Düşük ataşman plakalarına hazırlanmış ınsan Pseudoislet 'te lentiviral aracılı gen susturulması

Özet

Kısa saç iğnesi RNA (shrna) taşıyan Lentivirus tarafından dönüştürücü olan dağınık insan Islet hücrelerinden gen modifiye insan pseudoislets oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol kolay kullanılabilir enzim ve kültür gemileri kullanır, kolayca yapılabilir ve fonksiyonel ve morfolojik çalışmalar için uygun genetiği değiştirilmiş insan pseudoislets üretir.

Özet

Çeşitli genetik araçlar diyabetik araştırma için Islet genler fonksiyonunu incelemek için kemirgenler pankreatik adacıklar genleri modüle kullanılabilir. Ancak, kemirgen izletlerden elde edilen veriler genellikle Islet yapısında ve türler arasındaki işlevlerde bilinen farklılıklar nedeniyle insan izletine tam olarak çoğaltılamaz veya uygulanabilir değildir. Şu anda, insan izletlerinin gen ifadesini manipüle etmek için kullanılabilen teknikler çok sınırlıdır. Adenovirüs, plazmid ve oligonükleotidler tarafından bozulmamış adacıklar içine transgeni giriş genellikle düşük verimlilik ve yüksek toksisite muzdarip. Düşük verimlilik, yüksek verimlilik gerektiren bozulmamış izletlerinde gen downdüzenleme çalışmalarında özellikle problemlidir. Enzitatik olarak dağınık Islet hücrelerinin kültür oluşturan kürlerin pseudoislets olarak adlandırdığı bilinmektedir. İnsan Islet hücrelerinin boyutu kontrollü reaggregation uzun süreli kültürden sonra dinamik ilk faz insülin salgılanmasını korumak ve düşük toksisite ile lentiviral kısa saç iğnesi RNA (shrna) verimli bir şekilde tanıtmak için bir pencere sağlamak pseudoislets oluşturur. Burada, ticari olarak mevcut iki multiwell plakayı kullanarak lentiviral dönüştürücüden sonra insan pseudoislets oluşturulması için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Protokol kolayca gerçekleştirilebilir ve genlerin etkin şekilde düşürülmesine ve insan Islet hücrelerini kullanarak insülin salgılanması dinamizmi değerlendirmesine olanak tanır. Böylece, lentiviral aracılı gen modülasyonu ile insan pseudoislets insan Islet hücreleri içinde gen fonksiyonunu değerlendirmek için güçlü ve çok yönlü bir model sağlar.

Giriş

Fonksiyonel beta hücre kütlesi kaybı her iki tip 1 ve tip 2 diyabet¹için merkezi patolojidir. Beta hücreleri pankreas izletinde insülin üreticileri olmakla beraber, Beta hücreleri ve beta olmayan hücreler arasındaki iletişim, insülin salgılanmasını²' nin düzenlenmesi açısından kritik bir rol oynamaktadır. Buna ek olarak, glukagon salgılanması disregülasyon diyabette hiperglisemi katkıda³. Böylece, diyabette Islet disfonksiyon gelişiminin arkasındaki mekanizması ele pankreas izletler içinde hücrelerin gen ifadesi modüle güçlü bir ilgi vardır. Transgenik fareler de dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar fare izletlerinin Gen ifadesinin modülasyonu için kullanılabilir. Ancak, insan ve fare izletleri farklı innervasyon göstermek, hücre dağılımı, Alfa hücreleri Beta oranı, ve secretagogues yanıt⁴. Bu nedenle, insan izletlerinde gen fonksiyonunun doğrudan değerlendirilmesi, insan pankreatik izletinin patofizyolojisini anlamak için son derece önemlidir.

