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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Charakterisierung von einem Trans- Cyclooctene (TCO)-modifizierte Antikörper und einem 177-Lu-Label kurz (Tz) Radioligand für pretargeted Radioimmuntherapie (Gewinn). Darüber hinaus enthält sie die Verwendung von diesen beiden Konstrukte für in Vivo Bioverteilung und längs Therapiestudien in einem Mausmodell des kolorektalen Karzinoms.

Zusammenfassung

Während Radioimmuntherapie (RIT) einen vielversprechenden Ansatz für die Behandlung von Krebs ist, kann die lange pharmakokinetische Halbwertszeit von radioaktiven Antikörper hohe Strahlendosen auf gesundes Gewebe führen. Vielleicht haben es überrascht nicht, verschiedene Strategien entwickelt, um diese beunruhigende Einschränkung zu umgehen. Eines der vielversprechendsten Ansätze ist pretargeted Radioimmuntherapie (Gewinn). Gewinn gründet sich auf Entkopplung Radionuklids aus dem Immunglobulin, Injektion von ihnen getrennt und dann erlauben sie, in Vivo im Zielgewebe zu kombinieren. Dieser Ansatz nutzt die außergewöhnliche Tumor-targeting Eigenschaften der Antikörper während Sockelleiste ihre pharmakokinetischen Nachteile, dadurch Senkung der Strahlenbelastung für Nichtziel-Gewebe und erleichtert den Einsatz von Radionukliden mit Halbwertszeiten, die als zu kurz für Einsatz in traditionellen Radioimmunoconjugates. In den letzten fünf Jahren haben unser Labor und andere ein Ansatz zur in-Vivo pretargeting basierend auf die inverse Elektron-Nachfrage Diels-Alder (IEDDA) Reaktion zwischen Trans- Cyclooctene (TCO) und kurz (Tz) entwickelt. Diese Strategie erfolgreich angewendet wurde, pretargeted Positronen-Emissions-Tomographie (PET) und Single Photon Emission Computertomographie (SPECT) Bildgebung mit einer Vielzahl von Antikörper-Antigen-Systemen. Wir haben in ein paar Neuerscheinungen die Wirksamkeit des IEDDA-basierte Gewinn in murinen Modellen Duktales Pankreaskarzinom und kolorektalen Karzinom gezeigt. Wir beschreiben in diesem Protokoll Protokolle für Gewinn mit einem 177-Lu-DOTA-Label kurz Radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz) und einer TCO-modifizierte Variante des colorectal Krebses Ausrichtung auf huA33 Antikörper (huA33-TCO). Genauer gesagt, beschreiben wir den Bau der huA33-TCO, Synthese und enzymatische [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz, und die Leistung der in Vivo Bioverteilung und längs Therapiestudien in murinen Modellen der kolorektalen Karzinom.

Einleitung

Radioimmuntherapie (RIT) – die Verwendung von Antikörpern für die Lieferung von therapeutischen Radionuklide zu Tumoren – schon seit langem ein verlockender Ansatz zur Behandlung von Krebs1,2. In der Tat hat dieses Versprechen durch die United States Food and Drug Administration Zulassung von zwei Radioimmunoconjugates für die Behandlung von Non-Hodgkin Lymphom unterstrichen worden: 90Y-Ibritumomab Tiuxetan und 131-Tositumomab3 , 4. aber auch von ihren Anfängen, die klinische Perspektiven der RIT durch eine wichtige Komplikation behindert haben: hohe Strahlung Dosis Raten auf gesundes Gewebe5,6. Im allgemeinen Radioimmunoconjugates für RIT mit langlebiger Radionuklide gekennzeichnet sind (z. B. 131ich [t½ = 8,0 Tage] und 90Y [t½ = 2,7 Tage]) mit physischen Halbwertszeiten, die gut mit der lange pharmakokinetische Halbwertszeiten von Immunglobulinen. Dies ist wichtig, denn es gewährleistet, dass genügend Radioaktivität bleibt der Antikörper nach einigen Tagen nach der Übermittlung seiner optimalen Bioverteilung angekommen. Diese Kombination von langen Verweilzeiten im Blut und lange körperliche Halbwertszeiten führt jedoch unweigerlich in der Bestrahlung von gesundem Gewebe, wodurch therapeutische Verhältnisse und die Wirksamkeit der Therapie7zu begrenzen. Verschiedene Strategien zur Umgehung dieses Problems, einschließlich der Verwendung von abgeschnittenen Antikörperfragmente wie Fab, Fab erkundet worden ", F(ab')2, Minibodies und Nanobodies8,9,10. Eine der vielversprechendsten und faszinierend, aber unbestreitbar Komplex, alternative Ansätze ist in Vivo pretargeting11.

