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要約

我々は、空気-液体界面(ALI)で培養されたヒト肺細胞を暴露することにより、急性肺細胞傷害性に関する空気中の粒子のスクリーニングおよびモニタリングのための堅牢で移動可能で予測可能なインビトロ曝露システムを提示する。

要約

ここでは、アリで培養されたヒト肺細胞をガス、粒子、または複雑な雰囲気(例えば、タバコの煙)に均質に暴露することを可能にする特別に設計されたモジュラーインビトロ露光システムを提示し、現実的な生理学的な結果を提供する人間の肺胞領域の尖面表面の空気への暴露。線形エアロゾルガイダンスを用いた逐次露光モデルとは対照的に、ラジアルフローシステムのモジュラー設計は、試験雰囲気を細胞に連続的に生成し、輸送するためのすべての要件を満たし、均質な分布および堆積粒子と大気の連続的な除去。この露光方法は、主に空気中の粒子への細胞の暴露のために設計されていますが、エアロゾル生成方法と露光モジュールの材料に応じて、液体エアロゾルおよび高毒性および積極的なガスの暴露に適応することができます.

最近完了した検証研究の枠組みの中で、この暴露システムは、空気中の粒子の急性肺細胞毒性の定性的評価のための移動可能で再現性および予測スクリーニング方法として証明された、通常、この毒物学的評価を提供する動物実験を減らすか、置き換える可能性がある。

概要

有毒な空中粒子の吸入は公衆衛生上の懸念であり、世界中で多数の健康上のリスクをもたらし、毎年何百万人もの死者が年間1,2.気候変動、現在進行中の産業発展、エネルギー、農業、消費者製品の需要の高まりは、過去数年間で肺疾患の増加に貢献しています3,4,5,6.急性吸入毒性に関する吸入可能物質の知識と評価は、危険評価とリスク管理の基礎を提供するが、この情報は、これらの物質7、8の広い範囲にはまだ欠けている。2006年以来、EUの化学法学REACH(化学物質の登録、評価、認可および制限)は、市場に投入される前に、既に既存および新たに導入された製品が吸入経路を含む毒物学的特性を受けることを要求する。したがって、REACHは、代替および動物フリーの方法、"3R"原理の実施(動物実験の交換、改良、および低減)および適切なin vitroモデル9の使用に焦点を当てています。近年、空気中の粒子5,7,10,11の急性吸入毒性を評価するために、多くの異なる、十分な非動物吸入毒性試験モデル(例えば、インビトロ細胞培養、肺オンチップモデル、精密切断肺スライス(PCLS))が開発されている。in vitro細胞培養モデルの観点から、培養された細胞は、水没条件下またはALI(図1)で暴露することができる。しかし、水没した暴露試験の妥当性は、空気中の化合物、特に粒子の毒性の評価に関して限定される。水没暴露技術は、ヒト生体内の状況に対応していない。細胞を覆う細胞培養培地は、物理化学的性質に影響を及ぼし、従って、被験物質12、13の毒性特性に影響を及ぼす可能性がある。ALIインビトロ吸入モデルは、細胞培養培地を被験粒子と干渉することなく、細胞を被験物質に直接曝露することができ、従って、水没暴露12、14よりも高い生理学的および生物学的類似性を有するヒト暴露を模倣する。

REACHなどの規制プロセスに関しては、しかし、動物モデルのみが急性吸入毒物学の分野で利用可能であり、現外法は十分に検証されておらず、公式に受け入れられなくなったため、これまでに14。この目的のために、テストモデルは、試験の有効性に関する動物実験代替のための欧州連合参照研究所(EURL-ECVAM)の原則に従って検証されなければならない。

以前の検証前調査と最近完了した検証調査は、CULTEX RFS露光システムの適用領域とその転写性、安定性、再現性13を実証した。この露光システムは、細胞16上の連続的な流れにおける放射状エアロゾル分布概念および試験エアロゾルの伝導により、ALIでのガス、粒子または複雑な雰囲気(例えば、タバコの煙)への細胞の均質な暴露を可能にするインビトロ細胞ベースの露光システムである。このラジアルフローシステムの基本モジュールは、インレットアダプタ、ラジアルエアロゾル分布を備えたエアロゾルガイドモジュール、サンプリングおよびソケットモジュール、ハンドホイール付きロックモジュール(図2)で構成されています。生成された粒子は、インレットアダプタおよびエアロゾル誘導モジュールを介して細胞に到達し、サンプリングモジュールの3つの放射状に配置された露光室に位置する細胞培養インサートに堆積される。エアロゾルガイドモジュールとサンプリングモジュールは、外部の水浴17に接続することによって加熱することができます。

