逆電子需要ディールス ・ アルダー反応に基づく pretargeted 放射免疫療法

要約

このプロトコルは合成とトランスcyclooctene (TCO) の特性について説明します-pretargeted 放射免疫療法 (した) の¹⁷⁷Lu ラベル tetrazine (Tz) リガンド抗体を変更します。さらに、それは体内体内分布および大腸癌のマウスモデルにおける縦断的療法研究のこれらの 2 つの構成要素の使用を詳しく説明します。

要約

放射免疫療法 (RIT) は、がんの治療のための有望なアプローチは、放射線標識抗体を長い間薬物動態学的半減期は、健康な組織に高線量で起因できます。おそらく驚くことではないが、この厄介な制限を回避するためにいくつかの異なる方法が開発されています。これらのアプローチの最も有望な 1 つは、pretargeted の放射免疫療法 (した) です。した免疫グロブリンから放射性核種を分離、個別にそれらを注入して、それらをできるように体内の標的組織に結合する前提です。このアプローチの薬物動態学的欠点を幅木、それにより非標的組織への放射線量を下げると、半減と放射性核種の使用を促進している間の抗体の例外的な腫瘍ターゲット プロパティをハーネスします。伝統的な radioimmunoconjugates のための短すぎる使用と見なされます。過去 5 年間、当研究室および他は体内pretargetingトランス- cyclooctene (TCO) と tetrazine (Tz) の間逆電子需要ディールス ・ アルダー (IEDDA) 反応に基づく方法開発しました。この戦略は、pretargeted 陽電子放射断層撮影 (PET) に正常に適用されている単一光子放射断層撮影 (SPECT) 抗体抗原のシステムの様々 なイメージングと。最近の出版物のペアで、我々 は IEDDA をベースした膵管腺癌と大腸癌のマウスモデルでの有効性を実証しました。¹⁷⁷Lu DOTA ラベル tetrazine リガンドを使用したため、このプロトコルで述べるプロトコル ([¹⁷⁷Lu] Lu DOTA ペグ₇- Tz) とターゲットに huA33 抗体 (huA33-TCO) 大腸癌の TCO 変更バリアント。具体的には、huA33、TCO、合成 [¹⁷⁷Lu] の radiolabeling Lu DOTA ペグ₇の建設について述べる - Tz と体内体内、縦療法学症マウスモデルでのパフォーマンス大腸癌。

概要

放射免疫療法 (RIT)-腫瘍に治療放射性核種の配信するため抗体の使用 — がん^1,2の治療に魅力的なアプローチはずっと。この約束は、非ホジキン リンパ腫の治療のための 2 つの radioimmunoconjugates の米国食品医薬品局の承認によって重要視されてきた: ⁹⁰Y に対するイブリツモマブ、 ¹³¹- トシツモマブ^3,4. その黎明からでも RIT の臨床見通しは、重要な合併症によって妨げられているまだ: 健全なティッシュ^5,6高放射線量率。一般的に言えば、RIT の radioimmunoconjugates は長寿命の放射性核種が付いています (例えば、 ¹³¹私 [t_½ = 8.0 日] ⁹⁰Y [t_½ = 2.7 日]) とうまく噛み合って物理の半減で、免疫グロブリンの長い薬物動態半生活。これは、その十分な放射能のまま抗体、循環の数日後、最適な体内に達するために不可欠です。しかし、この血液や長い物理半減の長い滞留時間の組み合わせは治療率を削減し、療法⁷の有効性を制限すること、健康な組織の照射で結果ないする必然的に。工場、工場など、切り捨てられた抗体フラグメントの使用を含む、この問題を回避するいくつかの方法が検討されている '、F(ab')₂結合、および nanobodies^8,9,10。最も有望な魅惑的な 1 つはまだ否定できない複雑な代替アプローチ体内pretargeting¹¹です。

