェアに値を入力することによって所望の流量と剪断応力を設定するのに実際の流れの率を使用します。
4. イメージング システムを準備します。
   1. 中古顕微鏡インキュベーション室、流体工学単位、および 37 ° c (図 2 b) 移行バッファー因数を温めます。テスト システムの移行バッファー フロー貯水池で来たりして、空気がないことを確保することによって流体のポンプの泡します。
5. スライドをロードセルします。
   1. エタノールで湿らせたティッシュでスライドの下をきれいに。商工会議所の一つのウェルに細胞懸濁液の 30 μ L を追加し、他の井戸から 30 μ L を撤回します。添付するセルを許可する 30 分の 37 ° C で蒸発を防ぐためにカバーをスライドを孵化させなさい。
   2. ゆっくりと正メニスカスが井戸から昇るまで流れチェンバー スライドの各ウェルに予め温めておいた移行バッファーを追加し、ピペット チップと空気の泡を削除します。
6. スライドを流体工学ユニットに接続します。
   1. 顕微鏡ステージにスライドをクランプします。コネクタ部分から流体のチューブのマークされていない側を削除し、気泡なし正メニスカスが終わりから上昇するまで移行バッファーと端を記入します。
   2. 上管の終端を反転し、ティッシュでこぼれたバッファー掃討流れ区域の上の井戸の中に挿入します。クランプ管を維持しながらチューブのマークの最後の手順を繰り返します。
7. 細胞をイメージします。
   1. セルにフォーカスを設定する「ライブ」には、イメージング システムを切り替えます。スライドの中央にある場合は、ビューのフィールドを選択します。デフォーカスわずかにセルの黒のアウトラインを強化、どちらられる自動追跡プログラムで使用するための白い背景の上の円形の黒い細胞形状にすることができますし、白のインテリアを作り出す細胞。
   2. 画像のシーケンス プログラムを起動し、レコード 1 イメージごとの 5 s 乾燥系対物レンズ × 10 を使用して 30 分。チューブからクランプを外し、非付着性のセル洗浄し、付着性のセルが移行し始めるが、ポンプを回します。30 分または長く目的として目的 x 以上の 10 を使用してのイメージです。映画にラベルを付けて保存します。
8. スライドから流体の単位をデタッチします。
   1. イメージング プログラムの最後に、次の実験のためのポンプをリセット: チューブにクランプを再添付、チューブをスライドから削除、コネクタ部分を再アタッチ、クランプを開き、ポンプの手動のコントロールを使用して、1 つの引当からいくつかの mL のバッファーをプッシュ空気の泡を削除する他に oir。再クランプを接続し、次の映画の顕微鏡ステージ上クランプ管を置きます。
      注:プロトコルをここに休止無限にできます。阻害薬や、その作用によって、細胞の移動の修飾子を使用している場合は、細胞懸濁移行室セトリングする前にまたは流体の単位移行バッファーに追加します。

3. 移行経路分析

注:MTrack2 プラグインを使用して自動的にセルを追跡することができますまたは手動追跡プラグイン¹⁷を使用して手動で。自動やすくしきい値のセルの画像白の背景に黒のオブジェクトにこれらの細胞は、主にラウンド移行中、このまま、MZBs とうまく動作を追跡します。他の細胞型を使用、培養など、困難にエッジを定義するこれらの細胞が移行中に伸ばし、やや透明になるので cd 8 + の T 細胞を活性化、自動追尾が難しくなります。この場合、(1) のいずれかのセルがどちらられる白い背景および画像領域分割とエッジ検出をすることができますよう、セルのアウトラインを作成する (2) その他のプログラム オブジェクトの黒を表示することができる画像を生成する内重要な蛍光色素を汚すことができます。使用されます。手動追跡はセル アウトラインの高コントラストの画像を生成するとき、役に立つオプションは利用できません。