両方の研究の枠組みの中で、A549細胞はすべての暴露実験に使用された。細胞株A549は、ヒト不死化上皮細胞株であり、非常によく特徴付けられるものであり、多数の毒物学的研究においてII型肺胞上皮細胞のインビトロモデルとして使用されている。細胞は、ラメラ体、界面活性剤の産生および炎症関連因子の数18によって特徴付けられる。彼らはまた、その粘液産生19に起因する気管支上皮細胞の特性を示す。さらに、彼らはALIで培養することができます。この細胞株は細胞間接触を構築する上で欠乏しているが、これらの細胞の培養ははるかに便利であり、コストが安く、それに由来する結果は一次細胞20に比べてドナー非依存である。

A549細胞を6ウェル細胞培養インサート(PET膜、4.67cm2、孔径0.4mm)で、インサートあたり3.0 x105細胞の密度で播種し、水没した状態で24時間培養した。その後、3つの独立した実験室で細胞を曝露し、ALIで20の試験物質の清浄な空気および3つの異なる暴露用量(25、50、および100 μg/cm2)を行った。露光量は、15、30、または60分後に細胞上に25 μg/cm 2、50μg/cm2、100 μg/cm2の一定の粒子速度をもたらす沈着時間に相関する。しかし、堆積粒子は、堆積後は洗い流されず、24時間細胞上に残った。したがって、粒子の堆積時間は15、30、60分であったが、細胞の暴露は合計で24時間続いた。試験物質の沈着速度は、前の方法17に従った予備実験で決定した。

毒性の指標としての細胞生存率は、細胞生存率アッセイを用いて粒子沈着後24時間評価した。特に、クリーンエアコントロールの品質、露出プロトコルの最適化と改良、実験室内再現性、予測モデル(PM)の確立に特に焦点を当てました。細胞生存率が50%以下に低下した物質(PM 50%)または75%(午後75%)3つの曝露用量のいずれかで、急性吸入の危険を及ぼすと考えられた。その後、既存のin vivoデータ(OECDテストガイドライン(TG)403またはTG 43621、22に従った少なくとも1つの信頼性の高い研究に基づいて、83%の特異性と88%23の感度を有する85%の全体的な一致性に導いた。

細胞生存率の測定に加えて、サイトカイン放出、LDHアッセイによる細胞ライセートまたは膜完全性の検査などの他のエンドポイントは評価できるが、検証試験には必要ではなかった。したがって、露光システム(例えば、CULTEX RFS)は、試験された空気中粒子の急性吸入毒性の定性評価のための予測スクリーニングシステムとして証明され、動物試験に対する有望な代替方法を表した。この暴露システムを使用して空気中の粒子に対する暴露実験には、以下のプロトコルが推奨されます。

プロトコル

注: 1 回の暴露実験のプロトコルは、3 日間をカバーします。

1日目

1. 細胞の一般製剤と培養

注:ヒト肺腺癌上皮細胞株A549は、曝露実験に用いた。細胞は無菌状態で扱わなければならない。ALIでの培養に適した他の細胞株を使用することができる。

  1. 成長培地(Dulbeccoの最小必須培地(DMEM)を10%ウシ胎児血清(FBS)および5 μg/mLゲンタマイシンで補い、暴露媒体(DMEM、5 μg/mLゲンタマイシン、最終HEPES濃度100mM)を調製する。
  2. 培養液A549細胞は、5%CO2を含む加湿雰囲気中で37°Cで増殖培地中に培養する。
  3. 細胞培養フラスコを14mLの増殖培地で75cm2(T-75)で培養し、80~90%の合流点まで培養し、35回分け、35回の通路を有する。
  4. 懸濁液量と必要な細胞培養インサート(クリーンエアおよび粒子露光用の培養制御および細胞培養インサートとしての3つの細胞培養挿入物)および細胞培養プレートを計算する。
  5. 細胞のトリプシンおよび播種の前に、6ウェルプレートの各ウェルに2.5 mLの焼戻し培地を加える。細胞培養インサートをウェル内に慎重に入れ、細胞培養挿入物ごとに1 mL成長培地を加えます。6ウェルプレートをインキュベーター内で少なくとも30分間インキュベートします(37°C、5%CO2)。