Pretargeting in Vivo ist ein Ansatz zur nuklearen Bildgebung und Therapie, die versucht, die exquisite Affinität und Selektivität von Antikörpern nutzbar zu machen, während ihre pharmakokinetischen Nachteile11,12,13Sockelleiste. Zu diesem Zweck ist der radioaktiven Antikörper verwendet im traditionellen Radioimmuntherapie in zwei Komponenten zerlegt: ein kleines Molekül Radioligand und eine Immunoconjugate, die sowohl ein Tumor Antigen und die oben genannten Radioligand binden können. Das Immunoconjugate ist zuerst injiziert und einen "Vorsprung", oft mehrere Tage, in denen es reichert sich in das Zielgewebe und löscht aus dem Blut. Anschließend das kleine Molekül Radioligand verabreicht und kombiniert mit der Immunoconjugate auf den Tumor oder löscht rasch aus dem Körper. Im wesentlichen stützt sich in Vivo pretargeting auf Radiochemie innerhalb des Körpers selbst durchführen. Durch die Reduzierung der Zirkulation der Radioaktivität, dieser Ansatz gleichzeitig reduziert Strahlenbelastung auf gesundes Gewebe und erleichtert den Einsatz von Radionukliden (z. B. 68Ga, t½ = 68 min.211; Als t½ = 7,2 h) mit Halbwertszeiten, die in der Regel mit Antikörper-basierten Vektoren unvereinbar angesehen werden.

Beginnend in den späten 1980er Jahren, eine Handvoll verschiedener Ansätze zur in-Vivo pretargeting entwickelt worden, einschließlich Strategien basierend auf Bispezifische Antikörper, die Interaktion zwischen Streptavidin und Biotin, und der Hybridisierung von ergänzenden Oligonukleotide14,15,16,17,18. Noch ist jeder zurück in unterschiedlichem Ausmaß von Komplikationen, am bekanntesten die potente Immunogenität von Streptavidin-modifizierte Antikörper19,20gehalten worden. In den letzten fünf Jahren haben unsere Gruppe und andere einen Ansatz zur in-Vivo pretargeting basierend auf der schnellen und Bioorthogonal inverse Elektron Nachfrage Diels-Alder Ligatur zwischen Trans- Cyclooctene (TCO) und kurz (Tz) entwickelt 21,22,23,24. Das erfolgreichste dieser Strategien haben ein TCO-modifizierte Antikörper und ein Tz-Lager Radioligand beschäftigt wie TCO in der Regel stabiler in Vivo als seine Tz Partner (Abbildung 1)25,26. In anderen pretargeting Methoden ist die mAb-TCO Immunoconjugate zuerst verabreicht und Zeit aus dem Verkehr gezogen und im Tumorgewebe anreichern. Anschließend wird das kleine Molekül Tz Radioligand injiziert, anschließend entweder mit der Immunoconjugate in das Zielgewebe klickt oder löscht rasch aus dem Körper. Dieses in Vivo pretargeting Strategie bewährt sehr effektiv für PET und SPECT imaging mit mehreren verschiedenen Antikörper/Antigen-Systemen, konsequent produziert Bilder mit hohem Kontrast und ermöglicht die Verwendung von kurzlebigen Radionukliden wie 18 F (t½ = 109 min) und 64Cu (t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Vor kurzem wurde die Wirksamkeit von Klick-basierte pretargeted Radioimmuntherapie (Gewinn) in murinen Modellen Duktales Pankreaskarzinom (PDAC) und kolorektalen Karzinom27,28nachgewiesen. Zu diesem Zweck die therapeutischen Radionuklids 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 Tage) wurde in Verbindung mit zwei verschiedenen Antikörpern eingesetzt: 5B1, die Kohlenhydrat-Antigen 19,9 (CA19.9) ubiquitär in PDAC ausgedrückt richtet sich an , und huA33, die A33 abzielt, einen transmembranen Glycoprotein ausgedrückt in > 95 % der kolorektale Karzinome. In beiden Fällen diesen Ansatz auf 177Lu-Gewinn ergab hohe Aktivitätskonzentrationen im Tumorgewebe, erstellt eine dosisabhängige therapeutische Wirkung und reduziert gleichzeitig Aktivitätskonzentrationen in gesundes Gewebe im Vergleich zu traditionellen direkt-mit der Bezeichnung Radioimmunoconjugates.

In diesem Artikel beschreiben wir Protokolle für Gewinn mit einem 177-Lu-DOTA-Label kurz Radioligand ([177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz) und einer TCO-modifizierte Variante der huA33 Antikörper (huA33-TCO). Genauer gesagt, beschreiben wir den Bau des huA33-TCO (Abbildung 2), der Synthese und enzymatische [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz (Abbildung 3 und Abbildung 4) und die Leistung von in Vivo Bioverteilung und längs Therapiestudien in murinen Modellen des kolorektalen Karzinoms. Darüber hinaus in der repräsentative Ergebnisse und Diskussion, wir präsentieren ein Beispieldatensatz Adresse mögliche Strategien zur Optimierung dieses Ansatzes und betrachten diese Strategie in den größeren Zusammenhang der in Vivo pretargeting und Gewinn. Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass während wir gewählt haben, konzentrieren sich auf pretargeting mit huA33-TCO und [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz in diesem Protokoll, diese Strategie hochmodular ist und kann eine Vielzahl von Antikörpern angepasst werden und Radionuklide.