Pretargeting生体内で核との薬物動態学的欠点^11,12,13をかすめながら絶妙な親和性と抗体の選択性を活用するように努める治療方法です。このため、伝統的な放射免疫療法で使用される放射性標識抗体は 2 つのコンポーネントに解体: 小分子リガンドと腫瘍抗原と前述の放射性リガンドの両方をバインドできる・免疫。・免疫最初注入と、' ヘッド スタート ' では、しばしばいくつかの日、それが標的組織に蓄積し、血液からクリアします。その後、小分子リガンドを投与とを組み合わせたもので、腫瘍・免疫か急速に体内から消去します。本質的には、生体内のpretargeting 自体体内放射を実行するのに依存します。放射能の循環を減らして、この方法は同時に健康な組織に放射線量を削減し、放射性核種の使用を容易 (例えば、 ⁶⁸Ga, t_½ = 68 分²¹¹;として、t_½ = 7.2 h) 半分の生活は通常抗体を用いたベクトルと互換性がないと見なされます。

1980 年代後半以降、一握り pretargeting生体内でさまざまなアプローチの開発されている、バイスペシフィック抗体、ストレプトアビジンとビオチンの相互作用に基づく戦略を含むとの相補的な交配オリゴヌクレオチド^{14,15,16,17,18}。まだそれぞれが戻って開催されて様々 な程度に強力な免疫抗体のストレプトアビジン変更^19,20の最も有名な合併症。過去 5 年間私達のグループと他の人は、生体内で迅速かつ bioorthogonal 逆電子需要ディールス ・ アルダー結紮トランスcyclooctene (TCO) と tetrazine (Tz)^{に基づく pretargeting へのアプローチを開発しています。21,22,23,24}。これらの戦略の中で最も成功した採用 TCO 変更抗体と Tz 軸受リガンド TCO は通常より安定した生体内でその Tz パートナー (図 1)^25,26より。他の pretargeting 方法のように、TCO のモノクローナル抗体・免疫は投与、循環からオフにし、腫瘍組織に蓄積する時間を与えています。その後、小分子 Tz リガンドの注入、その後ターゲット組織内・免疫をクリックしてか急速に体内から消去します。この体内の戦略を pretargeting が証明非常に効果的なペットと SPECT 複数の異なる抗体/抗原システム イメージングに一貫して高コントラストで画像を生成など短寿命放射性核種の使用を有効にします。¹⁸F (t_½ = 109 分) と⁶⁴Cu (t_1/2 = 12.7 h)^21,22,24。最近では、膵管腺癌 (PDAC) と大腸癌^27,28のマウスモデルでクリック ベース pretargeted 放射免疫療法 (した) の有効性を実証されています。このために、治療の放射性核種¹⁷⁷Lu (β_max = 498 keV、t_1/2 = 6.7 日) 2 つの異なる抗体と組み合わせて採用された: 5B1 PDAC で表される普遍的糖鎖抗原 19.9 (CA19.9) を対象とします。、A33 を対象とした huA33 膜貫通糖タンパクで表現される > 大腸癌の 95%。両方のケースで¹⁷⁷Lu したへのこのアプローチ高活性腫瘍組織内濃度が得られた、用量依存の治療効果を作成され、同時に従来と比較して健全なティッシュの放射能濃度を低減直接標識 radioimmunoconjugates。

¹⁷⁷Lu DOTA ラベル tetrazine リガンドを使用したため、この記事で述べるプロトコル ([¹⁷⁷Lu] Lu DOTA ペグ₇- Tz) と TCO 変更 huA33 抗体 (huA33-TCO) のバリアント。具体的には、huA33-TCO (図 2)、合成 [¹⁷⁷Lu] の radiolabeling Lu DOTA ペグ₇の建設について述べる - Tz (図 3および図 4) とin vivoのパフォーマンス体内分布および大腸癌のマウスモデルで縦断的治療研究。さらに、代表の結果と議論は、サンプル データ セット、このアプローチの最適化のためのアドレス可能な戦略を提示し、生体内でpretargeting としたのより広い文脈でこの戦略を検討してください。最後に、それは我々 が huA33 TCO と [¹⁷⁷Lu] を使用して pretargeting に集中する分野間 Lu DOTA ペグ₇- このプロトコルでは、この戦略では Tz は非常にモジュール、抗体の広い範囲に合わせて適応することがでくことが重要と放射性核種。

