Investigations électrophysiologiques de la fonction de synapse de rétinogeniculate et de Corticogeniculate

Résumé

Ici, nous présentons des protocoles pour la préparation des tranches aigues de cerveau contenant le noyau génuulé latéral et l'investigation électrophysiologique de la fonction de synapses de rétinogeniculate et de corticogeniculate. Ce protocole fournit un moyen efficace d'étudier les synapses avec la probabilité de libération élevée et faible dans les mêmes tranches de cerveau aigus.

Résumé

Le noyau génuulé latéral est la première station de relais pour l'information visuelle. Les neurones relais de ce noyau thalamique intègrent l'entrée des cellules ganglionnaires rétiniennes et la projettent vers le cortex visuel. En outre, les neurones relais reçoivent l'excitation descendante du cortex. Les deux entrées excitatrices principales des neurones relais diffèrent à plusieurs égards. Chaque neurone de relais reçoit l'entrée de seulement quelques synapses de rétinogégénique, qui sont de grands terminaux avec beaucoup de sites de dégagement. Ceci est reflété par l'excitation relativement forte, les neurones de relais reçoivent, des cellules de ganglion rétinien. Les synapses corticogeniculate, en revanche, sont plus simples avec peu de sites de libération et une force synaptique plus faible. Les deux synapses diffèrent également dans leur plasticité synaptique à court terme. Les synapses rétinogeniculate ont une probabilité de libération élevée et par conséquent affichent une dépression à court terme. En revanche, les synapses corticogeniculate ont une faible probabilité de libération. Les fibres corticogeniculate traversent les noyaux thalamic réticulaires avant d'entrer dans le noyau génuulé latéral. Les différents emplacements du noyau thalamique réticulaire (rostoral du noyau génuulé latéral) et du tractus optique (ventro-lancé du noyau génuulé latéral) permettent de stimuler séparément les synapses de corticogeniculate ou de rétinogeniculate avec des électrodes de stimulation extracellulaires. Cela fait du noyau génique latéral une zone idéale du cerveau où deux synapses excitatrices avec des propriétés très différentes empiéchant sur le même type de cellule, peuvent être étudiées simultanément. Ici, nous décrivons une méthode pour étudier l'enregistrement des neurones de relais et pour effectuer l'analyse détaillée de la fonction de synapse de retinogeniculate et de corticogeniculate dans les tranches aigues de cerveau. L'article contient un protocole étape par étape pour la génération de tranches de cerveau aigus du noyau latéral de géonulate et des étapes pour enregistrer l'activité des neurones de relais en stimulant le tractus optique et les fibres corticogeniculate séparément.

Introduction

Les neurones relais du noyau génuulé latéral intègrent et transmettent l'information visuelle au cortex visuel. Ces neurones reçoivent l'entrée excitatrice des cellules de ganglion par l'intermédiaire des synapses de rétinogeniculate, qui fournissent le disque excitateur principal pour des neurones de relais. En outre, les neurones de relais reçoivent des entrées excitatrices des neurones corticaux par l'intermédiaire des synapses corticogeniculate. En outre, les neurones relais reçoivent des entrées inhibitrices des interneurones locaux et des neurones GABAergic du noyau reticularis thalami¹. Le noyau reticularis thalami est présent comme un bouclier entre le thalamus et le cortex de telle sorte que les fibres se projetant du cortex au thalamus et dans la direction opposée doivent passer par le noyau reticularis thalami².

Les entrées de rétinogeniculate et les entrées de corticogeniculate affichent des propriétés synaptiques distinctes^3,4,5,6,7,8. Les entrées de rétinogénomié forment de grands terminaux avec des sites de libération multiples^9,10. En revanche, les entrées de corticogeniculate affichent de petits terminaux avec des sites de libération unique⁷. En outre, les synapses rétinogéniques conduisent efficacement les potentiels d'action des neurones relais, bien qu'ils ne constituent que 5 à 10 % de toutes les synapses sur les neurones relais^3,8,11. Les synapses corticogeniculate, d'autre part, servent de modulateur des transmissions rétinogeniculate en contrôlant le potentiel de membrane des neurones de relais^12,13.