Protokoll

Alle in Vivo Tierversuche in dieser Arbeit beschriebenen wurden nach genehmigten Protokolle durchgeführt und ausgeführt nach den ethischen Richtlinien der Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center und Hunter College Institutionelle Pflege der Tiere und Nutzung Ausschüsse (IACUC).

1. die Vorbereitung der huA33-TCO

Hinweis: Die Synthese von huA33-TCO wurde bereits berichtet29. Jedoch für den Leser zu erleichtern, ist es hier mit Anpassungen für optimale Bedingungen repliziert.

  1. In einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch, bereiten die 125 μL Lösung (E) - Cyclooct - 4-Enyl 2,5-Dioxo-1-Pyrrolidinyl Carbonat (TCO-NHS) im trockenen Dimethyl Formamid (DMF) in einer Konzentration von 40 mg/mL (0,15 M). Diese Lösung kann regelmÄÑig und gefrorenen bei-80 ° C für den Einsatz in weiteren Untersuchungen sein.
  2. Bereiten Sie in einem separaten 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch die 5 mg/mL Lösung von huA33 in 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS; 2,7 mM Kaliumchlorid, 137 mM Natriumchlorid und 11,9 mM Kalium Phosphat, pH 7,4).
  3. Mit kleinen Aliquote (< 5 μL) von 0,1 M Na2CO3, stellen Sie den pH-Wert der Antikörper-Lösung von Schritt 1.2 auf 8,8-9,0. Verwenden Sie pH-Papier oder ein pH-Meter mit einer Mikroelektrode zur Überwachung des pH-Wertes und seien Sie vorsichtig, dass der pH-Wert 9.0 nicht überschreitet.
  4. Die beschriebene in Schritt 1.3 Antikörperlösung langsam Hinzufügen eines Datenträgers entspricht 40 molare Entsprechungen der TCO-NHS im Verhältnis zu der Menge des Antikörpers. Beispielsweise ist 5 mg (30 Nmol) huA33 in der Lösung fügen Sie 9.0 μL (1,20 μmol) 40 mg/mL (0,15 M) Lösung der TCO-NHS hinzu.
    Hinweis: TCO-NHS ist hydrophob. Wenn es um die Lösung des Antikörpers hinzufügen, fügen Sie es langsam und mit Agitation, Niederschlag zu verhindern. Nicht mehr als 10 % DMF nach Volumen in der endgültigen Reaktionslösung.
  5. Lassen Sie die Reaktion bei 25 ° C auf einem Thermomixer für 1 h mit milden Agitation (500 u/min) inkubieren.
  6. Reinigen Sie nach 1 h die huA33-TCO Immunoconjugate über eine vorverpackte Einweg Größe Ausgrenzung Entsalzung Spalte.
    1. Equilibrate der Ausgrenzung-Spalte "Größe", wie beschrieben durch den Lieferanten, von Konservierungsstoffen in der Spalte vorhanden während der Lagerung zu entfernen. Eine typische Vorgehensweise beinhaltet waschen die Spalte 5 X mit einem Volumen von PBS, die das Volumen der Spalte entspricht: 5 x 2,5 mL PBS.
    2. Spalte "Größe-Ausschluss" das Volumen des Reaktionsgemisches in Anbetracht fügen Sie die Reaktionsmischung hinzu.
    3. Nachdem das Reaktionsgemisch die Spalte eingegeben hat, fügen Sie einen angemessenen Betrag von PBS, das Gesamtvolumen der Lösung hinzugefügt, um die Spalte zu bringen bis zu 2,5 mL. Zum Beispiel, wenn die Konjugation Reaktion führte zu einem Gesamtvolumen von 1,3 mL, 1,2 mL zusätzliche PBS die Spalte hinzufügen.
    4. Das Produkt mit 2 mL PBS als das Laufmittel zu sammeln.
      Hinweis: Dieser Schritt wird die endgültige Konstrukt huA33-TCO in 2 mL PBS, pH 7.4 Ausbeute.
  7. Messen der Konzentration der huA33-TCO mit einem UV-Vis Spektralphotometer Überwachung der 280 nm Wellenlänge. Der molaren Aussterben Koeffizient für die meisten IgGs (ε280) ist 210.000 M-1cm-1.
  8. Wenn eine Lösung mit einer höheren Konzentration von Immunoconjugate gewünscht wird, konzentrieren sich die huA33-TCO-Lösung unter Verwendung einer zentrifugalen Filtereinheit mit einem 50.000 Molekulargewicht Cut-off nach Anweisungen des Herstellers.
    Hinweis: Viele Antikörper haben dafür bekannt, zu aggregieren oder Niederschlag während der Konzentration. Wenn Sie dieses Verfahren mit einem neuen Antikörper versuchen, sollten Forscher der Literatur oder eigene Erfahrung im Umgang mit den fraglichen Antikörper aufschieben.
  9. Speichern Sie das ausgefüllte huA33-TCO Immunoconjugate bei 4 ° C im Dunkeln ggf. sofort. Wenn es mehr als 4 Tage in der Zukunft verwendet werden soll, speichern sie bei-80 ° C im Dunkeln.
    Hinweis: Dies ist eine akzeptable Haltepunkt in der Prozedur. Die abgeschlossenen huA33-TCO Immunoconjugate sollte für mindestens 6 Monate Lagerung bei-80 ° C im Dunkeln stabil sein.