Adenoviral vektör en yaygın olarak kullanılan viral vektördir pankreas izletler in vitro transduce için yüksek verimlilik nedeniyle olmayan bölünmüş hücrelerde. Ancak, adenovirüs adacıklar çekirdeğine etkili bir şekilde nüfuz etmez, özellikle insan izletinde⁵, ve yüksek dozlarda sitotoksisdir⁶. Göreceli olarak, lentiviral vektör daha az sitotoksisdir ve post-mitotik hücrelerin kromozom içine kalıcı olarak eksojen genler sunar, gen terapisi için yaygın olarak test edilmiş bir araç haline⁷. Ancak, Lentivirus yeteneği bozulmamış insan izletlerin çekirdeğine nüfuz de sınırlıdır, böylece transksiyon verimliliği artırmak için enzimatik sindirim tarafından kısmi dağılım gerektiren⁸. Bozulmamış insan izletleri dağılımı ile uyarı insan⁹glikoz homeostazı bakımı için kritik insülin salgılanması dinamik düzenlenmesi ödün hücre hücresi ve hücre matris iletişim, kesintiye. Bu nedenle, gen modülasyonunun bir insan izletinin modelindeki Islet işlevinin dinamik olarak düzenlenmesi üzerine etkisini değerlendirmek zor olmuştur.

Bu, insan ve kemirgen izletler, "pseudoislets" adı verilen Islet benzeri yapıları içine otonoid reaggregate dağınık Islet hücreleri bilinmektedir. Pseudoislets Beta ve non-beta hücre dağıtımı yerel adacıklar^10,11benzer gösterir. Ayrıca, uzun dönem kültürden sonra, yerli adacıklar aşamalı olarak güçlü ilk faz insülin salgılanmasını kaybedersiniz^5,10,11,12. Ancak, pseudoislets ilk faz insülin salgılanmasını glikoz yanıt olarak aynı kültür dönemi sonra yerli adaylar ile karşılaştırıldığında daha iyi korunması göstermiştir⁵. İnsülin salgılanmasını daha iyi korumasına ek olarak, düşük ataşman plakaları¹¹ insan Islet hücrelerinin boyutu kontrollü reaggregation içine kendi reaggregation önce Lentivirus vektörler tanıtmak için fırsat bir pencere sağlar pseudoislets. Çeşitli çalışmalar lentiviral aracılı dönüştürücü ile birlikte pseudoislets yardımcı göstermiştir. Caton ve al.¹³ bu yeşil floresan protein (Gfp) Lentivirus ifade giriş insülin salgılanması üzerinde az etkisi olduğunu bildirdi, non-enfekte kontrol ile karşılaştırıldığında sıçan pseudoislets Gfp homojen ifade elde ederken. Onlar da connexins 32, 36 ve 43 Lentivirus¹³üzerinden Over, tarafından insülin salgılanması üzerinde farklı connexins spesifik etkisi göstermiştir. Ticari olarak kullanılabilen 96-Well Ultra düşük ataşman plakası ile hazırlanan insan pseudoislets, transkripsiyon faktörünün lentiviral aracılı ekspresyonu SIX3 statik inkübasyon ile değerlendirilen insülin salgılanmasını geliştirir¹⁴. Son zamanlarda, bir 96 ile hazırlanan insan pseudoislets-iyi Ultra-düşük ataşman plaka glukokinaz lentiviral kısa saç iğnesi RNA (shRNA) ile glikoz uyarılmış insülin salgılanması azaltılır göstermek için bir prensip kanıtı olarak, aşağı düzenlemek için kullanıldı KCl-stimüle edilmiş insülin salgılanması⁵. Çalışma aynı zamanda insan pseudoislets gen ifade ve salgılayan profillerde yerli izletlere benzer olduğunu göstermiştir, daha fazla Islet fonksiyon⁵düzenlenmesi incelemek için insan pseudoislets yardımcı destek. Perifüzyon yapılmadı olmasına rağmen, son zamanlarda ticari olarak mevcut hale gelen bir Biyomühendislik mikrowell kültür plakası, aynı zamanda lentiviral dönüştürücü için uyumlu olduğu bildirildi ve mükemmel insülin sergilenen insan pseudoislets üretilen transplantasyon sonrasında in vitro ve in vivo salgılanması¹¹. Lentiviral dönüştürücü ile birlikte insan pseudoislet oluşumu, insan Islet patofizyolojisini araştırmak için basit ve verimli bir yaklaşımdır ve insanlar arasında mekanik çalışmalar yapmak için değerli bir araç sağlar.