プロトコル

すべて生体内で動物実験に記載この作業を承認されたプロトコルに従って行ったし、メモリアルスローンケタ リングがんセンター、ワイル コーネル大学メディカル センター、ハンター カレッジの倫理的な指針の下で実行制度上のアニマル ・ ケアおよび使用委員会 (IACUC)。

1. huA33 TCO の準備

注: huA33 TCO の合成は、以前に報告された²⁹をされています。ただし、リーダー性、それで複製されますここで最適な条件の調整。

1. 1.7 mL 遠心チューブの準備 - cyclooct - 4 (E) の 125 μ L ソリューション-オキソシクロブチル 2, 5-dioxo-1-pyrrolidinyl (TCO NHS) を乾燥ジメチルホルムアミド (DMF) 40 mg/mL (0.15 M) の濃度の炭酸塩します。このソリューションは、避けようと今後の実験計画で使用するため-80 ° C で凍結することができます。
2. 別の 1.7 mL 遠心チューブで 1 ml リン酸緩衝生理食塩水 (PBS; 2.7 mM 塩化カリウム、塩化ナトリウム 137 mM、11.9 mM リン酸カリウム、pH 7.4) の huA33 の 5 mg/mL の溶液を準備します。
3. 小さい因数を使用して (< 5 μ L) 0.1 M Na₂CO₃、8.8 から 9.0 にステップ 1.2 から抗体溶液の pH を調整します。微小電極で ph 試験紙または pH メーターのいずれかを使用して pH を監視し、pH が 9.0 を超えないように注意します。
4. 手順 1.3 で説明した抗体溶液に徐々 に抗体の量を基準にして TCO NHS の 40 モル同等に対応するボリュームを追加します。たとえば、huA33 の 5 mg (30 nmol) がソリューションにある場合は、TCO NHS の 40 mg/mL (0.15 M) ソリューションの 9.0 μ L (1.20 μmol) を追加します。
   注: TCO NHS は疎水性です。、抗体のソリューションにそれを追加するときは、ゆっくりと沈殿物を防ぐために攪拌追加します。10% を超えない最終反応液量で DMF。
5. 軽度の動揺 (500 rpm) で 1 h の thermomixer の 25 ° C で反応を許可します。
6. 1 時間後あらかじめパックされた使い捨てサイズ排除脱塩カラムを用いた huA33 TCO ・免疫を浄化します。
   1. 供給業者が貯蔵中防腐剤すべて列に存在を削除するに説明されているように、サイズ排除コラムを平衡させ。典型的な手順で洗浄 5 列は、列のボリュームに対応する PBS のボリューム x: 5 × 2.5 mL の PBS。
   2. 反応混合物を反応混合物の量を注意してサイズ除外] 列に追加します。
   3. 反応混合物が列を入力列に追加ソリューションの総容積をもたらすに PBS の適切な量を追加 2.5 mL。たとえば、抱合反応 1.3 mL の容量の場合は、1.2 mL の追加の PBS を列に追加します。
   4. 溶離液 2 mL の PBS を使用して製品を収集します。
      注: この手順は、2 mL の PBS、pH 7.4 の最終的な構造の huA33 TCO を得られます。
7. モニタリング 280 nm 波長紫外可視分光光度計を使用する huA33 TCO の濃度を測定します。ほとんど Igg (ε₂₈₀) のモル吸光係数が 210,000 M^-1cm^-1です。
8. ・免疫の高い濃度を持つソリューションが必要な場合は遠心ろ過ユニットを用いた 50,000 分子量カットオフ huA33 TCO ソリューションを集中の製造元の指示に従います。
   注: 多くの抗体は、集計または濃度の間に沈殿する知られています。新しい抗体でこの手順を試みる研究者が文献または問題の抗体を処理経験を延期すべき。
9. それがすぐに必要な場合は、暗闇の中で 4 ° C で完成した huA33 TCO ・免疫を格納します。将来的に 4 日以上を使用する場合、暗闇の中で-80 ° C で保管してください。
   注: これはの手順で許容可能な停止ポイントです。完成した huA33 TCO ・免疫は、暗闇の中で-80 ° C で 6 ヶ月以上貯蔵のため安定したはずです。

