低アタッチメントプレートで調製されたヒト擬似スイスレットにおけるレンチウイルス媒介遺伝子サイレンシング

要約

短いヘアピンRNA(shRNA)を運ぶレンチウイルスによってトランスネクションされた分散ヒトイストレット細胞から遺伝子改変ヒト擬似を作成するプロトコルが提示される。このプロトコルは、容易に入手可能な酵素および培養容器を利用し、容易に行うことができ、機能的および形態学的研究に適した遺伝子改変ヒト擬似性を産生する。

要約

糖尿病研究のために島の遺伝子の機能を解剖するために、げっ歯類の膵島の遺伝子を調節するための様々な遺伝的ツールが利用可能です。しかし、げっ歯類の島から得られたデータは、種間の島の構造と機能のよく知られた違いのために、ヒト島で完全に再現または適用可能でないことが多い。現在、ヒト島の遺伝子発現を操作するために利用できる技術は非常に限られている。アデノウイルス、プラスミド、オリゴヌクレオチドによる無傷の島へのトランスジーンの導入は、多くの場合、低効率および高毒性に苦しむ。低効率は、高効率を必要とする無傷の島における遺伝子ダウンレギュレーション研究において特に問題となる。酵素的に分散した島細胞は、擬似性と呼ばれるスフェロイドを形成する培養中に再凝集させることが知られている。ヒト島細胞のサイズ制御された再凝集は、長期培養後に動的な第1相インスリン分泌を維持し、毒性の低いレンチウイルスショートヘアピンRNA(shRNA)を効率的に導入する窓を提供する擬似的な物質を作成する。ここで、2つの市販のマルチウェルプレートを用いたレンチウイルス伝達後のヒト擬似液性の作成のための詳細なプロトコルについて説明する。プロトコルは容易に行うことができ、遺伝子の効率的なダウンレギュレーションとヒトのイレット細胞を使用したインスリン分泌のダイナミズムの評価を可能にする。したがって、レンチウイルス媒介遺伝子変調を有するヒト擬似性液は、ヒト島細胞内の遺伝子機能を評価するための強力で汎用性の高いモデルを提供する。

概要

機能性β細胞塊の喪失は、1型および2型糖尿病1の両方の中心病理である。β細胞は膵島におけるインスリンの産生であるが、β細胞と非β細胞との間の通信は、インスリン分泌2の調節において重要な役割を果たす。また、グルカゴン分泌の調節不自由は^糖尿病3における高血糖に寄与する。したがって、膵島内の細胞の遺伝子発現を調節し、糖尿病における膵島機能障害の発症のメカニズムに対処することに強い関心がある。トランスジェニックマウスを含む様々なアプローチは、マウス島の遺伝子発現を調節するために利用可能である。しかしながら、ヒトおよびマウスの島は、明確な内向性、細胞分布、β対α細胞の比率、および分泌^物4に対する応答を示す。したがって、ヒト膵島における遺伝子機能の直接評価は、ヒト膵島の病態生理学を理解するために非常に重要である。

アデノウイルスベクターは、非分裂細胞におけるトランスダクションの高効率に起因するインビトロで膵島をトランスデュースするために最も広く使用されているウイルスベクターである。しかしながら、アデノウイルスは、特にヒト島5において効率的に島のコアに浸透せず、高用量6で細胞傷害性である。比較的、レンチウイルスベクターは細胞傷害性が低く、外因性遺伝子をポスト有人細胞の染色体に永久に産生し、遺伝子治療7の広くテストされた手段となる。しかしながら、無傷のヒト島のコアに侵入するレンチウイルスの能力も制限され、従って経誘導効率を高めるために酵素消化による部分的な分散を必要とする8。無傷のヒト島の分散に伴う注意点は、細胞および細胞マトリックス通信の中断であり、これはヒト^におけるグルコース恒常性の維持に不可欠なインスリン分泌の動的調節を損なう9。したがって、ヒト島のモデルにおける島機能の動的調節に対する遺伝子変調の影響を評価することは困難であった。

