PARbars: 植物の天蓋での光遮断の連続的な測定のための Ceptometers を構築するために、安価で簡単に

要約

ここでは、研究品質 ceptometers (水平バーに沿って直線的に配列された多くのセンサ間に光強度を統合する光センサ) を構築し、較正する方法について詳細な説明を提示します。

要約

Ceptometry は、長いバー上で並列に接続された複数の光センサを使用して、植物のキャノピーを介して光合成活性放射線の透過率を測定するために使用される技術です。Ceptometry は、多くの場合、樹冠構造と光遮断、特に葉面積指数 (LAI) と有効な植物面積指数 (PAI_eff) の特性を推測するために使用されます。商業的に入手可能な ceptometers の高コストのために、撮影することができる測定の数は、多くの場合、空間および時間において制限される。これにより、光インターセプトにおける遺伝的変動を研究するための ceptometry の有用性が制限され、時間帯に応じて測定値をスキューできるバイアスの徹底的な分析や補正ができなくなります。私たちは、$75 米ドルで生産可能なロギング ceptometers (PARbars と呼ばれる) を継続的に開発し、市販の代替品に匹敵する高品質のデータを生成します。ここでは、PARbars を構築し、較正する方法についての詳細な指示を提供し、フィールドにそれらを展開する方法と収集された透過データから PAI を推定する方法。小麦の天蓋からの代表的な結果を提供し、PARbars を使用する際に行うべきであるさらなる考慮事項について話し合う。

概要

Ceptometers (光センサーの線形配列) は、植物の天蓋によってインターセプトされた光合成活性放射線 (PAR) の割合を測定するために使用される。Ceptometers は、測定の比較的単純な性質とデータ解釈の簡素化により、農業作物研究に広く使用されています。Ceptometry の基本的な原理は、植物の天蓋 (τ) の基部への光の透過率が、上記の光吸収材料の投影面積に依存していることである。したがって、キャノピーの上と下の PAR の測定は、葉面積指数 (LAI) や有効な植物面積指数 (PAI_eff) などの樹冠特性を推定するために使用することができます (リーフに加えて、茎、穀稈、生殖構造を含みます)^{1 ,2,3}.Τ _effから推論された PAI の推定の信頼性は、入射 PAR (f_b) のビーム分率、葉日射 (a) および有効樹冠吸光係数 (K);Kは、順番に、太陽天頂角 (θ) と葉角度分布 (χ)^{1、4、5、6}の両方に依存します。これらの効果を修正する一般的な方法です。しかし、方法論とコストの制限により、過去に考慮されていない他のバイアスがあります。

我々は最近、小麦や大麦⁷のような行作物の瞬間的な ceptometry 測定において時間依存性のバイアスを有意に同定した。このバイアスは、行植栽の向きと太陽の天頂角の相互作用によって発生します。このバイアスを克服するために、連続してロギング ceptometers を現場に取り付けて、キャノピーの光インターセプトの日内周期を監視し、次にτと PAI_effの日次平均値を計算することができます。しかし、連続測定は、市販されている ceptometers のコストが非常に高く、多くの場合、1つの機器に対して数千米ドルが必要であり、多くのフィールドプロットの測定要件があるため、実行不可能です。後者は、ゲノム全体の協会研究 (GWAS) やゲノム選択 (GS 2014 &) のようなゲノム解析に何百もの遺伝子型が必要とされるオミクスの時代において特に顕著である。我々は、大量に生産され、多くの遺伝子型間の連続的な測定に使用することができる費用対効果の高い ceptometers が必要であることを認識した。

ソリューションとして、私たちは1単位あたり $75 ドルのコストで、簡単に構築できる高精度な ceptometers (PARbars) を設計し、約1時間の労働力を構築する必要がありました。PARbars は、波長帯 (波長390– 700 nm) のみに敏感な50フォトダイオードを使用して構築されており、この範囲外では感度が非常に小さいため、高価なフィルタを使用未然ます。フォトダイオードは、1m の長さにわたって並列に接続されており、データロガーを使用して記録できる統合差動電圧信号を生成します。回路は防水のためにエポキシで包まれ、センサーは大きい温度較差 (-40 に + 80 ° c) 上で作動し、PARbars が長期の間分野で展開されることを可能にする。フォトダイオードと低温係数抵抗を除いて、PARbar の構築に必要なすべての部品は、ハードウェア・ストアから購入できます。必要な部品とツールの完全なリストは、材料のテーブルで提供されています。ここでは、PAI_effの推定および小麦天蓋からの代表結果の提示のために PARbars を構築し、使用する方法についての詳細な指示を提示します。

