小鼠边缘区 b 细胞剪切流诱导迁移的体外分析

摘要

边缘区 b 细胞 (mzb) 通过调整其迁移路径的方向来响应剪切流的力。该协议演示了如何使用流体单元、泵、显微镜成像系统和自由软件记录和分析迁移。

摘要

边缘区 b 细胞 (mzb) 是一种 b 细胞的群体, 它们位于包裹毛囊的小鼠脾边缘区。要到达毛囊, mzb 必须迁移血液流动的剪切力。本文提出了一种分析这种流动诱导的 mzb 体外迁移的方法。首先, mzb 从小鼠脾脏中分离出来。其次, mzb 在流动室滑块中的整合素配体上进行了确定, 暴露在剪切流中, 并在迁移过程中在显微镜下成像。第三, 迁移 mzb 的图像使用 imagej 的 mtrack2 自动单元跟踪插件进行处理, 并使用 ibidi 趋化工具对生成的单元跟踪进行量化。迁移数据揭示了细胞移动的速度、它们改变方向的频率、剪切流矢量是否影响其迁移方向以及涉及哪些整合素配体。虽然我们使用 mzb, 该方法可以很容易地适应分析任何白细胞的迁移, 响应剪切流的力量。

引言

免疫细胞是人体中运动最强的细胞, 往往必须与血液和淋巴流动的剪切力抗衡。然而, 关于白细胞^{1、2、3、4、5}的剪切力诱导迁移的研究相对较少。我们在这里提出了一个可靠的定量协议, 以分析免疫细胞在体外流动的反应。执行检测不需要制造组件, 所有设备和耗材均可在市场上获得。该协议, 包括细胞纯化和迁移分析, 可以在一天内完成。最后, 尽管我们描述了边缘区 b 细胞 (mzb) 的迁移, 但该协议可以用来分析其他类型免疫细胞的迁移。因此, 使用该方法系统地分析广泛的白细胞, 并对其进行全面的条件分析是可行的。

mzb 是 b 细胞的群体, 在小鼠体内, 仅存在于毛囊内部和边缘区 6^、7、8、9之间的脾脏和穿梭。边缘区域是一层大约5-10 个厚的免疫细胞。细胞层包裹毛囊, 主要由 mzb 和巨噬细胞组成, 但也包括不变的自然杀手 t (inkt) 细胞、树突状细胞 (dc) 和中性粒细胞等¹⁰。边缘区域的细胞暴露在来自脾动脉的单向血流中, 这些血流终止于卵泡周围的边缘窦。血液从边缘窦的洞中通过边缘区域流动, 然后收集在红色果肉中的静脉窦, 并恢复到循环¹¹。血液的自由流动在 mzb 上冲走, 使它们暴露在血液中携带的抗原中。mzb 通过在边缘区域和毛囊内部之间自动穿梭, 将抗原带入毛囊, 而毛囊不受血液影响。因此, 当 mzb 向毛囊穿梭时, 它们必须迁移血流12的剪切力 (图 1a).

在这个协议中, 我们描述了如何定量地确定免疫细胞 (如 mzb) 在体外对无流动或高流量的反应, 以揭示它们是如何被编程在体内迁移的。在第一步中, mzb 从老鼠脾脏中纯化, 使用磁珠与市售试剂盒中的抗体结合。新隔离的 mzb 被引入流动室滑块的井中, 允许安装在整合素配体上, 并使用泵系统暴露在迁移缓冲流中 (图 2 a)。这些细胞是使用延时视频显微镜系统成像的。然后使用免费的 imagej 插件 mtrack2 13, 14^对图像进行分析, 以自动跟踪细胞。然后, 可以使用免费的 ibidi 趋化工具¹⁵对轨迹进行量化, 以确定各种参数, 包括速度、直线度和迁移指数。这些值可用于确定迁移抑制剂、细胞刺激器、趋化因子和其他影响迁移的化学品对剪切流诱导迁移的影响, 以了解控制体内免疫细胞运动的力量。