Ces deux entrées excitatrices principales pour relayer les neurones sont également fonctionnellement différentes. Une différence importante est la dépression à court terme des synapses rétinogeniculate et la facilitation à court terme des synapses de corticogeniculate^3,5,8. La plasticité à court terme se réfère à un phénomène dans lequel la force synaptique change lorsque la synapse est active à plusieurs reprises dans un délai de quelques millisecondes à plusieurs secondes. La probabilité de libération synaptique est un facteur important sous-jacent à la plasticité à court terme. Les synapses, avec une faible probabilité initiale de libération, présentent une facilitation à court terme en raison de l'accumulation de Ca^{2 dans} la presynapse et, par conséquent, une augmentation de la probabilité de libération est observée lors d'activités répétées. En revanche, les synapses avec la probabilité élevée de libération montrent habituellement la dépression à court terme due à l'épuisement des vésicules prêtes-releasable¹⁴. En outre, la désensibilisation des récepteurs postsynaptiques contribue à la plasticité à court terme dans certaines synapses de probabilité à libération élevée^8,15. La probabilité et la désensibilisation élevées de dégagement des récepteurs d'acide et de dégagement élevés de 'amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic d'acide (AMPA) contribuent à la dépression à court terme en avant des synapses de rétinogeniculate. En revanche, la probabilité de faible libération sous-tend la facilitation à court terme des synapses de corticogeniculate.

Chez la souris, le tractus optique pénètre dans le noyau de geniculate latéral dorsal (dLGN) du site caudolatéral, tandis que les fibres corticogeniculate pénètrent dans le rostroventrally dLGN. La distance entre les deux entrées permet d'enquêter sur les propriétés individuelles de deux entrées excitatrices très différentes empiéchant sur la même cellule. Ici, nous construisons et améliorons une méthode précédemment décrite de dissection dans laquelle les fibres derétinogeniculate et de corticogeniculate sont préservées dans les tranches aigues de cerveau 3. Nous décrivons alors l'investigation électrophysiologique des neurones de relais et la stimulation des fibres de rétinogeniculate et de corticogenicuulate avec des électrodes de stimulation extracellulaires. Enfin, nous fournissons un protocole pour le remplissage des neurones relais avec la biocytine et l'analyse anatomique ultérieure.

Protocole

Toutes les expériences ont été approuvées par le Groupe de surveillance gouvernemental sur les expériences animales de Rhénanie-Palatinat.

1. Solutions

1. Solution de dissection
   1. Pour réduire l'excitotoxicité, préparez une solution à base de choline à utiliser lors de la dissection telle qu'elle est présentée ici (en mM): 87 NaCl, 2,5 KCl, 37,5 chlorure de choline, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO₄, 0,5 CaCl₂, 7 MgCl_2, et ₂₅ glucose. Préparer la solution de dissection moins d'une semaine avant l'expérience.
2. Solution d'enregistrement
   1. Préparer une solution de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) contenant (en mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1,25 NaH₂PO4, 2.5 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, et 25 glucose. Ajouter 50 M D-APV et 10 m DR 95531 hydrobromide pour bloquer les récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) et GABA_A, respectivement.
3. Solution intracellulaire
   1. Préparer une solution intracellulaire contenant (en mM) : 35 Cs-gluconate, 100 CsCl, 10 HEPES, 10 EGTA et 0,1 D-600 (hydrochlorure de méthoxyverapamil). Ajuster le pH à 7,3 avec CsOH. Filtrer, aliquot, et stocker la solution de stock à -20 oC jusqu'à l'utilisation.