Mevcut raporda, ticari olarak kullanılabilen iki platform kullanarak Lentivirus ile transdüden insan pseudoislets oluşturmak için bir protokol, bir 96-Well Ultra-düşük ataşman plakası ve bir mikrowell kültür plakası sunulmaktadır. Her ikisi de Gen ifadesinin verimli modülasyonu elde etmek ve statik inkübasyon ve perifüzyon dahil olmak üzere aşağı değerlendirme için uyumlu insan pseudoislets oluşturmak.

Protokol

Çalışmalar başlamadan önce, bir insan konuları araştırma belirlenmesi, çalışma insan konuları araştırma kriterleri karşılamadı tespit Iowa kurumsal Inceleme kurulu, Üniversitesi tarafından yapılmıştır. İslet ve planlanmış çalışmanın kaynağının önceden onay gerektirip belirlenmesini belirlemek için çalışmanın başlangıcından önce yerel İnceleme tahtasına danışın.

Not: Genellikle, 3.000 hücre/pseudoislets bir 96-iyi Ultra-düşük ek plaka veya 1.200 pseudoislets içinde 500 hücre/pseudoislets boyutu 192 pseudoislets oluşumu için insan izletler 1200 − 1400 Islet eşdeğeri (IEQ) gereklidir bir mikrowell kültür plaka. Gerekli islet 'ler, donör faktörleri (yaş, sağlık, ağırlık), yalıtım verimliliği ve kültür koşulları tek hücreli süspansiyonun verimini etkileyen farklı insan izletlerinin hazırlıkları arasında farklılık gösterir. Bu protokolde, shRNA 'yı içeren lentivirüs bir ilgi geni hedefleyerek kullanılır. Sitomegalovirus (CMV) ve insan fosfogliserat kinaz (hpgk) organizatör bazlı lentiviral vektörler, insan pseudoislets^5,15' te gen 'yi etkili bir şekilde düzenlemeye yönelik olarak bildirilir. Lentivirus kullanımı biyolojik tehlike¹⁶olarak önlem gerektirir. Lentivirus kullanımı başladıktan önce yerel Biyogüvenlik Komitesi ile iletişime geçin.

1. Sevkiyat sonrası kurtarma için ınsan Islets gece kültürü

1. Hazırlamak Connaught Medikal araştırma laboratuvarları 1066 (cmrl-1066) orta ile tamamlayıcı 1% insan serum albümin (HSA) birleştirerek 50 ml cmrl-1066, 0,5 g HSA, 0,5 ml penisilin-streptomisin ve 0,5 ml, 100 mg/ml glutamin (1% HSA cmrl) biyolojik güvenlik dolabı (BSC) ve sterilizasyon için 0,2 μm filtreden geçerek.
2. Yavaşça girdap taşıma şişesi askıya alma izletlar tutmak için. Bir 50 ml konik Santrifüjlü tüpüne adacıklar içeren sevkiyat ortamını aktarın. Boru BSC içinde 15 dakika böylece adacıklar tüp altına yerleşmek için oturmak edelim.
3. 10 mL pipet kullanarak Islet Pelet rahatsız etmeden yavaşça nakliye orta çıkarın. 400 IEQ/ml konsantrasyonuna% 1 HSA cmrl 'de Islet pelsini yeniden askıya alın.
4. Islets olmayan bir doku kültürü tedavi çanak içine aktarın. Adacıklar birden fazla yemeklerle bölünür ise, ayrışmadan önce hafifçe sarkarak orta aralıklarla eşit olarak askıya alınan adacıklar tutun. 37 ° c 'de kültür adacıklar, bir gecede% 5 Co₂ kuluçko.
   Not: Doku dışı kültür tedavi çanak kullanımı plakaya adacıklar eki önlemek için gereklidir.