2. Tz ペグ₇- NHBoc の合成

1. 1.7 mL 遠心チューブに 0.15 mL の無水ジメチルスルホキシド (DMSO) で tetrazine N- hydroxysuccinimidyl エステル (Tz NHS; 12.6 μmol) 5 mg を溶解します。
2. 別の 1.7 mL 遠心チューブに Boc 保護アミノ酸ペグ ポリマー、O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene リコール (NHBoc-PEG7-NH₂; 17.1 μmol) 無水 DMSO の 0.15 mL の 8 mg を溶解します。
3. Tz NHS のソリューションにトリエチルアミン (茶) の 3 μ L (21.3 μmol、1.7 モル同等物) を追加し、徹底的にミックスします。
4. ステップ 2.2 から NHBoc ペグ₇-NH₂ソリューションにピンクの tetrazine ソリューションを追加し、軽度の動揺 (RT) 室温で 30 分間反応混合物を孵化させなさい。
5. 30 分後反応 H₂O の 1:1 の希釈し、Tz ペグ₇から任意の未反応 Tz NHS を分離する逆相 C₁₈高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を用いた反応を浄化 - NHBoc。Boc グループの保護の早期の削除を防ぐために酸の溶剤を使用します。₇は両方の Tz ペグを監視 - NHBoc と 525 の波長で Tz NHS nm。
   注: 保持時間は明らかに高い (ポンプ、列、チューブ、等)、各研究室の高速液体クロマトグラフィー装置依存し浄化する前に適切なコントロールを実行する必要があります。ただし場合 5: 95 MeCN/H₂O のグラデーション、例が存在する (両方なし添加物) 1 mL/min の流量と分析 4.6 mm × 250 mm C₁₈列を使用する 95:5 MeCN/H₂O 30 分以上、、保持時間 Tz NHS と Tz ペグ₇- NHBoc、16 と 18 の最小周りそれぞれ。
6. 凍結する液体窒素を使用して収集した高速液体クロマトグラフィー溶離液とアルミホイルで今冷凍コレクション チューブをラップします。場所、エアカーテンの冷凍コレクションの管は高速液体クロマトグラフィーの移動相を削除する一夜します。製品は特徴的な明るいピンクの固体になります。
   注: は、ドライアイスで収集した高速液体クロマトグラフィー溶離液を凍結液体窒素が利用できない場合または-80 ° C のフリーザーで一晩します。