2. Dissection

1. Préparer deux chambres de tranche, dont l'une est remplie de 100 ml de la solution de dissection et l'autre avec 100 ml de solution d'enregistrement. Placer les deux béchers dans un bain d'eau (37 oC) et faire une bulle avec des carbogen pendant au moins 15 minutes avant la dissection.
2. Remplissez un bécher en plastique de 250 ml de solution de dissection proche de glace (mais non congelée). Bulle avec carbogen au moins 15 min avant utilisation.
3. Remplissez un plat Petri en plastique (100 mm x 20 mm), dans lequel la dissection du cerveau sera effectuée, avec la solution de dissection à froid. Placer un morceau de papier filtre dans le couvercle du plat Petri.
4. Refroidir la chambre de dissection du vibratome.
5. Anesthésiez une souris avec 2,5% d'isoflurane, par exemple, dans la cage de souris. Dès que la souris ne répond pas à un pincement de queue, décapiter la souris près de la médulle cervicale et plonger la tête dans la solution de dissection glacée à la base du plat Petri.
6. Couper la peau de la tête de caudal à nasal et le garder latéralement avec les doigts pour exposer le crâne. Pour éliminer le cerveau antérieur, coupez d'abord le crâne avec la ligne médiane postérieure-antérieure, puis coupez deux fois de plus à travers la suture coronale et la suture lambdoid (Figure 1A).
7. Enlever le crâne entre la suture coronale et la suture lambdoid de telle sorte que le cerveau est exposé. Couper l'ampoule olfactive et séparer le cerveau avant du cerveau moyen avec une lame fine (Figure 1B). Retirez le cerveau du crâne à l'air d'une fine spatule et placez-le sur le papier filtre dans le couvercle du plat Petri.
   REMARQUE : Les étapes 2.6 et 2.7 doivent être exécutées aussi rapidement que possible pour réduire la mort cellulaire.
8. Pour préserver l'intégrité des entrées sensorielles et corticales du dLGN dans la tranche de cerveau, séparez les deux hémisphères avec une coupe parasagittal avec un angle de 3 à 5 degrés (figure1C,D). Séchez les plans médiolatéral des deux hémisphères en les plaçant sur le papier filtre, puis collez-les sur la scène de coupe avec un angle de 10 à 25 degrés du plan horizontal (Figure 1E).
9. Placez la scène au centre du bac tampon métallique et versez doucement le reste de la solution de dissection glacée dans le bac tampon. Effectuez cette étape avec soin puisqu'une forte coulée pourrait enlever le cerveau collé (Figure 1F).
10. Placez le plateau tampon dans le plateau rempli de glace, ce qui aide à maintenir la basse température pendant la dissection. Couper des tranches de 250 m avec une lame de rasoir à une vitesse de 0,1 mm/s et une amplitude de 1 mm.
11. Garder les tranches dans la chambre d'attente remplies d'une solution de dissection oxygénée à 34 oC pendant environ 30 min, puis laisser les tranches récupérer dans la solution d'enregistrement à 34 oC pendant 30 min de plus.
12. Après la récupération, retirer la chambre de fixation de la tranche du bain d'eau et les conserver à température ambiante (RT) jusqu'à ce qu'elles soient utilisées dans des expériences.