研究方案

根据马格德堡 ovgu 大学医学院医学院的所有准则, 所有涉及使用动物的实验都已得到德国萨克森-安哈勒 (萨克森-安哈尔特) 的批准。

1. mzb 细胞纯化

1. 分离白细胞。
   1. 牺牲8到16周龄的老鼠, 切除脾脏¹6。将脾脏分解为5毫升的冰凉细胞缓冲液 [磷酸盐缓冲盐水 (pbs) + 0.5% 无脂肪酸的牛血清白蛋白 (bsa)], 方法是使用组织分离器或将脾脏轻轻捣碎在一个70μm 的细胞滤网中, 进入6孔的井用5毫升注射器的柱塞
   2. 将细胞缓冲液中的细胞转移到15毫升的锥形管中。通过在井内的组织分离管或尼龙网中添加另外5毫升的冰凉细胞缓冲液来收集额外的细胞。将额外的5毫升细胞缓冲液加细胞转移到锥形管。在室温 (rt, 20°c) 下, 以 300 x g 离心 10分钟, 并丢弃上清液。
2. 进行红血球裂解。
   1. 在预加热 rt 的红细胞 (rbc) 裂解缓冲液 (150 mL nh4 cl, 10 mmkhco 3, 0.1 mm edta₎中重新悬浮细胞颗粒. 添加 1.5 ml 的红细胞裂解缓冲液和旋流混合。在 rt (20°c) 下长期孵化 2分钟, 包括重新悬浮颗粒所需的时间。
   2. 在细胞悬浮液中加入7.5 毫升的冰凉细胞缓冲液, 以停止裂解。以 300 x g和4°c 离心 10分钟, 并丢弃上清液。
   3. 在1毫升的细胞缓冲液中重新悬浮细胞颗粒, 并添加额外的9毫升细胞缓冲液。将 10 ml 细胞悬浮通过30μm 预分离过滤器插入新的 15 ml 锥形管, 以去除细胞碎片。
   4. 以 300 x g和4°c 离心细胞 10分钟, 并丢弃上清液。在500μl 的细胞缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。在手术的所有后续步骤中保持细胞的低温, 直到在流动室中孵育。
3. 净化 mzb。
   1. 从商业上可获得的针对所有不需要的细胞的试剂盒中添加50μl 的生物素偶联抗体, 包括 cd43 (在非 b 细胞上)、cd4 (在 t 细胞上)、cd93 (在未成熟的 b 细胞上) 和 ter119 (在红细胞上), 添加到锥形管中的细胞悬浮液中。轻轻摇晃或滑动管子混合, 但不要使细胞产生旋涡。将锥形管放在冰床上, 以几乎平坦的角度铺设, 在25转/分的情况下将岩石放置15分钟。
   2. 在细胞悬浮液中加入总体积为100μl 的磁性微珠, 并与抗生物素抗体结合。继续在25转/分的冰上摇晃细胞悬浮液 20分钟, 通过添加5毫升的细胞缓冲液, 在 300 x g和4°c 离心 10分钟, 并丢弃上清液, 清洗细胞。在1毫升的细胞缓冲液中重新悬浮细胞。
   3. 通过将磁珠耦合细胞保留在磁柱上, 使其具有细胞悬浮。丢弃标记的细胞 (所有非 b 细胞和未成熟的 b 细胞)。将未标记的细胞 (成熟 b 细胞) 收集在一个15毫升的锥形管中, 该锥形管已预先涂覆了5毫升的细胞缓冲液, 以防止 mzb 的非特异性粘附。
   4. 用5毫升的细胞缓冲液清洗细胞悬浮液。以 300 x g和4°c 离心 10分钟, 并丢弃上清液。在90μl 的细胞缓冲液中重新悬浮细胞, 并添加10μl 的抗 cd23 耦合珠子。岩石细胞在25转/分的冰上轻轻悬浮20分钟。
   5. 用5毫升的细胞缓冲液清洗细胞悬浮液。以 300 x g和4°c 离心 10分钟, 并丢弃上清液。在1毫升的细胞缓冲液中重新悬浮细胞。
   6. 通过将磁珠耦合细胞保留在磁柱上, 使其具有细胞悬浮。丢弃标记的单元格 (滤泡 b 细胞)。收集非标记细胞 (mzb), 在一个15毫升锥形管, 已预先涂覆了5毫升的细胞缓冲液。取出50μl 的细胞进行计数和检查纯度。
4. 将分拣后的 mzb 染色, 以检查其纯度。
   1. 在50μl 中将10% 的 fc 块体积 (5μl) 添加到 10, 000个细胞中, 在4°c 孵育 5分钟. 添加50μl 电池缓冲液, 每种含有0.3μl 的 b220-fitc (0.15 微克)、cd21-pe (0.15 微克) 和 cd23-apc (0.15 微克), 总体积为 105μl (每个抗体稀释 1:350), 或用于区分滤泡 b 细胞和 mzb 的任何其他荧光体组合. 在4°c 的黑暗中将细胞染色15分钟。
   2. 用1毫升的细胞缓冲液清洗染色细胞一次。以 300 x g 和4°c 离心 5分钟, 并丢弃上清液。在300μl 的细胞缓冲液中进行再利用, 并使用流式细胞仪和标准方法采集样品。门在活淋巴细胞上, 然后在 b220^{+ 细胞}上, 最后在 cd23^低cd21^高细胞上 (图 1 b)。
      注: 该过程通常产生 50万 mzb 每个脾脏从 c57b6 小鼠。
5. 准备用于流迁移的 mzb。
   1. 在1-2 毫升的冷迁移缓冲液中清洗一次纯化的 mzb [habs 的平衡盐溶液 (hbss), 含有阳离子, 10 mm hes, 0.2% 无脂肪酸 bsa], 以确保含有阳离子的迁移缓冲液不会被残留的无 cations pbs 缓冲液稀释。以 300 x g和4°c 离心 10分钟, 并丢弃上清液。将 mzb 重新悬浮在冷迁移缓冲液中, 浓度为每 30μl 50, 000 mzb (相当于在流动室滑梯的井中装载的量)。
      注: 应尽快使用新隔离的 mzb。然而, 只要他们被放在冰上, 在实验开始后, 他们仍然能够迁移长达8小时或更长时间。应针对其他电池类型测试最佳温度。例如, 最好将培养的 t 细胞保持在 37°c, 直到迁移开始。