ヒトとげっ歯類の島から分散した島細胞が「擬似島」と呼ばれる島様構造に自律的に再凝集させることが知られている。擬似島は、原住民の島10、11と同様のβおよび非β細胞分布を示す。さらに、長期培養後、天然島は徐々に堅牢な第1相インスリン分泌5、10、11、12を失う。しかしながら、擬似島は、同じ培養期間5の後に天然島と比較してグルコースに応答して第1相インスリン分泌のより良い保存を実証した。インスリン分泌のより良い保存に加えて、低アタッチメント^{プレート11}におけるヒトイヌレット細胞のサイズ制御再凝集は、その再凝集前にレンチウイルスベクターを導入する機会の窓を提供する。擬似島。いくつかの研究は、レンチウイルス媒介伝達伝達と組み合わせた擬似島の有用性を実証している。Caton et al. al. は13,レンチウイルスを発現する緑色蛍光タンパク質(GFP)の導入は、非感染対照と比較してラット擬似性のGFPの均質な発現を達成しながら、インスリン分泌にほとんど影響を及ぼさないことを報告した。彼らはまた、レンチ^{ウイルス13}を介してコネキシン32、36、および43を過剰発現することにより、インスリン分泌に対する異なるコネキシンの特定の効果を実証した。市販の96ウェル超低アタッチメントプレートを用いて調製されたヒト擬似酵素は、転写因子SIX3のレンチウイルス媒介過剰発現が静的インキュベーション14によって評価されるインスリン分泌を改善することを実証した。最近では、96ウェルの超低アタッチメントプレートで調製したヒト擬似糸は、グルキナーゼをレンチウイルスショートヘアピンRNA(shRNA)を介して下方調整し、グルコース刺激インスリン分泌が減少することを示す原理の証明として用いられた。KCl刺激インスリン分泌^は5を保存した。この研究はまた、ヒト擬似離島が遺伝子発現および分泌プロファイルにおける天然島に類似していることを実証し、さらに、島^機能5の調節を解剖するヒト擬似島の有用性を支持する。多灌合は行われなかったが、最近市販されたバイオエンジニアリングマイクロウェル培養プレートは、レンチウイルス伝達に適合すると報告され、優れたインスリンを発揮するヒト擬似性を産生した。移植後のインビトロとインビボでの分泌¹¹.集合的に、レンチウイルス伝達と組み合わせたヒト擬似スサイスレット形成は、ヒト島の病態生理学を調査するための簡単で効率的なアプローチであり、ヒト島における機械的研究を行うための貴重なツールを提供する。

本報告では、市販の2つのプラットフォームを用いてレンチウイルスで誘導されたヒト擬似性を形成するプロトコル、96ウェル超低アタッチメントプレートおよびマイクロウェル培養プレートが提示される。どちらも遺伝子発現の効率的な変調を実現し、静的インキュベーションやペリフュージョンを含む下流評価に対応するヒト擬似液を作成します。

プロトコル

研究開始に先立ち、アイオワ大学機関レビュー委員会がヒト被験者の研究判断を行い、その研究がヒト被験者研究の基準を満たしていないと判断した。研究の開始前に現地の審査委員会に相談して、島の供給源と計画された研究に事前の承認が必要かどうかを判断します。

注:通常、1,200~1,400個のヒト島(IEQ)は、96ウェルの超低アタッチメントプレートまたは1,200個の擬似アタッチメントプレートで3,000細胞/擬似島の大きさで192個の擬似島を形成するために必要とされる。マイクロウェル培養プレート。必要な島のIEQは、ドナー因子(年齢、健康、体重)、単一細胞懸濁液の収率に影響を与える単細胞の収量に影響を与えるとしてヒト島の異なる調製物間で異なる。このプロトコルでは、目的の遺伝子を標的とするshRNAを含むレンチウイルスが使用される。サイトメガロウイルス(CMV)およびヒトホスホグリレートキナーゼ(hPGK)プロモーターベースのレンチウイルスベクターは、ヒト擬似島で遺伝子を効率的にダウンレギュレートすることが報告され、5,15。レンチウイルスの使用は、バイオ^{ハザード16}として予防措置を必要とします。レンチウイルスの使用を開始する前に、地元のバイオセーフティ委員会に連絡してください。