2. Insan ıslets tek hücreli süspansiyon hazırlanması

1. Aşağıdakileri hazırlayın: CMRL-1066 orta% 10 ısı-inaktive fetal sığır serumu (Hıfbs), penisilin-streptomisin, ve glutamin (% 10 HiFBS CRML) Oda sıcaklığında (RT), bir 40 μm süzgeci, bir 35 mm Petri çanak, 1 mL tüberkülin şırınga, ve bir hemocytometer.
2. Gece kültüründen sonra insan izletlerini 15 mL konik Santrifüjlü tüpüne aktarın. 190 x g 'de Santrifüjlü, sallanan kova rotorda 5 dakika. 5 ml pipet ile aspirat orta, Islet Pelet rahatsız etmeden.
3. 10 ml fosfat-tamponlu tuzlu (PBS) tüp içine ekleyerek Pelet yıkayın, yavaşça karıştırın ve 5 dk. aspirate PBS için 190 x g Santrifüjü Islet Pelet rahatsız etmeden.
4. 0,5 mL 'Lik bir ön ısıtılmış proteolitik ve kolajagenolitik enzim karışımı ve pipet 5 ' inde, izletları karıştırmak için P1000 pipet kullanarak Islet pelleti yeniden askıya alın. 37 °C ' de 5 dakika boyunca kuluçk. 1 − 5 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile karıştırın.
   Not: Agresif pipetleme hücre kaybını artıracaktır.
5. Bulutsuz (tek hücreler) ve pul sayısını (sindirilmemiş adlet) kontrol edin. Bulutlu ve pul sayısı ile değerlendirilerek sindirim kapsamı bağlı olarak 2 − 3 dk 37 °C inkübasyon ekleyin. Tanecikleri ön sindirimi ~% 10 azaltılır ve çözüm bulutlu durdurmak.
   Not: Sindirim için gerekli zaman her insan Islet hazırlama Islet boyutu dağılımına bağlı olarak farklılık gösterir.
6. 35 mm Petri çanak bir 40 μm süzgeç yerleştirin ve 1 ml 10% Hıfbs CMRL ekleyerek ve 1 mL şırınga piston ile basma süzgeci ıslatın. Tüm hücre süspansiyonunu süzgecin üstüne aktarın ve taze 15 mL 'Lik bir tüpte pass-through ' ı toplayın.
7. Kalan hücreleri toplamak ve süzgeci ile yıkama geçmek için taze cmrl orta 0,5 ml ile Islet sindirim için kullanılan tüp yıkayın. 15 mL 'Lik bir tüpte pass-through ' ı birleştirin. Bir kez daha tekrarlayın.
8. Daha sonra, 1 mL şırınga pistonla 35 mm 'lik bir çanak içine yerleştirilen süzgeci basarak süzgecinde kalan sindirilmemiş izletleri ayırmak. Tekrar pass-through toplayın ve süzgeç ve çanak kalan tüm sindirilmiş adacıklar kaldırmak için taze cmrl-1066 ile süzgeci yıkayın. Toplam ~ 3 mL tek hücreli süspansiyon şimdi 15 mL tüp olacaktır.
9. Hücre süspansiyonunun toplam hacmini kaydedin ve bir hemokytometre üzerindeki hücre numarasını saymak için 10 μL hücreli hücreler alın.
10. 200 x g'de 5 dakika boyunca hücre süspansiyonunu santrifüjün. Pellet rahatsız etmeden orta çıkarın. Hücre yeniden toplamak için 24 iyi mikrokuyu kültür plaka kullanıyorsanız, bir 96-Well Ultra düşük ek plaka veya adım 3.2.1 kullanıyorsanız 3.1.1 adıma geçin.