2. 流动实验

1. 用整合素配体涂布。
   1. 在实验前一天, 解冻 icam-1 (400μgml) 的脂肪。在 pbs 中稀释 icam-1 1:80, 使其最终浓度达到5μg/ml。为每个所需的迁移影片, 将 icam-1 的30μl 添加到流幻灯片上的一个室。在4°c 的潮湿室内内进行隔夜滑行。
      注: 每张幻灯片包含6个室, 一次最多可以录制8部电影。
2. 堵塞涂层井。
   1. 在实验当天, 通过在一个井中加入100μl 的 pbs 并从腔内的另一个井中提取100μl 来清洗腔室。将100μl 的阻滞剂 (pbs 中2% 无脂肪酸 bsa) 添加到室内, 并在 rt 潮湿的室内孵育滑块1.5 小时。
   2. 将100μl 的 pbs 加入一口井, 将其从另一口井中取出, 然后将100μl 的迁移缓冲液加入腔内, 将其清洗。将幻灯片存放在 rt 潮湿的室内, 直到进行实验。
3. 准备流体单元。
   1. 插入流体泵, 连接流体装置, 然后打开泵软件。用5-10 毫升的迁移缓冲液清洗油管一次, 然后将11.7 毫升的迁移缓冲液均匀地添加到两个储层中, 并去除气泡。
   2. 将管道夹紧, 距离连接件约10厘米。将流体单元放置在显微镜上的加热培养室中。
   3. 将幻灯片选择设置为 "μ-幻灯片 vi 0.4", 将管道设置为 "白色"。设置所需的剪切应力 (例如, 4 dyn cm-2).将成像时间设置为30分钟。
   4. 通过在 ml/min 中确定通过油管的流量来设定油管校准系数, 测量缓冲液从另一个储集层流动所需的2毫升所需的时间, 并除以2。为精度至少进行4次测量。使用实际流量通过在泵软件中输入值来设置所需的流速和剪切应力。
4. 准备成像系统。
   1. 预热显微镜孵化器、流体单元和迁移缓冲液等价物至 37°c (图 2b)。通过确保迁移缓冲液在储层中来回流动, 并确保系统中没有气泡, 对流体泵进行测试。
5. 加载幻灯片上的单元格。
   1. 用乙醇受震的组织清洁滑梯底部。将细胞悬浮液的30μl 加入腔内的一个井中, 并从另一个井中提取30μl。用盖子对滑块进行加氢, 以防止在37°c 下蒸发 30分钟, 使细胞连接。
   2. 慢慢地将预热的迁移缓冲器添加到流动室的每口井中滑动, 直到正半月板从井中升起, 并去除带有移液器尖端的任何气泡。
6. 将幻灯片连接到流体单元。
   1. 将幻灯片夹紧到显微镜阶段。从连接器件中取出流体管的未标记的一侧, 并在末端填充迁移缓冲器, 直到没有气泡的正半月板从末端升起。
   2. 将油管的末端翻转过来, 并将其插入流动室的顶井, 用纸巾清除溢出的缓冲液。在保持油管夹紧的同时, 重复管道的标记端的过程。
7. 对单元格进行图像。
   1. 将成像系统切换到 "现场", 将焦点设置在细胞上。选择幻灯片中间的视域。稍微将细胞的焦点稍微失去焦点, 以增强细胞的黑色轮廓, 并产生白色的内部, 然后将其脱粒成白色背景上的圆形黑色细胞形状, 用于自动跟踪程序。
   2. 启动成像序列程序, 并使用10倍干目标每5秒记录1张图像, 时间为30分钟。从油管中取下夹子, 打开泵, 然后非粘附细胞就会被洗掉, 粘附细胞就会开始迁移。使用10倍或更高的目标 (如需) 30秒或更长时间的图像。标记并保存影片。
8. 从幻灯片中分离流体单元。
   1. 在成像程序结束时, 为下一个实验重置泵: 将夹具重新连接到管道上, 从滑块上取下管道, 重新连接连接器件, 打开夹具, 并使用泵的手动控制, 从一个附件推送几个 ml 的缓冲器对另一个去除泡泡。重新连接夹子, 并将夹紧的导管放置在显微镜舞台上, 以便拍摄下一部电影。
      请注意:协议可以在此处无限期暂停。如果使用细胞迁移的抑制剂或修饰剂, 根据其作用方式, 将其添加到细胞悬浮液, 然后在迁移腔中定居, 或添加到流体单元中的迁移缓冲液中。

