網膜原生殖器およびコルチコゲン化シナプス機能の電気生理学的調査

要約

ここでは、横性属核を含む急性脳スライスの調製のためのプロトコルと、網膜原生殖器およびコルチコゲニキュレートシナプス機能の電気生理学的調査を行う。このプロトコルは、同じ急性脳スライスの高放出および低放出確率でシナプスを研究する効率的な方法を提供します。

要約

横性属核は、視覚情報のための最初の中継局である。このカラミック核のリレーニューロンは、甲状動脈神経節細胞からの入力を統合し、視覚皮質に投影します。さらに、リレーニューロンは皮質からトップダウン励起を受ける。リレーニューロンへの2つの主要な興奮性入力は、いくつかの側面で異なります。各リレーニューロンは、多くの放出部位を持つ大きな端末である少数のレチノジェニキュレートシナプスからの入力を受け取ります。これは、比較可能に強い励起によって反映され、リレーニューロンは、再生神経節細胞から受け取る。コルチコゲンシナプスは、対照的に、少数の放出部位と弱いシナプス強度でより単純である。2つのシナプスはまた、シナプスの短期可塑性が異なります。レチノゲンシナプスは放出確率が高く、短期的なうつ病を示す。対照的に、コルチコゲンシナプスは、低い放出確率を持っています。コルチコゲン化繊維は、側側属核に入る前に網状の視体核を横断する。網状のカラミック核(横型属核からrosalal)と視管(側側属核からの心室)の異なる位置は、別々にコルチコゲニキュレートまたは網膜原性シナプスを刺激することを可能にする細胞外刺激電極で。これにより、横型属核は、同じ細胞型に衝突する非常に異なる特性を有する2つの興奮性シナプスが同時に研究できる理想的な脳領域となる。ここでは、リレーニューロンからの記録を調べ、急性脳スライスにおける網膜原生細胞およびコルチコゲン化シナプス機能の詳細な分析を行う方法について述べ取る。この記事には、側方属核の急性脳スライスの生成のためのステップバイステッププロトコルと、視管とコルチコゲン細胞を別々に刺激することにより中継ニューロンからの活性を記録するためのステップが含まれています。

概要

横性核のリレーニューロンは、視覚皮質に視覚情報を統合し、中継します。これらのニューロンは、リレーニューロンの主な興奮性ドライブを提供するレチノジェニキュレートシナプスを介して神経節細胞から興奮性入力を受け取ります。さらに、リレーニューロンは皮質源細胞シナプスを介して皮質ニューロンから興奮性入力を受け取ります。さらに、リレーニューロンは、局所的な神経間ニューロンおよびGABAergicニューロンからの阻害性入力を受け取り、核網状のタラミ1.核網膜タラミは、皮質から視床に突出する繊維が、反対方向にタラ^ミ2の核を通過しなければならないように、視床と皮質の間のシールドのように存在する。

レチノゲン化入力およびコルチコジェニキュレート入力は、異なるシナプス特性3、4、5、6、7、8を表示する。レチノゲン化入力は、複数のリリースサイト9、10を持つ大きな端末を形成します。対照的に、コルチコジェニキュレート入力は、単一のリリースサイト7を持つ小さな端子を表示します。さらに、リレーニューロン3、8、11上のすべてのシナプスのわずか5−10%を構成しているにもかかわらず、レチノゲンシナプスはリレーニューロンの作用電位を効率的に駆動する。コルチコゲンシナプスは、一方、リレーニューロン12、13の膜電位を制御することによって網膜原性伝達の調節剤として機能する。

中継ニューロンに対するこれら2つの主要な興奮性入力も機能的に異なる。1つの顕著な違いは、網膜原性シナプスの短期的なうつ病とコルチコゲン化シナプス3、5、8の短期的な促進である。短期的な可塑性とは、シナプスが数ミリ秒から数秒の期間内に繰り返し活性になるとシナプス強度が変化する現象を指します。シナプス放出確率は、短期的な可塑性の基礎となる重要な要因です。シナプスは、初期放出確率が低く、シナプス前にCa2+が蓄積されたため短期的な円滑化を示し、その結果、繰り返し活動を行った場合に放出確率の上昇が観察される。対照的に、高放出確率のシナプスは、通常、既製の小^胞14の枯渇による短期的なうつ病を示す。さらに、後のシナプティック受容体の脱感作は、いくつかの高放出確率シナプス8、15における短期的な可塑性に寄与する。α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾレプロピオン酸(AMPA)受容体の高放出確率および脱感感本化は、レチノゲニルシナプスの顕著な短期的うつ病に寄与する。対照的に、低放出確率は、コルチコゲンシナプスの短期的な促進の下にある。