3. Électrophysiologie

1. Tirez les pipettes à l'aide de capillaires en verre borosilicate et d'un tire-filament. Maintenir la résistance des pipettes d'enregistrement à 3 à 4 M. Tirez des pipettes stimulantes en utilisant le même protocole, mais cassez légèrement la pointe après avoir tiré pour augmenter le diamètre. Remplissez les pipettes d'enregistrement avec la solution intracellulaire et la biocytine, tout en remplissant les pipettes stimulantes avec la solution d'enregistrement.
2. Placez les tranches dans la chambre d'enregistrement et perfillez continuellement les tranches avec une solution d'enregistrement oxygénée à RT. Vérifiez toutes les tranches et sélectionnez ceux qui affichent un tractus optique intact.
3. Visualisez la tranche et les cellules avec un microscope droit équipé d'une microscopie vidéo de contraste d'interférence différentiell infrarouge (IR-DIC).
   REMARQUE : Les neurones du relais sont différenciés des interneurones par leur plus grande taille de soma et leurs dendrites plus primaires (branches émergeant du soma). Les interneurones présentent une morphologie bipolaire avec un soma plus petit.
4. Placer la pipette stimulante sur la tranche avant de patcher la cellule avec la pipette d'enregistrement. Pour étudier les synapses rétinogéniques, placez la pipette stimulante directement sur le tractus optique, où les fibres d'axone des cellules ganglionnaires rétiniennes sont regroupées (Figure 2A). Pour analyser les synapses de corticogeniculate, placez l'électrode stimulante sur le noyau reticularis thalami, qui est rostroventrally adjacent à la dLGN (Figure 2B).
5. Une fois que la pipette d'enregistrement est immergée dans la solution d'enregistrement, appliquez une étape de tension de 5 mV pour surveiller la résistance de pipette. Définir le potentiel de détention à 0 mV et annuler le potentiel de compensation de sorte que le courant de détention est de 0 pA.
6. Approchez la cellule avec la pipette d'enregistrement tout en appliquant une pression positive. Lorsque la pipette est en contact direct avec la membrane cellulaire, relâchez la pression positive et fixez le potentiel de retenue à -70 mV. Appliquer une légère pression négative pour permettre à la membrane cellulaire de se fixer à la pipette en verre de telle sorte qu'un joint gigaohm se forme (résistance à 1 G). Compenser la capacité de pipette et ouvrir la cellule par l'application de légumineuses à pression négative.
7. Pour étudier la fonction synaptique, appliquez 0,1 ms d'impulsions actuelles (vers 30 aA) par l'intermédiaire de la pipette de stimulation. Si aucune réponse synaptique n'est observée, les pipettes stimulantes peuvent devoir être remplacées. Soyez prudent lors de la mise en place des pipettes stimulantes à une position différente de sorte que la cellule enregistrée n'est pas perdue.
   REMARQUE : Dans l'exemple des enregistrements montrés dans la figure2, la plasticité synaptique à court terme a été étudiée en stimulant le tractus optique ou les fibres corticogeniculate deux fois avec 30 ms intervalles inter-stimulus. Le rapport appariement-impulsion (PPR) a été calculé en divisant l'amplitude du deuxième courant postynaptique excitateur (EPSC) par celui du premier EPSC (EPSC₂/EPSC₁). Chaque protocole de stimulation a été répété 20 fois. L'amplitude EPSC a été mesurée à partir des courants moyens des 20 balayages. L'intervalle de temps entre chaque répétition était au moins 5 s pour éviter la plasticité à court terme induite par les répétitions.
8. Surveillez la résistance de la série en permanence en appliquant une étape de tension de 5 mV. N'utilisez que les cellules avec la résistance de série de moins de 20 M pour l'analyse.

4. Étiquetage Biocytin

1. Maintenir la configuration de l'ensemble des cellules pendant au moins 5 min pour permettre la diffusion de la biocytine dans les dendrites distales.
2. Après l'enregistrement, retirez délicatement la pipette de la cellule afin que le soma ne soit pas détruit.
   REMARQUE : Si plus d'une cellule est enregistrée sur une tranche, leurs somas devraient être suffisamment éloignés de leurs cellules voisines. Assurez-vous que les dendrites de différentes cellules ne interfèrent pas les uns avec les autres pendant l'imagerie.
3. Préparer une plaque de culture cellulaire de 24 puits. Remplissez chaque puits de 300 l de paraformaldéhyde (PFA) de 4 %. Veillez à ne pas contaminer quoi que ce soit avec PFA qui sera en contact avec les tranches à enregistrer.
4. Transférer les tranches de la chambre d'enregistrement dans la plaque contenant de la PFA à l'' insu d'une pipette en caoutchouc et fixer les tranches pendant la nuit. Assurez-vous que la pipette est toujours empêchée de la contamination par PFA.
   CAUTION: Toujours porter des gants et utiliser une hotte chimique lors de la manipulation PFA.
5. Après avoir fixé les tranches pendant la nuit en PFA, remplacez la PFA par de la saline tamponnée par le phosphate (PBS). Conserver les tranches de PBS à 4 oC pour un traitement futur (moins de 2 semaines).
6. Laver les tranches avec du PBS frais 3 fois (10 min par lavage).
7. Bloquer les sites de liaison non spécifiques en couvant les tranches dans la solution de blocage (0,2% de surfactant non ionique et 5% d'albumine de sérum bovin en PBS) pendant 2 h à RT sur un shaker orbital.
8. Jetez la solution de blocage. Incuber les tranches avec streptavidin-Alexa 568 diluée dans la solution de blocage (1:1,000) à 4 oC pendant la nuit sur un shaker orbital.
9. Jeter la solution d'anticorps et laver les tranches 3 fois avec PBS pendant 10 min à RT sur un shaker orbital. Laver les tranches avec de l'eau du robinet avant de monter.
10. Placez les tranches d'une souris sur une lame de verre. Assurez-vous que les cellules tachées sont présentes sur la surface supérieure des tranches. Absorber l'eau autour des tranches avec des mouchoirs, puis laisser sécher les tranches pendant environ 15 min.
11. Appliquer deux gouttes de milieu de montage sur chaque tranche. Montez un bordereau sur la glissière sans produire de bulles d'air.
12. Conserver les tranches étiquetées à 4 oC après la visualisation à l'aide d'un microscope confocal.