1. プラグインを使用して手動の追跡を実行します。
   1. ImageJ で「手動追跡」プラグインをインストールし、、ImageJ で映画を開きます。「マニュアル管理」メニューの下「新しいトラックを追加」を選択します。フレームに自動的に映画が進むにつれてセルの中央をクリックします。フレーム毎にセルを選択すると、選択"新しいトラックを追加"新しいセル、次の開始に。
   2. トラックが記録された後は、データがスプレッドシートに出力結果をコピーします。小数点以下にゼロの場所にすべてのスプレッドシートのセルの小数点表示の書式を変更します。その後の分析」タブ ストップで区切られた".txt ファイルとしてファイルを保存します。
      注:通常、50-100 個の細胞は追跡されますが、完了約 240 フレームの 20 分の映画のために約 1 時間かかります。
2. MTrack2 プラグインを使用して自動追跡を実行します。ダウンロードしてファイル (参照補足符号化ファイル) で指示に従って MTrack2 kt プラグインをインストールします。
   1. しきい値細胞移行映画からの画像。ImageJ では、画像のスタックを開きます。プロセスからビデオを変換する ImageJ で画像の高コントラストな画像 (図 3 a) 白の背景に黒のオブジェクトとしてセルを表示する色します。
      1. 2 回、画像をシャープ、輪郭以外をぼかす、画像、画像を 8 ビットに変換します。選択、"画像 |明るさ/コントラストを調整」サブメニューと入れて最大コントラスト [コントラスト] スライダー、セルは黒の背景に白のオブジェクトとして表示されます。選択、"画像 |しきい値を調整する"セルが白の背景に黒のオブジェクトとして表示されることを確認するサブメニュー。
   2. 自動細胞をプラグイン「MTrack2 kt」を追跡を実行 (符号化する補足のファイルを参照してください)。オプション画面で、次のパラメーターを設定します。
      1. 設定 1 ピクセルの最小の粒子径や粒子サイズ最大 30 ピクセルの MZBs の。
      2. 速度 (映画の連続するフレームの 2 粒子間の最大距離)、スライドの細胞密度が高い場合この値を低く設定トラックを避けるために「ジャンプ」1 つのセルから別に。MZBs の MZBs が一般に 5 連続するフレームの 2 ピクセルを超えないが 10 ピクセル、外れ値をキャプチャするためにこの値を設定 s 離れて。
      3. 追跡するために、パーティクルはフレームの最小数は、MZBs の映画のフレームの数でこの値を設定 (例, 240) 12 フレーム/分と 20 分の映画のため。ただし、セルの高速なイメージングの終わりの前にビューのフィールドを離れる場合は映画の期間未満でフレームの最小数を設定します。たとえば、T 細胞の高速移動とイメージングの 5-10 分の同等の最小数を設定します。
         注: (閾値と MTrack2 kt) の手順のこの部分を自動化し、時間を節約するこれらの手順をマクロに記録 (符号化する補足のファイルを参照してください)。マクロを使用して自動的に ImageJ で映画を追跡する分未満かかります。
   3. データがスプレッドシートに出力結果をコピーします。小数点以下にゼロの場所にすべてのスプレッドシートのセルの小数点表示の書式を変更します。スプレッドシートのセルのトラックの先頭に空の行を追加し、"D"列を削除します。Ibidi 走化性ツールの後の分析のための「タブ ストップで区切られた」.txt ファイルとしてファイルを保存します。
      注:MTrack2 プラグインは、75 の平行列の行でセル トラックを出力します。Ibidi 走化性ツールの分析、細胞トラックは単一の列でなければなりません。いずれかの出力に変更された MTrack2 プラグイン出力を変換する元の形式でまたは単一の列(図 3 b)として (補足符号化ファイル「kt MTrack2」、Java で書かれているを参照してください)..Java ファイルを ImageJ プラグインのフォルダーにコピーします。ImageJ でプラグイン > コンパイルし、「実行」を選択します。再起動 ImageJ と MTrack2 の修正版は、プラグイン メニューに表示されます。
3. Ibidi 走化性ツールとセル トラックを分析するには、Ibidi 走化性と移行ツール v2.0 (「スタンドア ローン」) をダウンロードしてプログラムを開きます。
   1. 「データのインポート」を選択し、、セル トラックの .txt ファイルに移動。同時に複数のファイルを選択できます。インポートされたファイルは、赤で「データセット」ペインに表示されます。それらのすべてを選択し、次の設定を適用するには下の「初期化」メニューで正しい値を入力します。
   2. 正確な数またはスライス (映画内のフレームの数) の数の範囲のいずれかを入力します。
   3. 校正メニューで (X/Y 校正)、ピクセルのサイズを入力します。ムービーのプロパティ ファイルでこの情報を検索します。MZBs、1.14 μ m のピクセル サイズを与える 10 × 対物が使用されます。「校正メニュー |時間間隔を"、映画のフレーム間の時間の長さを入力します。
   4. 設定を適用します。「データのプロット」を選択トラック プロットを表示しトラック ファイルを開くことを確認します。トラックを異なるプロパティに基づく別の色でマーキングを含むプログラムのドキュメントに記載されており移行を転送速度、個々 または平均値を表示するこの時点から、多くのオプションが利用可能インデックス、率直さ、および多く (図 3 b)。
      注:MZBs は、検出してセルの流れ進むポイントに彼らのインテグリン錯体を分極することによっておそらくフローに対応する約 10 分を取る。時間をかけて移行指数のグラフ 0、セルは前方移行のインデックス値が正まで上向きが徐々 に上昇が続く流れにさらされている分の最初のカップルに対応する以下の初期ドロップが表示されます。したがって、しない限り、このプロセスは興味の最終的な計算でこれらの最初の分を除外する最適なことがあります。

結果

ICAM 1 コーティング スライド (0 dyn/cm²) の流れのない MZBs の移行を比較する上記プロトコルを使用し、せん断流れ (4 ディン/cm²) にさらされます。セルは、フローはありません (0 dyn/cm²) と (4 ディン/cm²) 分布を示すことの細胞移行映画、トラック (図 4 a) の形で MTrack2、およびファイルが覆われた結果の追跡で自動的?...

ディスカッション

せん断流の力を検出し、その移行を変えることによって反応する細胞の移動を分析するための方法をご紹介します。MZBs の分析は示した MZBs が ICAM 1、フローの存在下で自発的に移行、流れに移行されます。我々 の以前の仕事では、MZBs は VCAM 1 の流れを移行しないが、代わりに場所は固定されたままを示した。マウスの脾辺縁帯には、赤脾髄には、icam-1 および VCAM 1 が含まれていますがの ICAM...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm	VWR	10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm	Miltenyi	130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit	Miltenyi	130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC	Biolegend	103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC	BD Biosciences	558658
CD23, clone B3B4, PE	Biolegend	101608
HBSS	Biochrom	L2035
D-PBS 1x	Gibco by Life Technologies	14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free	Roth	"0052.3"
ICAM-1	R&D Systems	796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated	Ibidi	80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm	Ibidi	10963
Ibidi Pump system	Ibidi	10902