3. Lentivirus tarafından pseudoislet oluşumu ve dönüştürücü

1. 96-Well Ultra düşük ataşman plakası kullanarak protokol
   1. Pseudoislet başına istenen hücre sayısını ve oluşturmak için pseudoislets sayısını belirleyin. Genellikle, 1000 − 3000 hücre, 96-iyi Ultra düşük bağlantı plakası için her pseudoislet için kullanılır. 3.000 için pseudoislet başına hücreler için, hücre süspansiyonu 1 x 10⁵ hücre/ml 'ye, adım 2,10 ' den 10% Hıfbs CMRL 'de, 30 μL hücreli süspansiyonun 3.000 hücreye kadar resuspending olarak ayarlayın. Aşağıdaki denklemin kullanılması gereken 1 x 10⁵ hücre/ml tek hücreli süspansiyon (ml) toplam hacmini hesaplayın:
      Toplam Hacim 1 x 10⁵ hücreler/ml tek hücreli süspansiyon (ml) = (pseudoislet başına hücre sayısı) x (pseudoislets yapılan sayısı)/1 x 10⁵.
      Not: Hücre süspansiyonunun konsantrasyonunu, pseudoislet başına istenen hücre sayısına göre ayarlayın, böylece 30 μL hücreli süspansiyon bir pseudoislet yapar.
   2. Tek hücreli süspansiyon için gerekli hacmi (30 μL x pseudoislets sayısı) taze 15 mL tüpüne aktarın. Ekle 250 dönüştürücü birimleri (TU)/Cell lentivirüs ile shRNA içeren bir gen ilgi veya kontrol hedefleyen.
      Dikkat: Lentivirus Biyogüvenlik düzeyi 2 olarak sınıflandırılır ve virüslü hücrelerin DNA 'ya entegre edilebilir.
      Not: Böylece Lentivirus hacmi minimal eklenen konsantre Lentivirus kullanın. Etkili gen susturulması için hücre başına gerekli titer lentiviral yapının bağlı olarak farklılık gösterebilir.
   3. Bir P1000 pipet ile hafifçe 5x pipetleme ile virüs ile karıştırma hücre süspansiyonu. 8 kanallı pipet kullanıldığında karışık hücreleri 50 mL steril reaktif rezervuar içine aktarın.
   4. 8 kanallı pipet veya kuyuların sayısına bağlı olarak P200 pipet kullanarak her bir kuyu içine Lentivirus ile karışık tek hücreli süspansiyon başına 30 μL dağıtın.
   5. 96-kuyu plakasını, 7 dak için RT 'de 270 x g 'de bir sallanan kova plaka santrifüjte santrifüjler. hücreleri her iyi ortasında toplanan olup olmadığını kontrol edin. Eğer değilse, kuyunun merkezindeki tüm hücrelerin toplanması olarak tekrar santrifüjler, pseudoislet oluşumu için önemlidir. 37 ° c 'de kültür, bir gecede% 5 CO₂ kuluçko içinde.
   6. Sonraki kültür sırasında hücrelerin kurumasını önlemek için, ertesi sabah iyi başına% 10 Hıfbs CMRL 100 μL ekleyin. 270 x g'de santrifüjle, 37 °c ' de 7 dk. kültür için% 5 Co₂ kuluçç. Pseudoislets 5 − 7 gün içinde oluşumu tamamlayacaktır.
   7. Pseudoislets hasat ederken,% 10 Hıfbs CMRL (100 μL başına Islet), 1 50 mL steril rezervuar, bir steril 10 cm Petri çanak ve BSC bir 8 kanallı pipet istenilen hacmine ön sıcak.