マウスでは、視管は経側部位から後側側属核(dLGN)に入り、コルチコゲン核化繊維はdLGNロストロベントラリーに入る。2 つの入力間の距離は、同じセルに衝突する 2 つの非常に異なる興奮性入力の個々のプロパティの調査を可能にします。ここでは、網膜原生殖およびコルチコジェニキュレート繊維が急性脳^{スライス3}に保存される前述の解剖方法を構築し、改善する。次に、リレーニューロンの電気生理学的調査と、細胞外刺激電極を用いて網膜原生殖およびコルチコジェニキュレート繊維の刺激について説明する。最後に、バイオシチンとその後の解剖分析を用いたリレーニューロンの充填のためのプロトコルを提供する。

プロトコル

すべての実験は、ラインラント・パラティネートの動物実験に関する政府監督委員会によって承認されました。

1. ソリューション

1. 解剖ソリューション
   1. 興奮毒性を減らすために、ここで示すように解剖中に使用されるコリンベースの溶液を調製する(mM):87 NaCl、2.5 KCl、37.5コリン塩化物、25 NaHCO3、1.25 NaH₂PO 4、0.5 CaCl_2、および7 MgCl_{2、 25}ブドウ糖。解剖液を実験の1週間前までに準備する。
2. 記録ソリューション
   1. 人工脳脊髄液(ACSF)を含む溶液を調出す(mM):125 NaCl、25 NaHCO 3、1.25_NaH2PO4、2.5 KCl、2 CaCl_2、1MgCl_2、および25グルコース。50 μM D-APV および 10 μM SR 95531 ヒドロブロマイドを追加して、N-メチル-D-アスパラギン酸(NMDA)および GABA_A受容体をそれぞれブロックします。
3. 細胞内溶液
   1. (mM)を含む細胞内溶液を調製する:35 Cs-グルコン酸、100 CsCl、10 HEPES、10 EGTA、および0.1 D-600(塩酸メトキシベラパミル)。COH で pH を 7.3 に調整します。フィルター、アリコート、使用するまで-20°Cでストック溶液を保存します。

2. 解剖

1. 2つのスライスチャンバーを準備し、そのうちの1つは解剖液の100 mLで満たされ、もう1つは100 mLの記録溶液で満たされます。2つのビーカーを水浴(37°C)に入れ、解剖の少なくとも15分間カルボゲンで溶液を泡立たします。
2. プラスチックビーカーに250mL近くの氷冷(凍結しない)解剖液を充填します。使用前に少なくとも15分の炭水化物と泡。
3. 脳解剖が行われるプラスチックペトリ皿(100mm x 20 mm)を冷たい解剖液で充填します。ペトリ皿のふたにフィルターペーパーを置きます。
4. ビブラートムの解剖室を冷却します。
5. マウスケージ内の2.5%のイソファランでマウスを麻酔する。マウスが尾のピンチに反応しないとすぐに、子宮頸部髄の近くでマウスを切断し、ペトリ皿のベースの氷冷解解液に頭を浸します。
6. 頭の皮膚を口腔から鼻に切り、指で横にして頭蓋骨を露出させます。前脳を取り出すには、まず後部の中間線と一緒に頭蓋骨を切り取り、次に冠状縫合糸とラムドイド縫合糸を通してさらに2回切る(図1A)。
7. 大腸縫合糸とラムドイド縫合糸の間の頭蓋骨を取り除き、大脳が露出する。嗅球を切り、前脳を細かい刃で中脳から切り離す(図1B)。薄いへらで頭蓋骨から脳を取り出し、ペトリ皿の蓋のフィルターペーパーの上に置きます。
   注:ステップ2.6および2.7は、細胞死を減らすためにできるだけ速く実行する必要があります。
8. 脳スライスのdLGNに対する感覚入力と皮質入力の完全性を維持するために、2つの半球を3−5°の角度で切り取ったパラジタルカットで分離する(図1C、D)。2つの半球の平面面をフィルターペーパーの上に置いて乾燥させ、水平面から10~25°の角度で切断段階に接着します(図1E)。
9. ステージを金属バッファートレイの中央に置き、残りの氷冷解解液を緩やかにバッファトレイに注ぎます。強い注ぎ込みによって貼り付けた脳が取り除かれる可能性があるため、この手順を慎重に実行します (図 1F)。
10. バッファトレイを氷で満たされたトレイに入れ、解剖時の低温を維持するのに役立ちます。0.1 mm/s の速度でかみそり刃で 250 μm のスライスをカットし、振幅を 1 mm にします。
11. 34°Cで34°Cで充填された保持室にスライスを保持し、その後、スライスが34°Cで30分間記録溶液で回復できるようにします。
12. 回復後、水浴からスライス保持室を取り出し、実験で使用するまで静室温度(RT)でスライスを保ちます。