2. 細胞のトリプシン化

  1. 37°Cでのテンパリン酸緩衝生理食塩分(PBS)および成長培地とトリプシン/EDTA(0.05%/0.02%)室温での解決。
  2. 細胞培養フラスコから細胞培養培地を吸引し、8 mLの予熱PBSで細胞を慎重に洗浄する。
  3. PBSを取り外し、トリプシン/EDTAの2 mLを追加します(0.05%/0.02%)37°Cのインキュベーターで細胞に溶液を、最大6分間インキュベートする。顕微鏡の下で分離プロセスを制御しなさい。
  4. 8 mL前加熱成長培地を加えてトリプシン活性を中和し、フラスコの上で横方向に軽くたたくことによって細胞を剥離し、上と下にピペットを繰り返して細胞を再懸濁させる。
  5. 細胞懸濁液を50mLチューブに移します。さらなる手順(例えば、細胞の播種、細胞の通過)のための細胞番号を決定する。

3. セル番号の決定

注:細胞濃度は、細胞カウンターまたは計数チャンバーを使用して決定した。

  1. 10 mLの等張液を充填したカップに細胞培養懸濁液を100μL希釈する。カップを揺らさずにゆっくりと傾けます。
  2. A549細胞の細胞特異的測定パラメータに基づいて、生存細胞数/mLおよび細胞生存率を決定します。

4. 細胞培養インサートにおける微多孔膜への細胞の播種

注:露出システムは、異なるサプライヤーと異なるサイズの商用インサートの使用を可能にする特別なアダプタが装備されています。これらの露光実験には、6ウェルプレートおよび対応する細胞培養インサートを使用した。すべての作業手順は、無菌条件下で行う必要があります。

  1. 滅菌細胞培養条件(層流)の下で前加熱成長培地を提供する。
  2. 細胞濃度が3.0 x 105細胞/mLで十分に高い量の細胞懸濁液を調製する。
  3. プレートを30分間焼き戻した後、培地を細胞培養インサート内に吸引し、各細胞培養挿入物に3.0 x 10 5細胞/mLの密度を有するA549細胞の1mLを播種した。緩やかな揺れでセルサスペンションを配ります。
  4. 細胞培養液を24時間(37°Cおよび5%CO2)用にインキュベートした。

5. 試験物質の押下

注:試験物質は完全に制御可能な油圧プレスを使用して粉のケーキに押し込まれた。プレスパッケージは、プレスパッケージの現在の油圧(バー)として表示される18 kNの最大力を適用することができます。未知の試験物質のプレス条件(押圧、プレス時間)を確立し、予備試験で特徴付ける必要があります。物質のプレス特性に応じて、異なる押し込みパラメータとプレスプランジャーの種類を使用することができます。

注意: 有毒物質や危険物質を押す際は保護具を着用してください。

  1. プレスのフロント側のタイムコントロールを介してプレス時間を設定します。
  2. 圧縮空気バルブで圧縮空気供給を開きます。プレスの前面または圧縮空気供給の圧縮空気バルブの圧力調整器を使用して、圧縮空気圧を約2バー(前面側の圧力計で示す)に設定します。引き出しを引き出し、押しボタンを押して、デジタル圧力スイッチの押圧を読み取ります。
    1. 圧力が高すぎるか低すぎる場合は、圧力レギュレータの圧力だけを読み取る。
  3. 物質容器を組み立て、ガラスシリンダーが正しく中央に配置されていることを確認します(補足図1)。少量の被験物質を物質容器に充填する。プランジャーを物質容器に挿入し、少し前後に回して容器内の粉末を均等に分配します。
  4. プランジャー付きの物質容器を引き出しに入れ、押すボタンを押します。プレスの油圧ピストンはプランジャーの上に移動し、設定された押し時間のための試験物質に圧力を加える。引き出しを開けてプランジャーを取り外します。
  5. 物質容器が少なくとも半分いっぱいになるまで、手順5.3と5.4を繰り返します。
  6. プレス作業が完了した後、引き出しから物質容器を取り出し、それを逆さまにして緩く堆積した粒子を取り除きます。
  7. 物質容器が同じ日に必要ない場合は、被検物質が乾燥または水分を吸収するのを防ぐために、パラフィルムで物質容器を閉じます。