プロトコル

1. PARbars のビルドとキャリブレーション

1. アセンブリに必要なすべての部品とツールをクリーンなワークスペースに集めます。
2. 白いアクリルディフューザーバー (1200 mm の長さ x 30 mm 幅 x 4.5 mm の厚さ) の両端から20mm の直径の穴を 20 mm あけます。アルミニウム製の U バーセクションの各端から 20 mm 離れた穴を開けて、固定ディフューザーを確保します。ネジ穴をドリルおよびタップして、取り付け金具 (三脚取り付けプレートなど) に合わせます。
3. 1.25 m の裸銅線 (1.25 mm 径) の長さを得ます。ワイヤがロール上に来た場合は、片方の端を副またはクランプに固定し、もう一方の端をハンドドリルのグリップにしてから、ドリルを低速 (100-200 rpm) でオンにしてまっすぐにします。2 1.25 m の裸の銅線の長さで繰り返します。
4. ディフューザのエッジに沿ったフォトダイオードの目的の位置を、ディフューザの一方の端から 13.5 cm、1つ目のダイオードの間に2cm ごとに位置するその他の位置にある、最初のフォトダイオード位置から始めてマークします。ディフューザーの遠端。
   1. ディフューザーバーの1つのフォトダイオードを、バーの側面を指している電気接続タブにセンタリングし、1つのタブの下に配線を配置し、ワイヤの位置をマークすることにより、ディフューザ上の最初の銅線の位置をマークします。
   2. 前の手順を繰り返して、線の中心と反対側の端の位置をマークします。
5. Cyanoacrylate glue を使用して、最初にまっすぐになった銅線をディフューザーに接着し、前のステップでマークされた位置を使用して配線を位置合わせします。
   1. Cyanoacrylate の接着剤を使用して、20 mm 間隔で拡散器に沿って50のフォトダイオードフェイスダウンを (前のステップでマークされたように)、それらがディフューザーの中心にあり、すべてが大きなタブが co の上に座るようにすべて同じ方向に配置されていることを確認しますサイズワイヤ、および小さなタブが反対に座っています。
   2. 2番目の銅線を、フォトダイオードの小さいタブのそれぞれの下に置くように配置し、ワイヤーを cyanoacrylate 接着剤でディフューザーに接着します。
6. 1つのフォトダイオードの両方のタブ、および隣接する配線と基礎となるワイヤの両方を湿らせると、ハンダ・フラックス・ペンを使用してフラックスが塗布されます。ダイオードの各タブを、約 350-400 ^°C の温度で微細なはんだ付け鉄を使用して、基になる銅線にはんだづけします。フォトダイオードに光を当てて、ワイヤを横切って電圧信号をチェックすることによってはんだ接続をテストします。マルチメータを使用する。すべての50フォトダイオードに対してこのステップを繰り返します。
   注: ステップ1.7 はオプションです (抵抗が PARbar にはんだ付けされていなければ、後でデータロガーの PARbar 信号入力と並行して接続することができます)。
7. 1.5 Ωの低温係数精度抵抗を銅線間で並列にはんだ付けします。
8. 防水 DC コネクタのオスの端を銅線の端にはんだ付けします (抵抗がはんだ付けされたのと同じ端、オプションのステップ1.7 に従えば)、接着剤が並ぶ熱収縮チューブを使用して接続を封印します。
9. 拡散器の上の circuity のまわりの連続的なシリコーンの障壁を作成し液体堅い井戸を形作るために、シリコーンシーラントの表面にシリコーンの密封剤のビードを、端の近くに適用することによって。ビードを注意深く調べて、シリコーンとディフューザーバーの間にエアギャップが残っていないことを確認し、隙間がエポキシを漏出させるようにします。シーラントが硬化したら、エポキシ樹脂で十分に充填してください。
10. エポキシ樹脂を (一晩) 硬化させると、かみそり刃を使用してシリコーンシーラントを取り外します。M4 ボルトを使用して前通されたアルミニウム U 棒に拡散器をボルトで固定する。
11. マスキングテープを使用して、その全長に沿ってアルミニウムにディフューザーを固定し、ポリウレタンフォームフィラーで ceptometer の内側に空隙を埋めます。発泡フィラーが (一晩) 設定されたら、マスキングテープを取り外します。
12. DC コネクタのメス側の端を2導体ケーブルの長さにはんだ付けし、接着剤が並んだ熱収縮で接続を密封します。
13. 量子センサに対して PARbar を較正するために、
    1. 両方のセンサーを、差動電圧出力を測定できるデータロガーまたは電圧計に接続します (抵抗がステップ1.7 で設計に統合されていない場合は、1.5 Ωの低温度係数の精度抵抗を PARbar と並行して接続します)。
    2. レベル平面 (スピリットレベルまたはスピリットバブルのあるレベル) の完全な太陽の外でそれらを設定し、完全な日周期などの日射量が大きく変動する期間にわたって両方のセンサーの出力を記録し、PARbar のキャリブレーション係数を決定します。量子センサー (従属変数) と生電圧出力 (独立変数) から報告された PAR の線形回帰の傾き。