1. 出荷後の回復のための人間の島の一晩の文化

1. CMRL-1066の50mL、HSAの0.5g、ペニシリン連鎖マイシンの0.5mL、および100mg/mLの0.5mLを組み合わせることで、1%のヒト血清アルブミン(HSA)を補充したコナウト医学研究所1066(CMRL-1066)培地を調製安全キャビネット(BSC)および殺菌のための0.2 μmフィルターを通す。
2. 島をサスペンションに保つために、出荷ボトルをそっと旋回します。島を含む出荷媒体を50 mLの円錐遠心管に移します。チューブは、島がチューブの底に落ち着くように15分間BSCに座ってみましょう。
3. 10 mLピペットを使用して島のペレットを邪魔することなく、出荷媒体を穏やかに取り外します。1% HSA CMRL で島ペレットを 400 IEQ/mL の濃度に再中断します。
4. 島を非組織培養処理皿に移す。島が複数の皿に分割されている場合は、分割する前に穏やかに旋回することにより、中に均等に吊り下げられた島を保ちます。培養島を一晩5%CO2インキュベーターで37°Cにする。
   注:プレートへの島の付着を防ぐために、非組織培養処理皿の使用が必要である。

2. ヒト島からの単細胞懸濁液の調製

1. CMRL-1066は、室温(RT)で10%の熱不活性化胎児ウシ血清(HiFBS)、ペニシリン連鎖変調、グルタミン(10%HiFBS CRML)、40μmストレーナー、35mmペトリ皿、1mLの結核を含む培地を用意します。
2. 一晩培養後に人間の島を15mLの円錐遠心管に移す。スイングバケットローターで5分間190 x gの遠心分離機。島ペレットを邪魔することなく、5 mLピペットで媒体を吸引します。
3. 10mLのリン酸緩衝生理食生(PBS)をチューブに加えてペレットを洗浄し、190 x gで5分間混ぜ、遠心分離機を5分間吸引します。
4. P1000ピペットを使用して、予め温められたプロテオ溶解酵素およびコラーゲン溶解酵素混合物の0.5 mLで島ペレットを再中断し、ピペット5xを混ぜます。37°Cで5分間インキュベートし、上下に1~5回ピペッティングして混ぜます。
   注:積極的なピペッティングは、細胞の損失を増加させます.
5. 曇り(単一細胞)とフレークの数(未消化の島)を確認します。曇りとフレークの数で判断した消化の程度に応じて、37°Cのインキュベーションに2-3分を加えます。フレークが消化不良の約10%に減少し、溶液が曇っている場合は消化を停止します。
   注:消化に要する時間は、各ヒトのイレット製剤の分化により異なります。
6. 35mmペトリ皿に40μmのストレーナーを置き、10%HiFBS CMRLの1 mLを追加し、1 mLシリンジプランジャーで押すことによってストレーナーを濡らします。ストレーナーの上にすべてのセルサスペンションを転送し、新鮮な15 mLチューブでパススルーを収集します。
7. 残りの細胞を集め、ストレーナーを通して洗浄を渡すために新鮮なCMRL培地の0.5 mLでアイズレ消化に使用するチューブを洗浄します。15 mLチューブでパススルーを組み合わせます。1 回繰り返します。
8. 次に、1 mLシリンジプランジャーで35mm皿に置かれたストレーナーを押して、ストレーナーに残っている消化されていない島を解離します。再びパススルーを収集し、ストレーナーと皿から残りの消化された島をすべて除去するために、新鮮なCMRL-1066でストレーナーを洗浄します。15mLチューブにシングルセルサスペンションの合計約3mLが入ります。
9. 細胞懸濁液の総体積を記録し、10 μLの細胞アリコートを取り、血球計で細胞数を数えます。
10. 200 x gで5分間セル懸濁液を遠心分離します。ペレットを邪魔することなく培地を取り除く。96ウェルの超低アタッチメントプレートを使用する場合はステップ3.1.1に進み、24ウェルマイクロウェル培養プレートを使用して細胞を再凝集させる場合は、ステップ3.2.1に進みます。