2日目

露光システムの組み立てと周辺機器の接続

注 : 詳細なビューについては、図 3、補足図 2、および補足図 3に示されています。メーカーの指示に従って、モジュールとエアロゾル発電機の両方を組み立てます。

  1. 露出システムを固体および表面に置き、水の供給を前方に向けます。マスフローコントローラをエアロゾル発生装置と、モジュールに接続された3本のボトルに接続して、きれいな空気を露出させます。
  2. フローコントローラと真空ポンプを接続します。フローコントローラのチューブをエアロゾルガイドモジュールのアタッチメントのチューブコネクタに接続します。流れコントローラーの反対側にあるチューブを真空ポンプで接続します。フローがモジュールからフローコントローラを通って真空ポンプに流れ込むかどうかを確認します。
  3. 水浴を加熱水の供給と接続します。水の供給は、エアロゾルガイドモジュールの水の入口に水浴から行っています。サンプリングモジュールの水入口にエアロゾル誘導モジュールの水出口を接続します。サンプリングモジュールの水出口から水浴への接続で円を閉じます。
  4. 露出モジュールの近くにエトルトリエーターを含むエアロゾルジェネレータを配置し、エルトリアタの余分なラインと大きなマイクロフィルタで露出ときれいな空気モジュールを接続し、小さなマイクロフィルターで露光チャンバの吸引(例えば、、使い捨てフィルタ)。エトルトリエーターは、生成された粒子状雰囲気の貯蔵所として機能し、約7μmよりも大きな粒子を保持し、より小さな粒子は露光モジュールに輸送されます。
  5. エアロゾルの生成を制御するために使用するコンピュータを、USBケーブルと電源モジュールポートを介してエアロゾル発電機の上部のUSBポートに接続します。電源装置のAC電源プラグをソケット(220-240 V)に接続します。
  6. 2つのポンプで媒体の供給および取り外しのためのパイプを接続します。媒体供給のためのポンプを使用する代わりに、媒体はまた手動で満たすことができる。

7. クリーンエアと粒子暴露の準備

  1. 真空ポンプ、フローコントローラ、および水浴(37°C)を少なくとも30分間の暖めの期間オンにします。
  2. 圧縮空気供給を開きます。マスフローコントローラをエアロゾル発生器への供給ラインの8 L/分、3本のネックボトルへの供給ラインの場合は3 L/分に設定します。マス フロー コントローラのタブを閉じます。
    注: これらの値は、被験物質の特性によって異なる場合があります。
  3. コンピュータを介してフローコントローラを調整し、モジュールの流量(1.5 L/分)とチャンバー吸引(30 mL/分)を調整します。

ラジアルフローシステムのリーク試験

メモ:漏れチェックは、モジュールが正しく組み立て直されていることを確認するために、真空下と両方のモジュール(露出ときれいな空気モジュール)に対して実行する必要があります。

  1. エアロゾルガイドモジュールからインレットアダプタとコンデンセート反射器を取り外します。エアロゾルガイドモジュールの3つのエアロゾル給紙孔と、ダミーフラップ付きサンプリングモジュールで、中型電源接続を閉じます。
  2. エアロゾルガイドモジュールのチューブコネクタを使用して、フィルタなしで真空ラインを接続します。ハンドホイールを使用してモジュールを閉じ、フローコントローラの値を測定します。5 mL/分未満で閉じると、値は数分で減少します。
  3. 不透過性チェックの後、すべてのプラグとダミーフラップを取り外し、入口アダプタとコンデンセート反射器をエアロゾルガイドモジュールに挿入し、パイプを接続して中程度の供給と取り外しを行います。