2. 現場に設置

1. 有効なプラント面積指数 (PAI_eff) を推測するには、キャノピーの上に PARbar を1つ取り付け (キャノピー内の任意の光吸収要素でシェーディングされないようにする)、その日射を測定するすべての光吸収要素の下に別のものをインストールします (典型的には、最も低い葉の下)、両方の PARbars が45°の角度で整列行に配置されている。上部の PARbar が下の PARbar をシェーディングしないように配置されていることを確認します。スピリットレベルまたはバブルレベルを使用して PARbars をレベルアップします。
2. ステップ1.11 で行われたケーブルを使用して、PARbars をデータロガーまたは電圧計に接続します。1.5 Ωの低温度係数の高精度抵抗が構築時に PARbar 回路に統合されていない場合 (ステップ 1.7)、この段階でそのような抵抗を各 PARbar と並行して接続します。
3. ステップ1.13 の各 PARbar について決定された較正係数を使用して、差動電圧出力を PAR に変換します。

3. 有効なプラント面積指数 (PAI_eff) の計算

1. 次の方程式⁶を使用して、上と下のキャノピーパー測定の各ペアの PAI_effを計算します。
   (1) 、
   ここで、 a = 0.283 + 0.0785a – 0.159a^{は 2} ( aはリーフ日射)、 τはキャノピーの下の PAR の比率で、 Kとf_b は式 2⁴によってモデル化され式 3⁹はそれぞれ:
   (2) 、
   ここで、 χは葉角度分布を表す無次元パラメータであり、 θは太陽天頂角であり、
   (3) 、
   ここで、 rはその最大可能値 (上の par_、最大= 2550 ∙ cosθ) の割合として、キャノピー (_上のパー) の上にあります。すなわちr = 上/PAR_、最大研究種に適した aおよびcの値については文献を参照してください (ここで提示された試験測定に使用する小麦の天蓋については、a = 0.9 およびc = 0.96¹⁰と仮定しました)。
   注: サンプル R スクリプトは、大規模なデータセットの自動処理のためのコードの開発を支援する補助ファイルとして提供されています。

結果

図 1に、PARbar ビルドの図を示します。PARbar の代表的な較正曲線を図 2に示します。PARbar の差動電圧出力は、量子センサからの PAR 出力に対して直線的に比例し、 R² = 0.9998 となります。PARbars は小麦の天蓋で展開され、植物の開発全体で20秒ごとに記録しました。明確に晴れた日に PARbar を用いて採取した樹冠光環境の典型的な日内時間経過を図 3に示す (生透過データと補正された PAI_effの比較のために示される)。図3b および 3cは、一日の様々な時間に瞬間的に ceptometry 測定を行うことによって導入され得るバイアスを示すものである (ソルター et al. 2018⁷に従って)。このデータの収集のために使用された小麦プロットは、下部キャノピーへの光の透過によって南北に向きを植える列が12:30 でピークになりました (図 3b)。この時点で即時測定を行った場合、PAI_effは過小評価されるが、それが午前または午後に撮影された場合は過大に見積もられることがある。耐候性 PARbars はまた、長い期間のためのフィールドに展開することができます。図 4は、PARbars を使用して、植物が発達するにつれてキャノピーの光環境がどのように変化するかを監視する方法を示します。