   8. 96-kuyu plakasını inküoradan ve BSC 'deki yerden çıkarın. Pipet 100% 10 Hıfbs CMRL başına bir rezervuar içine μL sağlar.
   9. Pipet 100 μL başına% 10 hıfbs cmrl için bir rezervuar gelen pseudoislets ve pipet yukarı ve aşağı 2 − 3 kez yavaşça iyi kaldırmak için adacıklar yukarı. Sonra, iyi bir pseudoislet içeren ve 10 cm Petri çanak içine çıkarmak orta Aspire. 8 kanallı pipetin kullanımı, 8 pseudoislets bir defada transfer sağlar.
   10. Tüm pseudoislets tamamen kaldırılması sağlamak için bir ışık mikroskop altında plaka kontrol edin. Pseudoislets firma toplamları formu ve kaldırma sonra toplanan kalır. Pseudoislets şimdi aşağı deneyler için hazırdır.
2. Protokol 24-iyi mikrokuyu kültür plaka kullanarak
   1. Verimli küroid oluşumu için anti-yapışma durulama solüsyonu (malzeme tablosu) RT 'ye kadar ısınır. Ayrıca, önceden sıcak düz CMRL-1066 ve% 10 Hıfbs CMRL.
   2. Pseudoislets için kullanılacak 24-kuyu mikrowell kültür plakasının her bir kuyusu için anti-yapışma durulama çözeltisi başına 500 μL ekleyin. 1.300 x g 'de Santrifüjlü, sallanan kova plaka santrifüjte 5 dakika.
   3. Hava kabarcıklarının mikrokuyudan çıkarıldığından emin olmak için plakayı mikroskop altında gözlemleyin. Hava kabarcıkları mikrokuyularda sıkışıp kalırsa, 1.300 x g 'de Santrifüjü tekrar 5 dk.
   4. BSC 'deki kuyulardan Anti-yapışma durulama çözeltisi aspirate. Her iyi 2 mL sıcak düz CMRL-1066 bir kez durulayın. Aspirate CMRL-1066. Eklemek 0,5 mL/Well sıcak 10% Hıfbs CMRL her iyi kullanım için planlanmış. Wells şimdi 2,10 adımda hazırlanan dağınık insan Islet hücreleri yükleme için hazırdır.
   5. Her iyi için gereken hücrelerin toplam sayısını belirleyin. Bir iyi 24-iyi mikrokuyu kültür plaka içerir 1.200 Mikrokuyucuklu ve formları 1.200 pseudoislets. 500 pseudoislet x 1200 Mikrokuyucuklu başına hücreler = 6 x 10⁵ hücreler. Bir steril 1,5 mL tüpte 0,8 mL 'de% 10 Hıfbs CMRL 'de adım 2,10 ila 6 x 10⁵ hücrelere resuspend tek hücreler.
      Not: İyi başına maksimum hacim 2 mL 'dir. Hücre süspansiyonunun hacmi 1,5 mL 'yi geçmemelidir. Protokol, Lentivirus tarafından dönüştürücü bir pseudoislet bir iyi oluşturmak için adımlar açıklanmaktadır. Her Lentivirus için yapılacak kuyuların sayısına bağlı olarak ölçeklendirin.
   6. Viral dönüştürücü için, tek hücreli süspansiyon 125 TU/Cell ekleyin. Virüs hacmi 0,2 mL aşağıda tutun. Hücre ve virüs karışımı 37 °C ' de zaman zaman yumuşak karıştırma ile 1 saat boyunca hücrelerin yoğunlaşma önce virüs ile hücre temas izin vermek için adım 3.2.8.