3. レンチウイルスによる擬似スレット形成と経度

1. 96ウェル超低アタッチメントプレートを使用したプロトコル
   1. 擬似イスレットあたりの所望のセル数と作成する擬似数の数を決定します。通常、96ウェルの超低アタッチメントプレートには、各擬似レンズに1,000~3,000個の細胞が使用されます。擬似スレット当たり3,000細胞の場合、30 μLの細胞懸濁液が3,000細胞を持つように、ステップ2.10から10%HiFBS CMRLで島ペレットを再懸濁することにより、細胞懸濁液を1 x 10⁵細胞/mLに調整します。次の式を使用して必要な単一細胞懸濁液(mL)の1 x 10⁵セル/mLの総体積を計算します。
      単一細胞懸濁液(mL)の1 x 10⁵細胞/mLの総容積=(擬似イスレット当たりの細胞数)×(作られている擬似数の数)/1 x 10^5。
      注:細胞懸濁液の30 μLが1つの擬似イスレットを作るように、擬似スレットあたりの所望の数に基づいて細胞懸濁液の濃度を調整します。
   2. 単一細胞懸濁液の必要な容積(30 μL x 作られている擬似数)を新鮮な15 mLチューブに移します。目的または対照の遺伝子を標的とするshRNAを含むレンチウイルスの250トランスダクションユニット(TU)/細胞を追加する。
      注意:レンチウイルスはバイオセーフティレベル2に分類され、感染細胞のDNAに統合することができます。
      注:濃縮レンチウイルスを使用して、レンチウイルスの添加量が最小限に抑えられるようにします。効率的な遺伝子サイレンシングのために細胞当たりに必要なチターは、レンチウイルス構造によって異なる場合があります。
   3. P1000ピペットで5倍のピペッティングでウイルスと細胞懸濁液を混合します。8チャンネルピペットを使用する場合は、混合細胞を50 mL無菌試薬貯蔵所に移します。
   4. ウェルの数に応じて、8チャンネルピペットまたはP200ピペットを使用して、各ウェルにレンチウイルスを混合した単一細胞懸濁液のウェルあたり30 μLを分配します。
   5. 7分間RTで270 x gのスイングバケツプレート遠心分離機で96ウェルプレートを遠心分離します。そうでない場合は、井戸の中心にあるすべての細胞の集合体として再び遠心分離機が擬似石形成に重要である。加湿5%CO2インキュベーターで一晩37°Cで培養する。
   6. その後の培養中に細胞の乾燥を避けるために、翌朝井戸あたり100μLの予め温められた10%HiFBS CMRLを追加します。遠心分離機 270 x g、RT 7 分 37 °C での培養 5% CO₂インキュベーター。擬似島は5−7日で形成を完了する。
   7. 擬似石を収穫する場合は、10%HiFBS CMRL(100μL/島)の所望の体積を予め温め、50 mLの滅菌貯留槽、1つの無菌10cmペトリ皿、およびBSCで1つの8チャンネルピペットを調製する。
   8. インキュベーターから96ウェルプレートを取り出し、BSCに置きます。ピペット 100 μL の 10% HiFBS CMRL を貯水池に入れます。
   9. ピペット100 μL 10%のウェル当たり10%HiFBS CMRLを貯水池から擬似島に、ピペットを上下2-3回、島を持ち上げるために井戸で2-3倍の上下にします。次いで、擬似石を含むウェル内の吸引培地を10cmペトリ皿に吐出する。8チャンネルピペットの使用は一度に8つの擬似島の移動を可能にする。
   10. 小顕微鏡でプレートをチェックして、すべての擬似点を完全に除去します。擬似イスレットは、しっかりした凝集体を形成し、持ち上げた後も凝集したままである。擬似島はこれで下流実験の準備が整いました。
2. 24ウェルマイクロウェル培養プレートを用したプロトコル
   1. 効率的なスフェロイド形成のための抗付着すすす液(材料の表)をRTにウォームアップします。また、温暖なプレーンCMRL-1066および10%HiFBS CMRL。
   2. 擬似島に使用する24ウェルマイクロウェル培養プレートの各ウェルに、付着防止すすす液のウェル当たり500μLを追加します。スイングバケットプレート遠心分離機で5分間1,300 x gの遠心分離機。
   3. 顕微鏡でプレートを観察し、気泡がマイクロウェルから除去されていることを確認します。気泡がマイクロウェルに閉じ込められている場合は、1,300 x gで5分間遠心分離機を再び。