図 1.PARbar ビルドの概略図。(a) 防水コネクタと内部シャント抵抗の位置と配置(b) フォトダイオードの配置および間隔;(c) アクリルディフューザーバー上の掘削場所;(d) アルミニウム製の U バーの掘削場所。(e) PARbar の電子回路図である。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 2.代表的な PARbar 較正曲線。量子センサーからの PARbar (mV) の差動電圧出力と光合成光子束密度または PAR (mmol m^-2 s-1)の関係。各点は、PARbar および量子センサからの1組の測定値を表し、20秒に1回、4時間にわたって一日にわたって記録した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 3.PARbar 出力の代表的な毎日の timecourse。キャンベラ、オーストラリア (-35 ° 12 ' 00.1008 "、149° 05 ' 17.0988") の肉眼で小麦の天蓋で PARbars を使用して晴れた日に収集されたデータ。(a) キャノピーの上に測定された PAR (ミリモル m^-2 s-1)、(b) 未矯正の透過率 (_以下の/PAR の比率) (単位なし)、および (c) 有効な植物面積指数 (PAI_eff, m² m^-2)、式1から計算されます。(B) および (c) に示されるデータ点は、平均 (n = 30) であり、実線は R (a = 0.5) に黄土れた局所回帰であり、陰影のある領域は適合の標準誤差であり、破線の水平線は1日平均を表す。点線の間の陰影付きの領域は、CIMMYT¹¹による小麦の瞬間的な ceptometer 測定に推奨される時間窓 (1100-1400h) である。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図 4.生育期間中に収集された代表的なデータ。PARbar は、オーストラリアのキャンベラ (-35 ° 12 ' 00.1008 "、149° 05 ' 17.0988") の小麦の天蓋で肉眼に早期 tillering から収集したデータを取得します。(a) 未矯正の透過率データ (単位なし)、及び (b) 有効な植物面積指数 (PAI_eff、m2^{− 2}) を式1から算出した。表示されるデータポイントは、期間 1000-1, 400h (n = 30) の日次平均を表します。実線は、R (a = 0.75) に適合した局所回帰黄土であり、陰影領域はフィットの標準誤差である。_上の例が < 1500 モル s-1 であり、_上記の/PAR_以下であれば、さらなる分析には生データは含まれていなかった > 1.この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

Ceptometers を構築するためにここに概説されたプロトコルの成功した実装 (PARbars) は、2つのステップで最も敏感に依存します: 1.5 (その場でのフォトダイオードの接着) と 1.6 (銅線へのフォトダイオードのはんだ付け)。ステップ1.5 は、固有の極性に関してフォトダイオードを誤って位置合わせすることによってエラーを起こしやすい。我々が使用したフォトダイオード、および重要な特定の項目として推奨される極性は、ダイオード上の2つの電気コネクタタブによって明確に異なるサイズを持つことによって識別します。したがって、cyanoacrylate 接着剤を適用して、フォトダイオードをはんだ付けする前に、すべてのダイオードが1つの方向に面した大きなコネクタタブ、もう一方の方向に面している小さなタブに配置されていることを再度確認することを強くお勧めします。ステップ1.6 は、はんだ付け技術の悪さおよび冷間はんだ接合の形成により故障しやすい。これは、はんだ付けの直前にフラックスペンを使用して薄いはんだフラックスを塗布し、ワイヤとフォトダイオードタブの両方をはんだ先端部 (約350-400 ° C) で加熱してから、はんだ付け自体に適用することで回避できます。ジャンクション。PARbar における電気接続に関する問題は、通常、他の PARbars とは明確に異なる較正斜面の形で現れる。このような問題は、(ステップ1.6 で説明したように) 構築中に各電気接続をテストすることによって早期に捕捉することができ、すべての接続がはんだ付けされた後でも、エポキシに包まれる前に (ステップ 1.9)。3番目の潜在的なエラーの原因は、その抵抗が温度に対して鈍感である、低い温度係数の精度抵抗を使用しないことから生じます。通常の抵抗を使用するとエラーが抵抗となり、ダイオードによって吸収される光の単位当たりの電圧出力が周囲温度によって変化します。最後の主要なエラーの原因は PARbars に固有ではありませんが、すべての ceptometry 測定に適用されます。すなわち、光捕捉からの有効な植物面積指数又は葉面積指数の推定は、樹冠構造の特徴 (特に平均葉日射と葉の角度の分布;Eqns 1 および 2) における a およびc は、植物の発育中および遺伝子型間で変化し得る。