(2) die Synthese von Tz-PEG-7- NHBoc

  1. Lösen Sie in einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch 5 mg kurz N- Hydroxysuccinimidyl Ester (Tz-NHS; 12,6 μmol) in 0,15 mL wasserfreiem Dimethyl Sulfoxid (DMSO).
  2. Lösen sich in einem separaten 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch 8 mg des Boc-geschützten amino PEG Polymers, O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene Glykol (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) in 0,15 mL wasserfreiem DMSO.
  3. Zur Lösung der Tz-NHS 3 μL (21,3 μmol, 1,7 molare Äquivalente) von Triethylamin (Tee) und mischen Sie gründlich.
  4. Die NHBoc-PEG7-NH2 Lösung aus Schritt 2.2 rosa kurz-Lösung hinzu und inkubieren Sie das Reaktionsgemisch für 30 min bei Raumtemperatur (RT) mit milden Agitation.
  5. Nach 30 Minuten die Reaktion 1:1 in H2O verdünnen und reinigen die Reaktion unter Verwendung der umgekehrt Phase C18 Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) zu jeder nicht umgesetztes Tz-NHS trennen die Tz-PEG-7- NHBoc. Verwenden Sie Lösungsmittel ohne Säure die vorzeitige Entfernung des Boc Gruppe Schutz zu verhindern. Überwachen der beiden Tz-PEG-7- NHBoc und Tz-NHS bei einer Wellenlänge von 525 nm.
    Hinweis: Retentionszeiten sind natürlich stark abhängig von der HPLC Ausstattung jedes Labor (Pumpen, Spalten, Schläuche, etc.) und entsprechende Kontrollen sollten vor der Reinigung ausgeführt werden. Jedoch, beispielsweise wenn ein Gefälle von 5:95 MeCN/H2O präsentieren (beide ohne irgendeinen Zusatz) zu 95:5 MeCN/H2O über 30 min eine Durchflussmenge von 1 mL/min und eine analytische 4,6 x 250 mm C18Spalte verwendet , die Retentionszeiten der Tz-NHS und Tz-PEG-7- NHBoc sind rund 16 min und 18 min bzw..
  6. Die gesammelten HPLC Eluent mit flüssigem Stickstoff eingefroren und das jetzt eingefroren Sammelröhrchen in Alufolie wickeln. Ort der gefrorenen Sammelröhrchen auf ein Gefriertrockner über Nacht in der mobilen Phase HPLC zu entfernen. Das Produkt wird eine charakteristische helle Rosa solide sein.
    Hinweis: Wenn flüssiger Stickstoff nicht verfügbar ist, frieren die gesammelten HPLC Elutionsmittels in Trockeneis oder über Nacht in einem-80 ° C Gefrierschrank.

(3) die Synthese von Tz-PEG7-NH2

  1. Das Produkt aus Schritt 2.6, Tz-PEG-7- NHBoc, 1,5 mL Dichlormethan (DCM) hinzufügen und diese Lösung auf einem kleinen Rundboden-Kolben übertragen.
  2. 0,25 mL Trifluoroacetic Säure (TFA) tropfenweise auf die rosa Lösung aus Schritt 3.1 hinzufügen.
  3. Lassen Sie die Reaktion für 30 min bei RT mit milden Agitation auszubrüten.
  4. Nach 30 min verdunsten der Lösungsmittel über rotary Verdunstung. Überschreiten Sie Bad Wassertemperatur von 37 ° c nicht
  5. Bereiten Sie das rosa viskose Produkt in 0,5 mL Wasser.
  6. Reinigen Sie das Produkt mit umgekehrt Phase C18 HPLC, um Tz-PEG7-NH2 von der Boc-geschützten Vorläufer zu trennen. Überwachen der beiden Tz-PEG-7- NHBoc und Tz-PEG7-NH2 bei einer Wellenlänge von 525 nm.
    Hinweis: Retentionszeiten sind natürlich stark abhängig von der HPLC Ausstattung jedes Labor (Pumpen, Spalten, Schläuche, etc.) und entsprechende Kontrollen sollten vor der Reinigung ausgeführt werden. Jedoch, beispielsweise wenn ein Gefälle von 5:95 MeCN/H2O präsentieren (beide mit 0,1 % TFA), 95:5 MeCN/H2O über 30 min eine Durchflussmenge von 1 mL/min und eine analytische 4,6 x 250 mm C18Spalte verwendet , die Retentionszeiten der Tz-PEG-7- NHBoc und Tz-PEG7-NH2 sind ca. 18 min. 13 min. bzw..
  7. Die gesammelten HPLC Eluent mit flüssigem Stickstoff eingefroren und das jetzt eingefroren Sammelröhrchen in Alufolie wickeln. Ort der gefrorenen Sammelröhrchen auf ein Gefriertrockner über Nacht in der mobilen Phase HPLC zu entfernen. Das Produkt wird eine leuchtend rosa solide sein.
  8. Bereiten Sie das Produkt aus Schritt 3.7, Tz-PEG7-NH2, mit 150 μL DMSO und Transfer zu einem 1,7 mL Microcentrifuge Schlauch.
  9. Messen Sie die Konzentration von Tz-PEG7-NH2 mit einem UV-Vis Spektralphotometer Überwachung der 525 nm Wellenlänge. Der molaren Aussterben Koeffizient für Tz-PEG7-NH2 (ε525) ist 535 M-1cm-1.