3. Tz ペグ₇NH の₂の合成

1. Tz ペグ₇ステップ 2.6 から製品に - NHBoc、ジクロロ メタン (DCM) 1.5 mL を追加し、このソリューションを小さな丸底フラスコに転送します。
2. ステップ 3.1 から、ピンクの溶液に滴下トリフルオロ酢酸 (TFA) の 0.25 mL を追加します。
3. 軽度の動揺と室温で 30 分間インキュベートする反応を許可します。
4. 30 分後に、溶媒を介して回転蒸発を蒸発させます。37 ° C の水の風呂温度を超えないように
5. 0.5 mL の水でピンクの粘性製品を再構築します。
6. Boc 保護前駆体から Tz ペグ₇NH の₂を分離に高速液体クロマトグラフィー逆相 C₁₈を使用して製品を浄化します。₇は両方の Tz ペグを監視 - NHBoc と Tz ペグ₇NH の₂波長 525 nm。
   注: 保持時間は明らかに高い (ポンプ、列、チューブ、等)、各研究室の高速液体クロマトグラフィー装置依存し浄化する前に適切なコントロールを実行する必要があります。ただし場合 5: 95 MeCN/H₂O のグラデーション、例が存在する (両方 0.1 %tfa) 1 mL/min の流量と分析 4.6 mm × 250 mm C₁₈列を使用する 95:5 MeCN/H₂O 30 分以上、、保持時間 Tz ペグ₇- NHBoc と Tz ペグ₇NH の₂は、約 18 分、13 分、それぞれ。
7. 凍結する液体窒素を使用して収集した高速液体クロマトグラフィー溶離液とアルミホイルで今冷凍コレクション チューブをラップします。場所、エアカーテンの冷凍コレクションの管は高速液体クロマトグラフィーの移動相を削除する一夜します。製品は、明るいピンクの固体になります。
8. ステップ 3.7、Tz ペグ₇NH の₂DMSO と 1.7 mL の微量遠心チューブへの転送の 150 μ L から製品を再構築します。
9. Tz ペグ₇-NH₂モニタリング 525 nm 波長紫外可視分光光度計を使用して濃度を測定します。Tz ペグ₇-NH₂ (ε₅₂₅) のモル吸光係数は 535 M^-1cm^-1です。

4. Tz ペグ₇DOTA の合成

1. 0.15 ml の DMSO の Tz ペグ₇-NH₂ (4.5 mg, 6.9 μmol) を解散 (または単にステップ 3.8 で作成したソリューションを続行)。
2. 手順 4.1 から tetrazine 含有溶液に紅茶 (21 μ L、0.15 ミリ モル) のモル同等物 22 を追加します。
3. P- SCN-Bn-DOTA 固体と渦を約 2 分または材料が完全に溶解するまでのソリューションとしての 10 mg (14.2 μmol) を追加します。
4. 軽度の動揺と室温で 30 分間インキュベートする反応を許可します。
5. 30 分後に 1:1 H₂O の反応を希釈し、未反応pSCN-Bn-DOTA を削除する逆相 C₁₈高速液体クロマトグラフィーを使用して製品を浄化します。波長 254 でpの SCN Bn DOTA をモニターできる nm, Tz ペグ₇中 - DOTA は 525 の波長監視最高 nm。
   注: 保持時間は明らかに高い (ポンプ、列、チューブ、等)、各研究室の高速液体クロマトグラフィー装置依存し浄化する前に適切なコントロールを実行する必要があります。ただし場合 5: 95 MeCN/H₂O のグラデーション、例が存在する (両方の 0.1 %tfa) 95:5 MeCN/H₂O 30 分以上と分析 4.6 x 250 mm C₁₈列が使用、Tz ペグ₇- DOTA と p SCN-Bn DOTA の保持時間があります。約 15.6 分、16.1 分、それぞれ。
6. 凍結する液体窒素を使用して収集した高速液体クロマトグラフィー溶離液とアルミホイルで今冷凍コレクション チューブをラップします。場所、エアカーテンの冷凍コレクションの管は高速液体クロマトグラフィーの移動相を削除する一夜します。製品は、明るいピンクの粉になります。
7. 0.15 ml の DMSO の製品を再構成し、モニタリング 525 nm 波長紫外可視分光光度計を用いた濃度を測定します。モル吸光係数 Tz ペグ₇- DOTA (ε₅₂₅)、535 M^-1cm^-1です。
8. 核磁気共鳴 (NMR) による最終的な化合物を分析し、高分解能質量分析法 (HRMS) して、その合成が成功しました。実験化学シフトとこの研究で議論されるすべての化合物の分子量の表 1を参照してください。
9. ストア-80 ° C で暗闇の中で浄化された Tz ペグ₇- DOTA ソリューション
   注: これはの手順で許容可能な停止ポイントです。完成した Tz ペグ₇- DOTA 前駆体は、これらの条件の下で、少なくとも 1 年間安定しました。