3. 迁移轨迹分析

请注意:可以使用 mtrack2 插件自动跟踪单元格, 也可以使用手动跟踪插件¹⁷手动跟踪单元格。自动跟踪与 mzb 配合良好, 因为这些单元格主要是圆形的, 并且在迁移时保持这种方式, 因此很容易将单元格的图像阈值为白色背景上的黑色对象。如果使用其他细胞类型 (如培养的、激活的 cd8 + t 细胞), 则自动跟踪会更加困难, 因为这些细胞在迁移过程中会拉伸并变得有些透明, 因此很难定义边缘。在这种情况下, (1) 细胞可以用生命内荧光染料染色, 以产生图像, 这些图像可以被测短, 以显示白色背景上的黑色物体, 或者 (2) 其他程序来勾画细胞, 如图像分割和/或边缘检测。使用。当无法生成单元格轮廓的高对比度图像时, 手动跟踪是一个有用的选项。

1. 使用插件执行手动跟踪。
   1. 在 imagej 中安装 "手动跟踪" 插件, 并在 imagej 中打开影片。在 "手动跟踪" 菜单下, 选择 "添加新跟踪"。当影片自动逐帧生成时, 单击单元格的中心。在每个帧中选择单元格后, 选择 "添加新轨道" 以开始跟踪新单元格。
   2. 记录轨道后, 将输出结果复制到数据电子表格中。将所有电子表格单元格的十进制显示格式更改为小数点后的零位置。将该文件另存为 "选项卡停止分隔". txt 文件, 以供后续分析。
      请注意:通常情况下, 跟踪50–100个单元格, 大约需要1小时才能完成约240帧的20分钟电影。
2. 使用 mtrack2 插件执行自动跟踪。根据文件中的说明下载并安装 mtrack2 kt 插件 (请参阅补充编码文件)。
   1. 阈值单元格迁移影片中的图像。在 imagej 中打开图像堆栈。处理 imagej 中的图像, 将视频从彩色图像转换为高对比度图像, 将单元格显示为白色背景上的黑色对象 (图 3 a)。
      1. 锐化图像两次, 消除图像, 并将图像转换为8位。选择 "图像"调整明亮/对比度 "子菜单, 并将对比度滑块放在最大对比度, 然后单元格将显示为黑色背景上的白色对象。选择 "图像"调整阈值 "子菜单, 以确保单元格在白色背景上显示为黑色对象。
   2. 运行自动单元跟踪插件 "mtrack2 kt" (请参阅补充编码文件)。在选项屏幕上设置以下参数。
      1. 为 mzb 将粒径最小值设置为1个像素, 将粒径设置为最大30像素。
      2. 对于速度 (影片连续帧上的2个粒子之间的最大距离), 如果幻灯片上的单元格密度较高, 请将此值设置为较低, 以避免轨道从一个单元格 "跳转" 到另一个单元格。对于 mzb, 将此值设置为10像素以捕获异常值, 但在相距5秒的连续帧上, mzb 通常不会超过2个像素。
      3. 对于必须跟踪粒子的最小帧数, 请将此值设置为 mzb 电影中的帧数 (例如, 240), 对于具有12个帧/分钟的20分钟电影。但是, 如果单元格的速度足够快, 可以在成像结束前离开视场, 则将最小帧数设置为小于影片的持续时间。例如, 对于快速移动的 t 细胞, 将最小数量设置为相当于5-10 的成像。
         注: 记录这些步骤的宏 (阈值和 mtrack2-kt), 以自动执行这部分过程并节省时间 (请参阅补充编码文件)。使用该宏在 imagej 中自动跟踪影片只需不到一分钟。
   3. 将输出结果复制到数据电子表格中。将所有电子表格单元格的十进制显示格式更改为小数点后的零位置。在电子表格中单元格轨道的顶部添加一个空行, 并删除 "d" 列。将该文件另存为 "选项卡停止分隔". txt 文件, 以便在 ibidi chemotaxis 工具中进行后续分析。
      请注意:mtrack2 插件以75列的行输出单元格轨道。为了在 ibidi 趋化工具中进行分析, 单元轨道必须在单个列中。为了转换输出, mtrack2 插件被修改为以原始格式或作为单个列输出(图 3b) (请参阅以 java 编写的补充编码文件 "mtrack2 kt")。将. java 文件复制到 imagej 插件文件夹。在 imagej 中, 选择 "插件 & gt; 编译并运行"。重新启动 imagej, 修改后的 mtrack2 版本应显示在 "插件" 菜单中。