ここで説明するプロトコルを変更または適合させることができる2つの主な領域があります。まず、ここで紹介する PARbars は、小麦や大麦などの行作物に使用するために特別に設計されていますが、他のアプリケーションでも簡単にデザインを変更できます。たとえば、抵抗の大きいシャント抵抗を使用して、より低い PAR 範囲でゲイン (単位パーあたりの mV 出力) を向上させることができます。汎用性を高めるために、低温係数の高精度ポテンショメータ (可変抵抗) を使用して、必要に応じて PARbar の感度範囲を変更したり、多くの PARbars が同一のキャリブレーションスロープを持つように小さな調整を行ったりすることができます。第2に、フォトダイオードは、量子センサとして個別に使用することもでき、市販の量子センサを使用して可能な場合よりもはるかに低いコストで、個々の天蓋内の空間的な変化と時間的変動を捉えることができる。これは、変動する光条件¹²の下で動的光合成に対する関心が高まっていることを考えると特に価値がある。第3に、本研究で提示されたデータに従来の (そして高価な) データロガーを使用したものの、データロガーが既製の易いを使用して構築され、ceptometry とデータロガーシステムを組み合わせて作成することが可能である。限られた予算。Arduino やラズベリーパイなどのいわゆるメーカーのプラットフォームの人気は、この分野で大きな期待を提供しています。我々は、さらなる開発のためのスターターとしてオープンソースの Arduino ベースの洞窟パールプロジェクト¹³を提案します。ケーブパールデータロガーは、洞窟生態系の環境モニタリングのために設計されたため、堅牢性と低消費電力が設計上の重要な考慮事項でした。同様の考慮事項は、プラントみつかり作業への実装に関連しています。ケーブパールデータロガーコンポーネントは、安価 (1 単位あたり $50 米ドル未満) で、小型であり、PARbars に直接組み込むことができる可能性があります。

ここに記載された PARbars の適用は、3つの主な制限に直面します。第1に、測定された光捕捉からの植物領域インデックスまたは葉面積インデックスの推論は、特に行作物⁷において時間依存性の強いバイアスによって妨げられる。これは、1日に繰り返しまたは連続的な測定を行うことによって克服することができます。第2に、安価なフォトダイオードは、フォトンフラックス (光合成研究における最大の関心の変数) に正確に比例するスペクトル出力を持っていません。これにより、キャノピーを通じて光の質が大幅に変化した場合にバイアスが発生することがありますが、これまでに得られた誤差の推定値は、数パーセント⁷のオーダーであることを示しています。第3に、PARbars はキャノピーの上に入ってくる PAR の直接ビームと拡散コンポーネントを区別できません。拡散放射線は直接日光¹⁴よりもキャノピーの奥深くまで浸透するので、透過率は増加し、PAI_effは総放射照度の拡散画分が増加するにつれて過小評価されます。すべての放射線が拡散する場合、PAI_effは、式 1¹⁵に示される関係ではなく、1/τの対数に直接比例する。クルーズet al.(2015)¹⁶は、現在利用可能な直接および拡散 PAR を測定することができる市販の楽器は高価であり、定期的なメンテナンスを必要とするので、彼らはこの問題に対処するためのシンプルで安価な装置を設計したことに注意しましたそれらのシステムはモーターを備えられた、動く shadowband によって定期的に影である量子センサーから成り、総、直接および拡散 PAR の連続的な測定を可能にする。クルーズet al. で使用されているセンサー。¹⁶システムは、さらにコストを削減するために PARbars で使用される同じフォトダイオードに置き換えることができ、簡単に既存の PARbar セットアップに組み込むことができます。これらの測定値はデータ処理パイプラインに統合され、PAI_effの推定値の信頼性がさらに向上します。