5. ¹⁷⁷Lu Tz ペグ₇DOTA のカイネティックス

注意: この手順プロトコルの処理や放射能の操作が含まれます。これらの手順を実行する前に- か放射能、他の作業を実行する — 研究者の所属機関の放射線安全部に相談してください。電離放射線への暴露を最小限に抑えるためにあらゆる可能な措置を取る。

メモ: radiometals の少量を使用する場合、すべてのバッファーが調整サイト バインドの干渉を防ぐため微量金属から自由であることをお勧めします。

1. 1.7 mL 遠心管で 200 μ l 中 0.25 M 酢酸アンモニウム緩衝調整 pH 5.5 1 M HCl の因数を追加します。
   注: ラベルの活動の未満 370 MBq を使用している場合は、バッファー使用量を 100 μ L に還元すべき。
2. 緩衝液に [¹⁷⁷Lu] LuCl₃の希望の金額を追加します。追加容量は、実験で投与された放射性線量被験者数に依存になります。精製工程中に放射能の潜在的な損失を補うために予防措置として放射能の価値がある 1-2 の余分線量を追加することをお勧めします。
3. Tz ペグ₇を追加 - 土田ステップ 5.2 放射性混合物に DMSO で。Tz ペグ₇量 - DOTA はテストされている被験者の数によって異なります。このトピックの詳細については、ステップ 6.2.2.2 見つけることが。
4. 37 ° C、20 分インキュベートするソリューションを許可します。
5. 完全な 50 ミリメートルの EDTA、pH 5.5 移動相として用いたラジオ インスタントの薄層クロマトグラフィー (ラジオ iTLC) は、カイネティックスを確認します。ラベル [¹⁷⁷Lu] Lu DOTA ペグ₇Tz - ベースラインのままになります-R_f = 0-無料 [¹⁷⁷Lu] をしながら Lu^{3 +} EDTA が主催する、溶媒フロント、R_fは = 1.0 (図 3 b)。
6. 定量的な分類が得られない場合は、無料の radiometal を調整する追加配位子を追加します。また、ラベル付き浄化 [¹⁷⁷Lu] Lu DOTA ペグ₇- Tz C₁₈カートリッジを使用します。使用するための製造元の指示をに従ってください。プロシージャのサンプルを記します。
   1. 大きな注射器でカートリッジにエタノール 5 mL をゆっくり通過してカートリッジを首相します。その後、アセトニ トリル 5 mL から 5 mL の脱イオン (DI) H₂o. を通過します。
   2. ステップ 5.3 から小さい注射器で放射性リガンド溶液を描くし、C₁₈カートリッジにゆっくりと注入すること。その後、洗浄・ ディ ・ H₂O を削除する 10 mL でカートリッジは [¹⁷⁷Lu] LuCl₃を非連結。
   3. エタノール 500 μ L で溶出します。乾燥窒素またはアルゴン 10 〜 15 分のための低流量で船を渡すことによって、最終製品から、エタノールを削除します。その後、ステップ 6.2.2.2 で決定したボリュームで生理食塩水でリガンドを再懸濁します。

6生体内研究。

注意: セクション 5 のようにこのプロトコルの手順処理や放射能の操作します。これらの手順を実行する前に研究者は自分の所属機関の放射線安全部に相談してください。電離放射線への暴露を最小限に抑えるためにあらゆる可能な措置を取る。