3. 要使用 ibidi 趋光工具分析细胞轨迹, 请下载 ibidi 趋化工具 v2.0 ("独立") 并打开程序。
   1. 选择 "导入数据" 并导航到. txt 单元格跟踪文件。可以同时选择多个文件。导入的文件以红色显示在 "数据集" 窗格中。选择所有这些设置, 并在下面的 "初始化" 菜单中输入正确的值, 以应用以下设置。
   2. 输入切片数的确切数量或范围 (影片中的帧数)。
   3. 在 "校准" 菜单 (x/y 校准) 中, 输入像素的大小。在影片的属性文件中找到此信息。对于 mzb, 使用了10倍的目标, 其像素大小为1.14 微米。在 "校准菜单" 中时间间隔 ", 输入影片中帧之间的时间长度。
   4. 应用设置。选择 "绘制数据" 以查看跟踪图, 并确认将打开轨道文件。从这一点上, 有许多选项可供选择, 这些选项在程序的文档中进行了描述, 包括根据不同的属性用不同的颜色标记轨道, 并显示速度、向前迁移的单个或平均值索引、直接性等 (图 3b)。
      请注意:mzb 大约需要10分钟的时间来检测和响应流动, 大概是通过将它们的整合蛋白复合物极化到细胞的流动前点。随时间推移的迁移指数图将显示初始下降到零以下, 对应于细胞暴露在流动中的前几分钟, 然后逐渐向上上升, 直到向前迁移指数值为正。因此, 最好在最后计算中排除这些前几分钟, 除非对这一过程感兴趣。

结果

我们使用上面概述的协议比较了 mzb 在 icam-1 涂层幻灯片上的迁移, 没有流动 (0 dyn/cm²), 暴露在剪切流 (4 dyncm2) 中。使用 mtrack2 自动跟踪细胞, 并在无流动 (0 dyn/2) 和 (4 dyn/cm 2) 的细胞迁移电影上覆盖生成的轨道文件, 以显示轨道的分布和形状 (图 4a)。然后将单元轨道导入到 ibidi 趋化工具 (ict) 中, 以生成每部电影的跟踪情...

讨论

我们在这里描述了一种方法来分析细胞的迁移, 检测剪切流的力量, 并通过改变它们的迁移来响应。对 mzb 的分析表明, mzb 在 icam-1 上自发迁移, 在流动的情况下, 会向上迁移流动。在前面的工作中, 我们展示了 mzb 不会在 vcam-1 上向上迁移流, 而是保持固定在适当的位置。小鼠脾边缘区主要含有 icam-1, 而红浆中含有 icam-1 和 vcam-1。从这些数据中可以推断, mzb 会在边缘区向上迁移流动, 但不会在红色纸浆...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR Cell Strainer, 70 µm	VWR	10199-656
Pre-Separation Filters, 30 µm	Miltenyi	130-095-823
MZB and FOB cell isolation kit	Miltenyi	130-100-366
B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC	Biolegend	103206
CD21 / CD 35, clone 7G6, APC	BD Biosciences	558658
CD23, clone B3B4, PE	Biolegend	101608
HBSS	Biochrom	L2035
D-PBS 1x	Gibco by Life Technologies	14190-094
BSA albumin fraction V, fatty acid-free	Roth	"0052.3"
ICAM-1	R&D Systems	796-IC-050
Ibidi µ-slides VI 0.4, hydrophobic, uncoated	Ibidi	80601
Perfusion set, white, 50 cm, 0.8 mm	Ibidi	10963
Ibidi Pump system	Ibidi	10902