5. Imagerie et reconstruction cellulaires

1. Scanner les tranches à l'utilisation d'un microscope confocal et utiliser le logiciel associé pour l'analyse.
2. Exciter la fluorescence à 561 nm.
3. Imageles avec 0,7 ouverture numérique (NA), objectif d'immersion en huile.
4. Ajustez la cellule ciblée au milieu de la vue et appliquez un grossissement 2,5 fois.
5. Rendre les jeux de données Z-pile pour scanner l'ensemble du neurone avec les paramètres suivants: format 2 550 x 2 550 pixels, fréquence d'analyse 400 Hz, z numéro 40.Voxel taille était d'environ 0,1211 x 0,1211 x 1,8463 m3.
6. Tracer semi-automatiquement les neurones à l'aide d'un logiciel de reconstruction neuronale (par exemple, NeuronStudio). Un exemple de neurone relais tracé en 3D est montré dans la figure 3B.

Résultats

La préparation de tranches de dLGN contenant les voies de rétinogénine et de corticogenicuulate est montrée sous un objectif 4x (figure 2). Les axones des cellules ganglionnaires rétiniennes se regroupent dans le tractus optique (Figure 2). La pipette stimulante a été placée sur le tractus optique pour induire le courant rétinogeniculate synapse-mediated (Figure 2A) et sur le noyau reticular...

Discussion

Nous décrivons un protocole amélioré basé sur une méthode précédemment éditée³, qui permet l'étude de la probabilité élevée des synapses de rétinogeniculate de dégagement et de la faible probabilité des synapses de corticogeniculate de libération de la même tranche. Ceci est d'une grande importance puisque ces deux entrées interagissent les unes avec les autres pour moduler la transmission du signal visuel : les entrées rétinogéniques sont le principal moteur excitateur des n...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amplifier	HEKA Elektronik	EPC 10 USB Double patch clamp amplifier
Biocytin	Sigma-Aldrich	B4261-250MG
CaCl2	EMSURE	1.02382.1000
choline chloride	Sigma-Aldrich	C1879-1KG
Confocal Laser Scanning Microscope	Leica Microsystems	TCS SP5
CsCl	EMSURE	1.02038.0100
Cs-gluconate	Self-prepared		Since there was no commercial Cs-gluconate, we prepared it by ourselves
D-600	Sigma-Aldrich	M5644-50MG	methoxyverapamil hydrochloride
D-APV	Biotrend	BN0085-100	NMDA-receptor antagonist
Digital camera for microscope	Olympus	XM10
EGTA	SERVA	11290.02
Forene	Abbvie	2594.00.00	isoflurane
Glucose	Sigma-Aldrich	49159-1KG
HEPES	ROTH	9105.2
High Current Stimulus Isolator	World Precision Instruments	A385
KCl	EMSURE	1.04936.1000
MgCl2	EMSURE	1.05833.0250
Micromanipulators	Luigs & Neumann	SM7
Miroscope	Olympus	BX51
mounting medium	ThermoFisher Scientific	P36930	Prolong Gold Invitrogen
NaCl	ROTH	3957.1
NaH2PO4	EMSURE	1.06346.1000
NaHCO3	EMSURE	1.06329.1000
Pipette	Hilgenberg	1807502
Puller	Sutter	P-1000
razor blade	Personna	60-0138
Semiautomatic Vibratome	Leica  Biosystems	VT1200S
SR 95531 hydrobromide	Biotrend	AOB5680-10	GABAA-receptor antagonist