1. 動物の作製
   1. 女性無胸腺ヌードマウスの皮下インプラント 5 x 10⁶ SW1222 大腸癌細胞セルのメディアやマトリックスの 1:1 混合物の 150 μ L 懸 (e.g、マトリゲル) 100 〜 150 ミリメートル³異種 (14-18 日に成長する使用可能と。後接種)。
   2. 体内実験のための動物の並べ替え
      1. キャリパー測定によって決定されるに十分なサイズの腫瘍ができたら、各コホートが同じ平均腫瘍体積約ように動物を並べ替えます。動物消えないインク (1 つのバンド、2 つのバンド、等) の尻尾にマーキングで各ケージで識別することができます。
   3. 縦方向の治療研究のための動物の並べ替え
      1. キャリパー測定によって決定されるに十分なサイズの腫瘍ができたら、各実験を通して正しいトラッキングを確保するため動物の耳タグを添付します。
         注: 数値の耳タグ実験のコース全体で落ちることがあります。その結果、体系的な方法でこれら物理タグ耳切り込みに同行する勧めします (i.e。、右、左、両側、右 x 2、左 x 2)。
      2. 動物を並べ替え、各コホートの平均腫瘍体積がほぼ等しい。動物を並べ替えるための次のメソッドは、スプレッドシート プログラムを使用して実行できます。
         1. 動物の個体識別番号、耳切り欠きパターン、および 3 つの別々 の列の腫瘍体積を一覧表示します。
         2. 最小から最大の腫瘍体積へのデータを並べ替えます。
         3. ケージ数と蛇パターンでケージをサイクル 4 番目の列で各動物を割り当てます。たとえば、5 のケージが存在する場合は、このカラムがあることすべての動物がケージを割り当てられるまで「5、4、3、2、1、1、2、3、4、5...」をいっぱい。
         4. ケージが割り当てられます、一度ケージ数によってデータを並べ替えます。耳の切り込みが使用されている場合は、ユニークな耳切り欠きパターンを与えられた檻の中でそれぞれの動物にを確認します。与えられた檻の中に重複 (2 つ以上の同じパターン) を作成する場合は、スワップ、すべてのケージまで欠落しているパターンを持つ別のケージから 1 つ 1 つのマウスがユニークな耳切り欠きパターンを持つ動物です。
2. 製剤と注射
   注: 体内および治療の研究のための注入の順序は以下の通り続きます: huA33 TCO をまず、注入 [¹⁷⁷Lu] Lu DOTA ペグ₇続いて Tz-前もって決定された間隔後。
   1. ・免疫
      1. 0.9% 生理食塩水 0.8 mg/mL の濃度にステップ 1.9 から huA33 TCO ソリューションの因数を希釈します。
      2. PBS で 1% ウシ血清アルブミン (BSA) で前処理した注射器で huA33 TCO ソリューションの 150 μ L (100 μ g) の用量を描画し、氷の上にこれらの注射器を格納します。
         注: BSA 治療は注射器の壁に抗体の非特異的結合を減少します。
      3. 尾静脈を拡張する 3 分間の熱ランプの下で動物を温めます。
      4. HuA33 TCO ソリューションを異種軸受マウスの尾静脈に注入します。マウスの腫瘍に蓄積する huA33 TCO の 24 h (または別の事前に決められた時間間隔) を許可します。
   2. 放射性リガンド
      1. 特に Tz ペグ₇- DOTA のセクション 5 に記載されています。
      2. 150 μ L の 0.9% 滅菌 Tz ペグ₇1.1 大臼歯相当を含む生理食塩水 - DOTA huA33 TCO の量に比較して投与で用量を描画します。例として、100 μ g (0.67 nmol) huA33 TCO の動物に注入された [¹⁷⁷Lu] Lu DOTA ペグ₇- Tz 反応混合物は、12.4 GBq/μmol、特定の活動で作られた場合、用量が描画されます各アクティビティの 9.14 MBq を含みます。Tz (1.1 臼歯式対 huA33 TCO) の 0.74 nmol が該当します。
      3. 尾静脈を拡張する 3 分間の熱ランプの下で動物を温めます。
      4. 異種移植軸受マウスの尾静脈に放射性リガンドの線量を注入します。注入する活動は、研究者によって決まります。パブリッシュされたデータは、腫瘍サイズ 55.5 7.4 MBq の範囲内で用量依存治療効果を示しています。
3. 体内
   1. リガンドの投与後目的の時間の時点で 2% O₂を使用してマウスの各コホートを安楽死させる/6% CO₂ガス混合物。
      注: セカンダリ物理安楽死 (例えば、頚部転位) 方法について、制度の要件に従ってください。
   2. 各動物の興味のすべての器官を削除、任意の余分な血を削除する水お風呂で洗って、5 分サンプル臓器については推奨される順序でオープンエアのペーパー タオルの上にそれらを乾燥: 血液、腫瘍、心臓、肺、肝臓、脾臓、胃、小腸、大腸、腎臓、筋肉、骨、皮膚、尻尾。
   3. 十分に乾燥前重量を量られた使い捨て培養管の臓器を配置します。各臓器や組織の質量を取得するもう一度今で満たされたチューブの重量を量る。
   4. ガンマ カウンターを使用してチューブのそれぞれの活動を測定します。描画の線量を測定する検出器ガンマ カウンターで測定の活動を調整します。各計測器の¹⁷⁷Lu の放射性基準をカウントし、カウント毎分 (cpm) と活動の相互変換のためのキャリブレーション係数を決定します。
   5. 体内データを横棒グラフとしてプロット (図 5参照) 平均正規化バーと共に表示されます各臓器の吸収 1 つの標準偏差を示します。取り込みサンプル グループ間の統計的な差異の意義は達成される、対になっていない t-テストによって評価があるときp < 0.05。
4. 治療モニタリング
   1. キャリパーを使用すると、幅、長さに垂直であるだけでなく、長方形の腫瘍 (長さ) の長辺を測定します。計算音量楕円体の体積の公式を使って: πL· (4/3)咎めないH は、½L· に単純化されます。W²高さは幅にほぼ等しいと仮定します。
      注: ハンドヘルド腫瘍利用 (材料の表を参照) である場合、測定装置を使用することが可能ですも。
   2. 時間をかけて体重増加や体重減少を追跡するバランス各マウスの重量を量る。
   3. 重要なは、それぞれの動物のように背を丸めて苦痛や皮膚血管破裂 (これは haematotoxicity を示す可能性があります) の印のための物理的な外観を監視します。
      注: 腫瘍測定を縦断的療法の研究の過程ですべての 1-2 日収集する必要があります。
   4. 縦療法からプロット データは平均値としての腫瘍体積を時間をかけて研究し、必要な場合は、腫瘍体積を開始する正規化します。サンプルのグループ間の同じ日に取り込みで統計的な差異の意義は達成される、対になっていない t-テストによって評価があるとき P < 0.05。広範な統計的分析ができ訓練を受けた生物統計学者によって推薦されるよう実施する必要があります。