3. 電気生理学

1. ホウケイ酸塩ガラス毛細血管とフィラメントプーラーを使用してピペットを引っ張ります。3-4 MΩで記録ピペットの抵抗を維持します。同じプロトコルを使用して刺激ピペットを引っ張りますが、直径を増加させるために引っ張った後にわずかに先端を破ります。記録ピペットを細胞内溶液とバイオシチンで充填し、同時に記録溶液で刺激的なピペットを充填する。
2. スライスを記録室に入れ、RTで酸素化された記録ソリューションでスライスを継続的に浸透させます。
3. 赤外線差動干渉コントラスト(IR-DIC)ビデオ顕微鏡を備えた直立顕微鏡でスライスと細胞を視覚化します。
   注:リレーニューロンは、より大きなソマサイズとより多くの一次デンドライト(ソマから出現する枝)によってニューロン間から区別されます。インターニューロンは、より小さなソーマを持つ双極性形態を表示します。
4. 刺激的なピペットをスライスの上に置き、記録ピペットでセルにパッチを当てります。レチノジェニキュレートシナプスを調べるために、刺激性ピペットを直接視糸管の上に置き、そこでは、尾行神経節細胞の軸線維が束ねられます(図2A)。皮質原性シナプスを分析するには、dLGNに隣接する筋骨格系のタラミ核に刺激電極を配置する(図2B)。
5. 記録ピペットが記録ソリューションに浸されたら、5 mV電圧ステップを適用してピペット抵抗を監視します。保持電位を 0 mV に設定し、保持電流が 0 pA に設定できるようにオフセット電位をキャンセルします。
6. 正の圧力を加えながら、記録ピペットでセルに近づきる。ピペットが細胞膜に直接接触している場合は、正圧を放出し、保持電位を-70 mVに設定します。ギガオームシールが形成される(抵抗>1 GΩ)ので、細胞膜がガラスピペットに付着できるように、わずかな負圧を加えます。ピペット容量を補正し、負圧パルスの適用によってセルを開きます。
7. シナプス機能を調べるために、刺激ピペットを介して0.1ミリ秒の電流パルス(約30μA)を適用します。シナプス応答が観察されない場合は、刺激性ピペットを交換する必要があります。刺激的なピペットを別の位置に置く際には、記録されたセルが失われないように注意してください。
   注:図2に示す記録例では、シナプス短期可塑性を30ms間刺激間隔で光路またはコルチコゲン化繊維を2回刺激することによって調べた。対パルス比(PPR)は、第2興奮後の経度(EPSC)の振幅を第1のEPSC(EPSC 2/EPSC₁₎の振幅で割って算出した。各刺激プロトコルを20回繰り返した。EPSC振幅は、20回のスイープの平均電流から測定した。各繰り返しの間の時間間隔は、繰り返しによって誘発される短期的な可塑性を避けるために少なくとも5秒であった。
8. 5 mV電圧ステップを適用して、シリーズ抵抗を継続的に監視します。解析には、直列抵抗が 20 MΩ 未満のセルのみを使用します。