(4) die Synthese von Tz-PEG7- DOTA

  1. Lösen Sie Tz-PEG7-NH2 (4,5 mg, 6.9 μmol auf) in 0,15 mL DMSO (oder fahren Sie einfach mit der Lösung erstellt in Schritt 3,8).
  2. Die kurz-haltige Lösung 22 molare äquivalente Tee (21 μL, 0,15 Mmol) aus Schritt 4.1 hinzufügen.
  3. Fügen Sie 10 mg (14,2 μmol) von p- SCN-Bn-DOTA als solide und Wirbel die Lösung für ca. 2 min oder bis das Material vollständig aufgelöst ist.
  4. Lassen Sie die Reaktion für 30 min bei RT mit milden Agitation auszubrüten.
  5. Verdünnen Sie nach 30 min die Reaktion 1:1 in H2O und reinigen Sie das Produkt mit umgekehrt Phase C18 HPLC um nicht umgesetztes p- SCN-Bn-DOTA zu entfernen. Die p- SCN-Bn-DOTA überwacht werden kann, bei einer Wellenlänge von 254 nm, während die Tz-PEG-7- DOTA ist am besten kontrollieren bei einer Wellenlänge von 525 nm.
    Hinweis: Retentionszeiten sind natürlich stark abhängig von der HPLC Ausstattung jedes Labor (Pumpen, Spalten, Schläuche, etc.) und entsprechende Kontrollen sollten vor der Reinigung ausgeführt werden. Jedoch, beispielsweise wenn ein Gefälle von 5:95 MeCN/H2O präsentieren (beide mit 0,1 % TFA), 95:5 MeCN/H2O über 30 min und einer analytischen 4,6 x 250 mm C18Spalte dienen, Tz-PEG-7- DOTA und p-SCN-Bn-DOTA haben Retentionszeiten der rund 15,6 min und 16,1 min. bzw..
  6. Die gesammelten HPLC Eluent mit flüssigem Stickstoff eingefroren und das jetzt eingefroren Sammelröhrchen in Alufolie wickeln. Ort der gefrorenen Sammelröhrchen auf ein Gefriertrockner über Nacht in der mobilen Phase HPLC zu entfernen. Das Produkt wird ein helles rosa Pulver sein.
  7. Rekonstruieren Sie das Produkt in 0,15 mL DMSO und Messen Sie die Konzentration mit einem UV-Vis Spektralphotometer Überwachung der 525 nm Wellenlänge. Die Molaren Aussterben Koeffizient für Tz-PEG-7- DOTA (ε525) ist 535 M-1cm-1.
  8. Analysieren Sie die letzte Verbindung durch Kernspinresonanz (NMR) und hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) zu überprüfen, diese Synthese war erfolgreich. Siehe Tabelle 1 für die experimentell ermittelten chemischen Verschiebungen und Molekulargewichte aller Verbindungen, die in dieser Arbeit diskutiert.
  9. Speichern Sie die gereinigte Tz-PEG7- DOTA Lösung im Dunkeln bei-80 ° C.
    Hinweis: Dies ist eine akzeptable Haltepunkt in der Prozedur. Der fertige Tz-PEG7- DOTA Vorläufer ist für mindestens 1 Jahr unter diesen Bedingungen stabil.

5. 177Lu enzymatische von Tz-PEG7- DOTA

Achtung: Dieser Schritt des Protokolls umfasst die Bearbeitung und Manipulation von Radioaktivität. Vor dem Ausführen dieser Schritte – oder jede andere Arbeitsleistung mit Radioaktivität – Forscher sollten wenden Sie sich an ihrer Heimathochschule Strahlenabteilung Sicherheit. Alle möglichen Schritte zur Minimierung der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung.

Hinweis: Beim Arbeiten mit kleinen Mengen von Radiometals wird empfohlen, dass alle Puffer frei von Spurenmetallen in Koordination Sitebindung Störungen.