既存の商業 ceptometers に比べて PARbars の主な利点は、それらを大量に生産することが可能になり、低コストである。最近では、樹冠形質の推定のための新しい高スループットプラントみつかり技術への関心が高まっています (レビュー用ヤンet al., 2017¹⁷)。これらの方法は、膨大な量のデータを生成するということで有望ですが、通常は非常に間接的で、従来の手法に対する検証が必要です。PARbars は、これらの新しい技術のための費用対効果の高い、地上ベースの検証ツールとして機能することができます。

PARbars の生産コストが低いため、現場での連続測定のための実行可能なオプションにもなります。これは、いくつかの理由で役に立ちます。たとえば、連続測定は、瞬間的な測定のための時間固有の補正関数を開発するために、行方向のバイアスを特徴付けるために使用できます (詳細については、ソルター et al. 2018⁷)。連続 ceptometry はまた、オーバーヘッド、キャノピーの動きなどの雲が通過することによって引き起こされる、時間をかけてキャノピーライトキャプチャ (sunflecks と shadeflecks) の短い変動をキャプチャすることができます。光合成は、環境条件の小さな変化に対して非常に敏感であることが知られており、光合成の「ダイナミックな」変化は現在、作物収量を駆動する上で重要であると考えられている (レビューのために Murchie et al., 2018¹²)。適切に短いロギング間隔でフィールドにインストールされた PARbars は、これらの短い変動を捕捉し、植物の天蓋の動的な性質のより良い理解を提供するために使用することができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 Ω low temperature coefficient precision resistor	TE Connectivity Ltd., Schaffhausen, Switzerland.	UPW25 series	Could be made using multiple larger resistors in parallel but they need to have low temperature coefficient (i.e. ± 3 ppm/°C). URL for commercial source: https://bit.ly/2DFuPpm
Acrylic diffuser	Plastix Australia Pty. Ltd., Arncliffe, NSW, Australia.	445 - Opal White	1200 mm length x 30 mm width x 4.5 mm thick. URL for commercial source: https://bit.ly/2Bq0fyc
Aluminum U-bar	Capral Ltd., Bundamba, QLD, Australia.	EK9160	1220 mm length x 35 mm width x 25 mm depth. URL for commercial source: https://bit.ly/2PPfJou
Bare solid core copper wire	Non-specific part
Bolts	Non-specific part
Clamps	Non-specific part
Clear epoxy potting resin	Solid Solutions, East Bentleigh, VIC, Australia.	651 - Universal Epoxy Potting Resin	Clear epoxy resin for electrical applications. URL for commercial source: https://bit.ly/2qY0pHa
Cyanoacrylate glue	Non-specific part
Datalogger	Campbell Scientific, Logan, Utah, USA.	CR5000	Other dataloggers that record differential voltages could be used. URL for commercial source: https://bit.ly/2U7Io5H
Drill or drill press	Non-specific part
Glue lined heat shrink	Non-specific part
Heat gun	Non-specific part
LED torch	Non-specific part
Masking tape	Non-specific part
Photodiodes (50)	Everlight Americas Inc., Carrollton, Texas, USA.	EAALSDSY6444A	It is important that this specific component is used due to spectral response. URL for commercial source: https://bit.ly/2FzVnuH
Polyurethane foam filler	Non-specific part
Quantum sensor	LI-COR, Lincoln, Nebraska, USA.	LI-190R	For calibration of PARbars only. URL for commercial source: https://bit.ly/2HEfKbh
Screwdrivers	Non-specific part
Silicone sealant	Non-specific part
Solder	Non-specific part
Solder flux pen	Non-specific part
Soldering iron	Non-specific part
Spirit/bubble level	Non-specific part
Tap and die set	Non-specific part
Two-core cable	Non-specific part
Voltmeter	Non-specific part
Waterproof connectors	Core Electronics, Adamstown, NSW, Australia.	ADA743	2 core waterproof connector. DC power connectors work well. URL for commercial source: https://bit.ly/2Brcrik