4. バイオシリン標識

1. 遠位デンドライトへのバイオシチンの拡散を可能にするために、少なくとも5分間全細胞構成を維持する。
2. 記録後、大豆が破壊されないように、細胞からピペットをそっと取り除く。
   注: 1 つのスライスに複数のセルが記録されている場合、そのソマは隣接するセルから十分に離れている必要があります。異なる細胞からのデンドライトがイメージング中に互いに干渉しないことを確認します。
3. 24ウェル細胞培養プレートを調製する。4%パラホルムアルデヒド(PFA)の300 μLで各ウェルを充填します。記録するスライスと接触するPFAで何かを汚染しないように注意してください。
4. 記録室からゴムピペットでPFA含有プレートにスライスを移し、一晩スライスを固定します。ピペットが常にPFA汚染から防がれていることを確認してください。
   注意:PFAを操作する際は、必ず手袋を着用し、化学フードを使用してください。
5. PFAで一晩スライスを固定した後、PFAをリン酸緩衝生理食べ物(PBS)に置き換えます。将来の処理(2週間未満)のために4°CでPBSにスライスを保存します。
6. 新鮮なPBSでスライスを3回(各洗浄10分)で洗います。
7. ブロッキング溶液中のスライス(0.2%非イオン界面活性剤、PBSで5%ウシ血清アルブミン)を軌道シェーカー上のRTで2時間インキュベートすることにより、非特異的結合部位をブロックする。
8. ブロッキング ソリューションを破棄します。ストレプトアビジン-Alexa 568でスライスを、軌道シェーカーで一晩4°Cでブロッキング溶液(1:1,000)に希釈してインキュベートします。
9. 抗体溶液を廃棄し、軌道シェーカー上のRTで10分間PBSでスライスを3回洗浄します。取り付ける前に水道水でスライスを洗います。
10. 1つのマウスのスライスを1枚のガラススライドに置きます。染色されたセルがスライスの上面に存在していることを確認します。スライスの周りの水をティッシュで吸収し、スライスを約15分間乾燥させます。
11. 各スライスに2滴の取り付け媒体を塗布します。気泡を発生さずにスライドにカバースリップを取り付けます。
12. 共焦点顕微鏡で視覚化した後、ラベル付きスライスを4°Cに保管します。

5. 細胞イメージングと再構成

1. 共焦点顕微鏡でスライスをスキャンし、関連するソフトウェアを分析に使用します。
2. 蛍光を561nmで励起する。
3. 0.7の数値絞り(NA)、オイル浸漬の目的でスライスをイメージします。
4. ビューの中央にあるターゲット セルを調整し、2.5 倍の倍率を適用します。
5. 次のパラメータを使用してニューロン全体をスキャンするように Z スタック データセットをレンダリングします: フォーマット = 2,550 x 2,550 ピクセル、スキャン周波数 = 400 Hz、z 番号 = 40.Voxel サイズは約 0.1211 x 0.1211 x 1.8463 μm3 でした。
6. ニューロン再構成ソフトウェア(例えば、ニューロンスタジオ)を使用してニューロンを半自動的にトレースします。図 3Bに示す 3D トレースリレー ニューロンの例を示します。

結果

網膜原生殖経路およびコルチコジェニキュレート経路を含むdLGNのスライス調製は、4倍の目的で示されている(図2)。再生管神経節細胞の軸が一緒に光学管内に束ねられます(図2)。刺激性ピペットを視気管面に置き、シナプス媒介電流(図2A)を誘導し、核網状のタラミ上にそれぞれコルチコゲンシナプス?...

ディスカッション

我々は、以前に公開された方法3に基づいて改善されたプロトコルを説明し、同じスライスからの放出レチノゲンシナプスの高い確率および放出コルチコゲンシナプスの低い確率の調査を可能にする。これは、これら2つの入力が視覚的な信号伝達を調節するために相互に作用するので非常に重要です:レチノジェニキュレート入力はリレーニューロンの主な興奮駆動であり、?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA Elektronik	EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261-250MG
CaCl2	EMSURE	1.02382.1000
choline chloride	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope	Leica Microsystems	TCS SP5
CsCl	EMSURE	1.02038.0100
Cs-gluconate	Self-prepared		Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves
D-600	Sigma-Aldrich	M5644-50MG	methoxyverapamil hydrochloride
D-APV	Biotrend	BN0085-100	NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope	Olympus	XM10
EGTA	SERVA	11290.02
Forene	Abbvie	2594.00.00	isoflurane
Glucose	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPES	ROTH	9105.2
High Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A385
KCl	EMSURE	1.04936.1000
MgCl2	EMSURE	1.05833.0250
Micromanipulators	Luigs & Neumann	SM7
Miroscope	Olympus	BX51
mounting medium	ThermoFisher Scientific	P36930	Prolong Gold Invitrogen
NaCl	ROTH	3957.1
NaH2PO4	EMSURE	1.06346.1000
NaHCO3	EMSURE	1.06329.1000
Pipette	Hilgenberg	1807502
Puller	Sutter	P-1000
razor blade	Personna	60-0138
Semiautomatic Vibratome	Leica  Biosystems	VT1200S
SR 95531 hydrobromide	Biotrend	AOB5680-10	GABAA-receptor antagonist