      Not: Lentivirus hacmi minimum olduğunu böylece konsantre Lentivirus kullanın. Hücre başına orta toplam hacmi daha az olduğu gibi protokol 1 ile karşılaştırıldığında iletişim kuralı 2 için her hücrenin daha düşük TU sayısı kullanılır. Ancak, verimli gen susturulması için hücre başına gerekli titresi lentiviral yapı ve ihtiyaç optimizasyonu bağlı olarak farklılık gösterebilir.
      Dikkat: Lentivirus Biyogüvenlik düzeyi 2 olarak sınıflandırılır ve virüslü hücrelerin DNA 'ya entegre edilebilir.
   7. 1 h sonra,% 10 Hıfbs CMRL ekleyerek Islet hücresi ve virüs karışımının toplam hacmini 1 mL 'ye ayarlayın. Hücreler 1 h inkübasyon işleminden sonra küme oluştururlar, yumuşak ve hızlı pipetleme 2 − 3 kez tek hücreli süspansiyona dağıtın. Pipetleme, hücrelerin microwells arasında dağılımı için de çok önemlidir. 24-iyi mikrowell kültür plakasının bir kuyusu için hücre süspansiyonunu aktarın.
   8. Hemen sonra pipetleme, 100 x g 'de SANTRIFÜJLER, RT 'de 3 dakika boyunca hücreleri tüm mikrokuyulara yakalayın. Hücrelerin tüm microwells içinde eşit şekilde dağıtıldığını doğrulamak için mikroskop altında gözlemlemek.
   9. 37 °C ' de mikrowell kültür plakasını% 5 CO₂ inkükote kültür. Pseudoislets 24 − 48 h içinde yapılacaktır. Pseudoislets 7 güne kadar orta değişim olmaksızın kültürlü olabilir.
   10. Ortamı 7 gün ötesinde kültür için değiştirirken, her Orta değişim için orta% 50 −% 75 ' i aşağıdaki gibi değiştirin. Her bir kuyu için bir P1000 pipet kullanarak 0,5 − 1 mL orta yavaş yavaşça çıkarın. Mikrokuyu kültür plakasından gelen pseudoislets önlemek için iyi duvara bir ipucu koyarak yavaşça% 10 hifbs cmrl 0,5 − 1 ml ekleyin.
   11. Psöfilislet hasat hazırlanmak için,% 10 HiFBS CMRL orta ısınır. Pseudoislets serum ücretsiz CMRL-1066 onları almak zor hale kadar float eğilimindedir.
   12. Mikrowell kültür plakasının pseudoislets yukarı kaldırmak için bir 1 mL pipet kullanarak iyi orta 0,5 mL aspirate ve medya zorla plaka yüzeyine geri dağıtmak.
   13. 1 ml pipet ve transfer izletlerini, 6-kuyu plakası ile işlenmiş olmayan bir doku kültürüne kullanarak yavaşça Aspire edilen pseudoislets. 15 mL konik tüpün üzerine yerleştirilen küçük bir 37 μm geri dönüşümlü süzgeci geçirin. Pseudoislets filtrede kalacaktır; herhangi bir unıncorporated tek hücre üzerinden akacak.
       Not: Süzgeç yoluyla küçük boyutlu pseudoislets kaybını önlemek için, süzgeç atlanabilir.
   14. Kalan pseudoislets ortadan kaldırma, yerinden pseudoislets Aspire ve süzgeç üzerinden geçmek için kuyu tüm yüzeyi boyunca% 10 hıfbs cmrl 1 ml dağıtma. Kuyuların tüm pseudoislets tam toplama sağlamak için 3x tekrarlayın.
   15. Tüm pseudoislets toplanan emin olmak için bir ters mikroskop altında mikrokuyu kültür plaka gözlemlemek. Pseudoislets kalırsa adım 3.2.14 gibi yıkama tekrarlayın.