結果

HuA33 に TCO の活用はアミン反応 TCO NHS と免疫グロブリンの表面にリジン残基間の結合を前提と。このメソッドは非常に堅牢で再現を確実に、度の - のラベル 2 4 TCO/モノクローナル抗体が得られます。この場合、約 4.0 TCO/mAb; のラベリングの程度を確認するため Maldi-tof 質量分析法を用いてください。レポーター²⁴fluorophore 変更 tetrazine を使用して同様の...

ディスカッション

Pretargeting生体内へのこのアプローチの強みの 1 つ-戦略に関連して特にバイスペシフィック抗体を前提として、皮膚を標識-そのモジュールは、: あらゆる抗体をトランス- cyclooctene の部分に追加できますtetrazine イメージングに関する基礎的は、クリック パートナーと反応する能力を損なうことがなく臨時様々 な放射性核種の標識することができます。まだ他の抗体/抗原システム...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS)	Sigma-Aldrich	764523	Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS)	Sigma-Aldrich	764701	Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN)	Fisher Scientific	A998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc)	Fisher Scientific	A639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol)	Sigma-Aldrich	70023	Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM)	Fisher Scientific	D143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrous	Fisher Scientific	D12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit	Fisher Scientific	UFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting Columns	Fisher Scientific	45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrous	Fisher Scientific	AC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	70-011-044	10x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTA	Macrocyclics	B-205	Store at -20 °C
Triethylamine (TEA)	Fisher Scientific	AC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA)	Fisher Scientific	A116-50
Tumor measuring device	Peira TM900	Peira TM900