  1. Fügen Sie in einem 1,7 mL Zentrifugenröhrchen 200 μL von 0,25 M Ammonium-Acetat-Puffer mit aliquoten von 1 M HCl auf pH 5,5 angepasst.
    Hinweis: Wenn Sie weniger als 370 MBq Tätigkeit für die Kennzeichnung verwenden, sollte das Volumen des Puffers zu 100 µL reduziert werden.
  2. Fügen Sie die gewünschte Menge an [177Lu] LuCl3 in der Pufferlösung. Der Betrag addiert werden abhängig von der Anzahl der Themen in das Experiment und die radioaktive Dosis verabreicht wird. Es wird empfohlen, dass 1-2 zusätzliche Dosen Wert von Radioaktivität als Vorsichtsmaßnahme, um den möglichen Verlust von Radioaktivität während Reinigungsschritte auszugleichen hinzugefügt werden.
  3. Fügen Sie Tz-PEG-7- DOTA in DMSO die radioaktive Mischung im Schritt 5.2. Die Höhe der Tz-PEG-7- DOTA ist hängt von der Anzahl der Probanden getestet. Weitere Einzelheiten zu diesem Thema finden Sie im Schritt 6.2.2.2.
  4. Lassen Sie die Lösung bei 37 ° C für 20 min inkubieren.
  5. Überprüfen Sie, ob die enzymatische abgeschlossen mit Radio instant Dünnschichtchromatographie (Radio-iTLC) mit 50 mM EDTA, pH 5,5 als mobile Phase ist. Die beschrifteten [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz bleibt an der Grundlinie — Rf = 0 — zwar frei [177Lu] Lu3 + wird von EDTA koordiniert und reist mit dem Lösungsmittel Front Rf = 1,0 (Abb. 3 b).
  6. Wenn quantitative Kennzeichnung nicht erreicht wird, fügen Sie zusätzliche Liganden der freien Radiometal zu koordinieren. Alternativ zu reinigen die beschrifteten [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz mit einem C-18 -Patrone. Anweisungen der Hersteller für den Einsatz. Nachstehend finden Sie eine Beispiel-Prozedur.
    1. Entlüften der Patrone durch langsam vorbei durch 5 mL Ethanol durch die Patrone mit einer großen Spritze. Anschließend durchlaufen Sie die 5 mL Acetonitril und dann 5 mL deionisiertes (DI) H2O.
    2. Ziehen Sie die Radioligand-Lösung von Schritt 5.3 in eine kleinere Spritze und injizieren sie langsam auf die C-18 -Patrone. Dann ungebunden waschen die Patrone mit 10 mL DI H2O, entfernen [177Lu] LuCl3.
    3. Eluieren Sie mit 500 µL Ethanol. Entfernen Sie alle Ethanol aus dem Endprodukt durch Überfahren des Schiffes mit einer low-Flow-Rate von trockenem Stickstoff oder Argon für 10-15 min. Anschließend erneut die Radioligand in Kochsalzlösung in einem Volumen im Schritt 6.2.2.2 bestimmt.

6. in-Vivo -Studien

Achtung: Wie in Abschnitt 5 beinhaltet dieser Schritt des Protokolls die Handhabung und Bearbeitung von Radioaktivität. Bevor Sie diese Schritte durchführen, sollten Forscher mit ihrer Heimathochschule Strahlung Sicherheit Abteilung konsultieren. Alle möglichen Schritte zur Minimierung der Exposition gegenüber ionisierender Strahlung.