   4. BSCの井戸から抗付着すすす液を吸引する。2 mLの温かいプレーンCMRL-1066で各井戸を一度すすいで下さい。吸引CMRL-1066。使用予定の各ウェルに 0.5 mL/ウェルの暖かい 10% HiFBS CMRL を追加します。井戸は今ステップ2.10で調製された分散したヒトの化液細胞をロードする準備ができている。
   5. 各ウェルに必要なセルの合計数を決定します。24ウェルマイクロウェル培養プレートの1つのウェルは、1,200マイクロウェルを含み、1,200の擬似島を形成する。擬似イスレットx1200マイクロウェル当たり500細胞=6 x 10⁵細胞。ステップ2.10から6 x 10⁵細胞の0.8 mLの10%HiFBS CMLを無菌1.5 mLチューブで再懸濁する。
      注:ウェルあたりの最大容積は2 mLです。セル懸濁液の体積は1.5 mLを超えてはならない。このプロトコルは、レンチウイルスによって誘導された擬似スチスレットの1つの井戸を作成するためのステップを説明する。各レンチウイルスのために作られる井戸の数に応じてスケールアップ。
   6. ウイルス伝達の場合は、単一細胞懸濁液に125 TU/セルを追加します。ウイルスの体積を 0.2 mL 以下に保ちます。ステップ3.2.8で細胞の凝縮前にウイルスと細胞の接触を可能にするために、1時間の時折穏やかな混合で37 °Cで細胞とウイルス混合物をインキュベートします。
      注:濃縮レンチウイルスを使用して、レンチウイルスの添加量が最小限に抑えられます。セル数あたりの培地数の総容積が少ないため、プロトコル 2 ではプロトコル 2 に使用される TU の数が少なくなります。しかし、効率的な遺伝子サイレンシングのために細胞当たりに必要な力価は、レンチウイルス構造と最適化が必要に応じて異なる場合があります。
      注意:レンチウイルスはバイオセーフティレベル2に分類され、感染細胞のDNAに統合することができます。
   7. 1時間後、10%のHiFBS CMRLを加えることによって、1 mLに入った入り物細胞およびウイルス混合物の総体積を調整する。細胞が1時間インキュベーション後に塊を形成する場合、穏やかで迅速なピペッティング2−3回により単一細胞懸濁液に分散する。ピペッティングは、マイクロウェル間の細胞の分布においても非常に重要です。細胞懸濁液を24ウェルマイクロウェル培養プレートの1ウェルに移す。
   8. ピペッティングの直後に、RTで3分間100xgの遠心分離機を使用して、すべてのマイクロウェルに細胞を捕捉します。 顕微鏡で観察し、細胞がすべてのマイクロウェルに均等に分布していることを確認します。
   9. マイクロウェル培養プレートを5%CO2インキュベーターで37°Cで培養する。擬似島は24-48 hで形成され、擬似島は7日間まで中程度の変化なしに培養することができる。
   10. 培養培地を7日を超えて変化する場合は、以下のように培地変化ごとに培地の50%−75%を置き換える。各ウェルからP1000ピペットを使用して、培地の0.5−1 mLをゆっくりと取り外します。マイクロウェル培養プレートから擬似島を取り除くことを避けるために、井戸の壁に先端を置くことによって、新鮮な10%HiFBS CMLの0.5−1 mLをゆっくりと追加します。
   11. 擬似島の収穫に備えるには、10%HiFBS CMRL培地を温める。擬似島は、それらを選ぶのが難しい血清フリーCMRL-1066に浮かぶ傾向があります。
   12. 1 mLピペットを使用して培地の0.5mLをうまく吸引し、マイクロウェル培養プレートから擬似性を持ち上げるために、メディアをプレート表面に強制的に戻します。
   13. 1 mLピペットを用いて脱落した擬似液を穏やかに吸引し、6ウェルプレートを処理した非組織培養に島を移移す。15 mL円錐形の管に置かれる小さい37 μmの可逆のストレーナーを通す。擬似島はフィルタに残ります。組み込まれな単一のセルが流れます。
       注:ストレーナーを介してより小さいサイズの擬似島の損失を避けるために、ストレーナーは省略され得る。
   14. 10%HiFBS CMRLの1 mLをウェルの表面全体に分配し、残りの擬似島を取り除き、吸引解除された擬似島を吸引し、ストレーナーを通過する。ウェルからすべての疑似物の完全なコレクションを確保するために3倍を繰り返します。
   15. 反転顕微鏡下のマイクロウェル培養プレートを観察し、すべての擬似点が収集されていることを確認します。擬似液が残っている場合は、ステップ3.2.14のように洗浄を繰り返します。