4. gen susturma verimliliğinin değerlendirilmesi için RNA ekstraksiyonu

1. 1,5 mL mikrosantrifüjten tüp içinde RNase ücretsiz PBS içine pseudoislets seçin ve 4 °C ' de 3 dakika için 300 x g Santrifüjü. PBS 'i, 4 °C ' de 3 dakika boyunca 300 x g 'de santrifüjleme ve ardından PBS ile bir kez yıkanmadan çıkarın.
2. Bir P1000 pipet kullanarak PBS çoğu aspirate. Sonra, bir P10 pipet değiştirmek PBS geri kalanı Islet Pelet rahatsız etmeden kaldırmak için.
3. Tüp başına 0,5 ml guanidinyum tiyosiyanat RNA ekstraksiyon reaktif (malzeme tablosu) ekleyin. 2 − 3 kez motor tahrikli bir havaneli kullanarak pseudoislets homojenize. Guanidinyum tiyosiyanat RNA ekstraksiyon reakajında homojenlik artık-80 °c ' de depolanabilir veya RNA arıtma için işlenir.
   Not: 3.000 hücre-pseudoislets bir 96 iyi plaka veya 48 bir mikrokuyu kültür plakasında oluşan 500 hücre-pseudoislets içinde oluşan 0.5 − 1 μg RNA elde etmek için yeterlidir.

Sonuçlar

Şekil 1 , 96-iyi Ultra düşük ataşman plakası ve mikrokuyu kültür plakası kullanılarak pseudoislets üretiminde önemli adımları göstermektedir. Şekil 2a , 96-iyi Ultra düşük ataşman plakasında 3 x 10³ insan Islet hücrelerinden pseudoislets oluşumu sırasında morfolojide sıralı değişiklikler gösterir. 1. gün içinde gözlenen hücrelerin monolayer veya gevşek kümeleri, 5 ile 7 arasında pü...

Tartışmalar

Burada, Lentivirus tarafından bir 96-Well Ultra-düşük ataşman plakası veya bir mikrokuyu kültür plakası kullanılarak dönüştürücü olan insan pseudoislets oluşturmak için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur. Pseudoislets Morfoloji ve salgı fonksiyonları yerli insan izletlerine benzer göstermek için bildirilmiştir ve uzun süre içinde vitro^5,11,18kültürsüz olabilir. Boyutu geniş bir varyasyon göstere...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-adherence rinsing solution	Stemcell technologies	7919
Biological safety cabinet	Thermo Scientific	1300 Series Type A2
cell strainer, 40 micrometer	Corning	431750
CMRL-1066	ThermoFisher	11530037
CO2 incubator	Thermo Scientific	Heracell VIOS 160i
conical centrifuge tube, 15 mL	VWR	89039-666
conical centrifuge tube, 50 mL	VWR	89039-658
fetal bovine serum	ThermoFisher	26140079
guanidinium thiocyanate RNA extraction reagent	ThermoFisher	15596026	Trizol
glutamine	ThermoFisher	25030164
Hemocytometer	Marien Feld	Neubauer-Improved Bright line
Human serum albumin	Sigma	A1653
inverted microscope	Fisher brand	11-350-119
microcentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 20
microcentrifuge tube, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
microwell culture plate	Stemcell technologies	34411	Aggrewell 400, 24 well
motor-driven pestle	GAMUT	#399X644
non-tissue culture treated dish, 10 cm	Fisher Scientific	FB0875713
PBS	ThermoFisher	14190250
Penicillin-streptomycin	ThermoFisher	10378016
Petri dish, 35 mm	Celltreat	229638
pipette, 5 mL	DOT Scientific,	667205B
pipette, 8-channel	VWR	#613-5253
pipette, 10 mL	VWR	667210B
pipette, P10	Denville	UEZ-P-10
pipette, P200	Denville	UEZ-P-200
pipette, P1000	Denville	UEZ-P-1000
proteolytic and collagenolytic enzyme mixture	Sigma	A6965	Accutase
reagent reservoir, 50 mL	VWR	89094-680
reversible strainer, 37 micrometer	Stemcell technologies	27251
swing bucket plate centrifuge	Beckman Coulter	Allegra X-14R
swing bucket rotor	Beckman Coulter	SX4750A
tuberculin syringe, 1 mL	BD	309659
ultra low attachment microplate, 96 well	Corning	4515