  1. Vorbereitung der Tiere
    1. Bei nackte weibliche Athymic Mäusen subkutan Implantat 5 x 106 SW1222 colorectal Krebszellen ausgesetzt in 150 μl einer 1:1 Mischung aus Zelle Medien und Matrix (zB., Matrigel) und diese in einen 100-150 mm3 Xenograft (14-18 Tage wachsen lassen nach der Inokulation).
    2. Sortierung der Tiere für ein Bioverteilung experiment
      1. Sobald die Tumoren von ausreichender Größe wie vom Bremssattel Messung festgelegt sind, sortieren Sie die Tiere um sicherzustellen, dass jeder Kohorte hat ungefähr die gleiche durchschnittliche Tumorvolumen. Die Tiere können in jedem Käfig durch Markierungen am Heck mit unauslöschbarer Tinte (ein Band, zwei Bands, etc.) unterschieden werden.
    3. Sortierung der Tiere für eine longitudinale Therapiestudie
      1. Sobald die Tumoren von ausreichender Größe wie vom Bremssattel Messung festgelegt sind, legen Sie Ohrmarken auf jedes der Tiere zur richtigen Tracking während des Experiments zu gewährleisten.
        Hinweis: Numerische Ohrmarken können im Laufe des Experiments abfallen. Infolgedessen, es empfiehlt sich, diese physischen Tags mit Ohr Einkerbungen in systematischer Weise zu begleiten (i.e., rechts, links, beidseitig, rechts 2, Links 2).
      2. Sortieren Sie die Tiere, so dass die durchschnittliche Tumorvolumen in jeder Kohorte ungefähr gleich ist. Die folgende Methode zum Sortieren von Tieren kann mit einem Tabellenkalkulations-Programm durchgeführt werden.
        1. Liste der tierischen Identifikationsnummern, Ohr Kerbe Muster und Tumorvolumen in drei separate Spalten.
        2. Sortieren Sie die Daten vom kleinsten zum größten Tumorvolumen.
        3. Weisen Sie in einer vierten Spalte jedes Tier eine Käfig-Nummer und die Käfige in einem verschlungenen Muster zu durchlaufen zu. Zum Beispiel gibt es 5 Käfige, diese Spalte wäre "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5..." gefüllt, bis alle Tiere in einem Käfig zugewiesen sind.
        4. Sobald die Käfige zugeordnet sind, sortieren Sie die Daten von Käfig-Reihe. Wenn Ohr Kerben verwendet werden, stellen Sie sicher, dass jedes Tier in einem bestimmten Käfig eine einzigartiges Ohr Kerbe Muster hat. Wenn in einem bestimmten Käfig gibt es Duplikate (zwei oder mehr der gleichen Muster), hat Swap eine Maus mit einem aus einem anderen Käfig mit dem fehlenden Muster bis jeder Käfig Tiere mit einzigartigen Ohr Kerbe Mustern.
  2. Formulierungen und Injektionen
    Hinweis: Die Reihenfolge der Einspritzung für Bioverteilung und Therapie-Studie geht wie folgt: huA33-TCO injiziert zuerst, gefolgt von [177Lu] Lu-DOTA-PEG-7- Tz nach einem vorher festgelegten Intervall.
    1. Immunoconjugate
      1. Ein Aliquot der huA33-TCO-Lösung von 1,9 Schritt zu einer Konzentration von 0,8 mg/mL in sterilen Kochsalzlösung 0,9 % verdünnen.
      2. Zeichnen Sie Dosen von 150 µL (100 µg) huA33-TCO-Lösung in Spritzen in PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) vorbehandelt und speichern Sie diese Spritzen auf Eis.
        Hinweis: BSA-Behandlung reduziert die unspezifische Bindung des Antikörpers an den Wänden der Spritze.
      3. Wärmen Sie die Tiere unter einer Wärmelampe für 3 Minuten, die Rute Vene zu dehnen.
      4. Die huA33-TCO-Lösung in die Vene der Schweif der Maus Xenograft-Lager zu injizieren. Die huA33-TCO akkumulieren in den Tumor der Maus ermöglichen Sie 24 h (oder ein anderes vorher festgelegten Zeitintervall).
    2. Radioligand
      1. Radiomarkierung Tz-PEG-7- DOTA wie in Abschnitt 5 beschrieben.
      2. Zeichnen Sie Dosen in 150 μL von 0,9 % sterile Kochsalzlösung enthält 1,1 molare Entsprechungen von Tz-PEG-7- DOTA im Verhältnis zu der Menge des huA33-TCO verabreicht. Beispielsweise werden wenn 100 μg (0,67 Nmol) huA33-TCO das Tier injiziert wurde und [177Lu] Lu-DOTA-PEG7- Tz Reaktionsmischung wurde mit einer spezifischen Aktivität von 12,4 GBq/μmol, dann Dosen gezeichnet mit 9,14 MBq Aktivität jedes. Dies entspricht 0,74 Nmol Tz (1.1 molare EQ relativ zur huA33-TCO).
      3. Wärmen Sie die Tiere unter einer Wärmelampe für 3 min, die Rute Vene zu dehnen.
      4. Die Dosis von Radioligand in die Rute Vene der Maus Xenograft-Lager zu injizieren. Die Höhe der Aktivität injiziert werden, richtet sich nach der Forscher. Veröffentlichte Daten haben dosisabhängig therapeutische Auswirkungen auf die Größe des Tumors innerhalb eines Bereichs von 7,4-55,5 MBq gezeigt.
  3. Bioverteilung
    1. Zum gewünschten Zeitpunkt nach der Verabreichung der Radioligand einschläfern jeder Kohorte von Mäusen mit einem 2 % O2 / 6 % CO2 gas-Gemisch.
      Hinweis: Führen Sie institutionellen Anforderungen an Methoden zur sekundären physischen Euthanasie (z. B. zervikale Dislokation).
    2. Für jedes Tier, entfernen alle Organe von Interesse, in einem Wasserbad entfernen überschüssiges Blut zu waschen und trocknen Sie sie auf einem Papiertuch unter freiem Himmel für 5 min. Beispielliste Orgel in der empfohlenen Reihenfolge: Blut, Tumor, Herz, Lunge, Leber, Milz, Magen, Dünndarm , Dickdarm, Nieren, Muskeln, Knochen, Haut, Schweif.
    3. Sobald ausreichend getrocknet ist, legen Sie die Organe in vorgewogene Einweg Kultur Röhren. Wiegen Sie die nun gefüllte Schläuche noch einmal auf die Masse des einzelnen Organ oder Gewebe zu erhalten.
    4. Messen Sie die Aktivität in jedes der Rohre mit einem Gamma-Zähler. Die gemessene Aktivität in den Gamma-Zähler an den Detektor zur Messung der gezeichneten Dosis zu kalibrieren. Radioaktiven Normen von 177Lu auf jedem Instrument zählen und bestimmen ein Kalibrierfaktor für Wechsel zwischen Aktivität und zählt pro Minute (cpm).
    5. Die Bioverteilung Daten als Balkendiagramm darstellen (siehe Abbildung 5) mit dem Mittelwert normalisiert Aufnahme für jedes Organ angezeigt zusammen mit eine Bar bezeichnet eine Standardabweichung. Statistische Unterschiede Beispielgruppen Aufnahme können von einem ungepaarten t-Test, Bedeutung erlangte bewertet werden wenn p < 0,05.
  4. Therapiemonitoring
    1. Messen Sie Bremssättel, die längste Seite des länglichen Tumors (Länge) sowie die Breite, die senkrecht auf die Länge. Volumen mit der Formel für das Volumen eines Ellipsoides berechnen: (4/3) πL· W· H, die zu ½L· vereinfacht W2, vorausgesetzt, dass die Höhe der Breite ungefähr gleich ist.
      Hinweis: Es ist auch möglich, einen Handheld-Tumor, Messgerät, wenn man zur Verfügung (siehe Tabelle der Materialien) zu verwenden.
    2. Wiegen Sie jede Maus auf einem Gleichgewicht, Gewichtszunahme oder Gewichtsverlust im Laufe der Zeit zu verfolgen.
    3. Überwachen Sie wichtig ist, jedes Tier physische Erscheinung auf Anzeichen von Not, wie z. B. zurück gebeugt oder geplatzten kutanen Blutgefäße (die Hämatoxizität angeben können).
      Hinweis: Tumor-Messungen sollten alle 1-2 Tage im Laufe des longitudinalen Therapiestudie erhoben werden.
    4. Plot-Daten von der longitudinalen Therapie als Durchschnittsvolumina Tumor im Laufe der Zeit zu studieren und normalisieren, Tumorvolumen ab, falls gewünscht. Statistische Unterschiede in der Aufnahme am selben Tag zwischen Beispielgruppen können von einem ungepaarten t-Test, Bedeutung erlangte bewertet wenn P < 0,05. Weitergehende statistische Analysen können und wie durch eine ausgebildete Biostatistiker empfohlen durchgeführt werden sollte.