4. 遺伝子サイレンシング効率評価のためのRNA抽出

1. 1.5mLマイクロ遠心管でRNaseフリーPBSに擬似液を取り込み、遠心分離機を300 x gで300 x gで4°Cで選択します。島のペレットを乱さずにPBSを取り出し、PBSで一度洗い、その後4°Cで3分間300xgで遠心分離を行います。
2. P1000ピペットを使用してPBSのほとんどを吸引します。次に、P10ピペットに変更して、島ペレットを邪魔することなくPBSの残りの部分を除去します。
3. チューブあたり0.5 mLのグアニジニウムチオシアネートRNA抽出試薬(材料表)を追加します。2−3回、モーター駆動の害虫を使用して擬似性を均質化します。グアニジニウムチオシアネートRNA抽出試薬中の均質化は、-80°Cで保存するか、RNA精製のために処理することができます。
   注:マイクロウェル培養プレートに形成された500個の細胞擬似液で形成された3,000個の細胞擬似スイストレットのうち24個または48個が、RNAの0.5−1 μgを得るのに十分である。

結果

図1は、96ウェル超低アタッチメントプレートとマイクロウェル培養プレートを用いて擬似液を製造する上での重要なステップを示す。図2aは、96ウェル超低アタッチメントプレートにおける3 x 10³ヒト島細胞からの擬似性細胞形成中の形態の逐次変化を示す。1日目に観察された細胞の単層または緩い塊は、5日目から7...

ディスカッション

ここで、96ウェル超低アタッチメントプレートまたはマイクロウェル培養プレートを用いてレンチウイルスによって誘導されるヒト擬似液を生成する詳細なプロトコルが提示される。擬似島は、天然ヒト島に類似した形態および分泌機能を示すために報告されており、インビトロ5、11、18で長期間培養することができる。?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-adherence rinsing solution	Stemcell technologies	7919
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 Series Type A2
cell strainer, 40 micrometer	Corning	431750
CMRL-1066	ThermoFisher	11530037
CO2 incubator	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i
conical centrifuge tube, 15 mL	VWR	89039-666
conical centrifuge tube, 50 mL	VWR	89039-658
fetal bovine serum	ThermoFisher	26140079
guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent	ThermoFisher	15596026	Trizol
glutamine	ThermoFisher	25030164
Hemocytometer	Marien Feld	Neubauer-Improved Bright line
Human serum albumin	Sigma	A1653
inverted microscope	Fisher brand	11-350-119
microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 20
microcentrifuge tube, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
microwell culture plate	Stemcell technologies	34411	Aggrewell 400, 24 well
motor-driven pestle	GAMUT	#399X644
non-tissue culture treated dish, 10 cm	Fisher Scientific	FB0875713
PBS	ThermoFisher	14190250
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	10378016
Petri dish, 35 mm	Celltreat	229638
pipette, 5 mL	DOT Scientific,	667205B
pipette, 8-channel	VWR	#613-5253
pipette, 10 mL	VWR	667210B
pipette, P10	Denville	UEZ-P-10
pipette, P200	Denville	UEZ-P-200
pipette, P1000	Denville	UEZ-P-1000
proteolytic and collagenolytic enzyme mixture	Sigma	A6965	Accutase
reagent reservoir, 50 mL	VWR	89094-680
reversible strainer, 37 micrometer	Stemcell technologies	27251
swing bucket plate centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-14R
swing bucket rotor	Beckman Coulter	SX4750A
tuberculin syringe, 1 mL	BD	309659
ultra low attachment microplate, 96 well	Corning	4515