Ergebnisse

Die Konjugation des TCO, huA33 beruht auf der Kopplung zwischen den Amin-reaktive TCO-NHS und die Lysin-Rückstände auf der Oberfläche der Immunglobulin. Diese Methode ist sehr robust und reproduzierbare und zuverlässig liefert eine Grad-der-Kennzeichnung von 2-4 TCO/mAb. In diesem Fall wurde MALDI-ToF-Massenspektrometrie eingesetzt, um ein Maß für die Kennzeichnung von ca. 4,0 TCO/mAb zu bestätigen; ein ähnlicher Wert wurde mit einem Fluorophor-modifizierte kurz als ein Reporter

Diskussion

Eine der Stärken dieses Ansatzes zu in Vivo pretargeting — vor allem in Bezug auf Strategien auf Bispezifische Antikörper ausgesagt und radioaktiv Haptens – ist seine Modularität: Trans- Cyclooctene Moieties können angehängt werden, um Antikörper und kurz Radioligands kann mit einer außergewöhnlichen Vielfalt von Radionukliden ohne Beeinträchtigung ihrer Reaktionsfähigkeit mit ihren Partnern klicken Sie radioaktiv sein. Die Anpassung dieses Konzepts auf andere Antikörper/Antigen-System is...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Jacob Houghton für hilfreiche Gespräche. Die Autoren auch möchte die NIH für ihre großzügige Finanzierung (R00CA178205 und U01CA221046).

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pyrrolidinyl carbonate (TCO-NHS)Sigma-Aldrich764523Store at -80 °C
2,5-Dioxo-1-pyrrolidinyl 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-yl)benzylamino]-5-oxopentanoate (Tz-NHS)Sigma-Aldrich764701Store at -80 °C
Acetonitrile (MeCN)Fisher ScientificA998-4
Ammonium Acetate (NH4OAc)Fisher ScientificA639-500
Boc-PEG7-amine (O-(2-Aminoethyl)-O′-[2-(Boc-amino)ethyl]hexaethylene glycol)Sigma-Aldrich70023Store at -20 °C
Dichloromethane (DCM)Fisher ScientificD143-1
Dimethyl sulfoxide (DMSO), anhydrousFisher ScientificD12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter UnitFisher ScientificUFC205024
GE Healthcare Disposable PD-10 Desalting ColumnsFisher Scientific45-000-148
N,N-Dimethylformamide (DMF), anhydrousFisher ScientificAC610941000
Phosphate Buffered Saline (PBS)Fisher Scientific70-011-04410x Concentrated
p-SCN-Bn-DOTAMacrocyclicsB-205Store at -20 °C
Triethylamine (TEA)Fisher ScientificAC157911000
Trifluoroacetic Acid (TFA)Fisher ScientificA116-50
Tumor measuring devicePeira TM900Peira TM900

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