9. エアロゾルの生成

  1. コンピュータとソフトウェアを起動します (補足図 4)。コンピュータのデスクトップ上のエアロゾルジェネレータのスタートボタンをダブルクリックして、エアロゾルジェネレータソフトウェアを起動します。メッセージウィンドウが表示され、設定をリセットするかどうかを尋ねられます。その日に初めてソフトウェアを起動する場合は、[はい]をクリックします。[スライド位置] と[スクレーパー位置] の値を既定値に設定します。[いいえ] をクリックすると、[スライド位置] と [スクレーパーの位置] の値が維持されるか、スライドが開始位置にありません。
  2. エアロゾル発生装置の上部の中央の開口部にあるパイプに物質スクレーパーをねじ込みます。
    注:プレスの特性に応じて、特殊なタイプの物質スクレーパーを使用できます。
  3. 物質スクレーパーが最低位置にない場合は、ボタンホーミングモードを使用します。
  4. 押された試験材料を持つ物質容器を物質スクレーパーの上に逆さまに置きます。物質容器のガラスが正面に面していることを確認します。物質容器の2つの穴がエアロゾルの発電機の上の2つのピンに合っていることを確認してください。ロッキングプレートを物質容器の上のスロットに置き、黒いネジを締めます。
  5. フィード(0.24 ~20 mm/h)と回転(1~800回転/h)の値を目的の設定に変更します。粒子濃度は、フィード値またはキャリアガス流量を増加または減少させることによって変更することができる。
  6. 下向きの矢印を使用して、物質スクレーパーが押された物質の近くまで、物質容器を持つスライドを押し下げます。
  7. マスフローコントローラをタップしてエアロゾル発生装置への圧縮空気供給を開き、スタートボタンをクリックしてエアロゾルの生成を開始します。長い待ち時間を避けるため、フィードレートを15~20mm/hに設定します。
  8. 小さな懐中電灯(エルトリアタのガラス管の下から配置)で微細な塵雲を観察することによって、正しい粒子の生成を制御します。最初のエアロゾル蒸気がエルドリアタに連続的に到達し、停止ボタンをクリックしたときに、フィードの値を目的の設定に戻します。

10. 露光実験

  1. プレ加熱露光媒体を使用してメディア電源を開始し、モジュールが開いている間にダウンパイプが覆われるまでサンプリングモジュールを充填します。媒体ポンプを使用するか、媒体を手動で充填してください(個々の露出室あたり25 mL)。
  2. ブラインド細胞培養挿入(セルなしの挿入)を露光モジュールに挿入します。ダウンパイプが媒体で覆われ、挿入物の下側が媒体と接触するまで、露光媒体をポンプで下にしてください。
  3. エアロゾルジェネレータを起動し、露光モジュールを閉じ、露光モジュールをエアロゾルジェネレータの露光モジュール出口に接続します。エアロゾル発生装置に、安定した粒子の生成を可能にするために、露出が開始される前に少なくとも20〜30分のリードタイムを与えます。
  4. インキュベーターコントロール用のポストインキュベーションプレートを準備し、露出した細胞培養液をリードタイム中に挿入します。1ウェルあたり1.5 mLの成長培地を加え、プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2)にインキュベートします。
  5. リードタイムの後、ゴム栓でElutriatorの露光モジュール出口を密封し、ブラインドインサートを取り外します。ダウンパイプが媒体で覆われるまで、露光媒体を(ポンプを使用するか手動で)補充してください。さて、マスフローコントローラのタップでクリーンエアモジュールへの圧縮空気供給も開きます(3 L/分)
  6. 6ウェルプレートから細胞培養インサートをTweezerの助けを借りて取り除きます。細胞培養液から慎重に増殖培地を注ぎ、インサートを転倒させて吸引し、ピペットを用いて残留液を捨てる。両方のモジュール、露出ときれいな空気モジュールの露出室に挿入物を置きます。
  7. モジュールを閉じ、エアロゾル発生装置の露光モジュール出口とクリーンエアモジュールをキャリアガス供給に同時に接続して、露光実験を開始します。
    注:粒子濃度は、フィード値、キャリアガスの流量、または曝露時間を増減することによって変更できます。
  8. 実験終了後に露光モジュールとクリーンエアモジュールを取り外し、露光モジュールのコンセントを密封します。
  9. 圧縮空気供給とエアロゾル発生装置を停止するには、停止ボタンをクリックします。
  10. 露光とクリーンエアモジュールを開き、Tweezerを使用して準備されたポストインキュベーションプレートに細胞培養インサートを移します。ALIで6ウェルプレートを24時間(37°C、5%CO2)でインキュベートします。
    注: さらに露出実験を計画している場合は、手順 10.5 -10.10 を繰り返します。
  11. 細胞培養インサートを持ち上げ、暴露された細胞培養インサートと同じ条件でALIにインキュベーターコントロールとして使用されるものを、ALIで24時間(37°C、5%CO2)用にインキュベートする。
  12. [ホーミング モード] ボタンを使用して、物質容器を削除します。右上隅にあるXをクリックしてエアロゾルジェネレータソフトウェアを閉じ、コンピュータの電源を切ります。
  13. すべての露光実験が完了した後、エアロゾル発生装置と両方の露光モジュールを清掃します。次の数日以内に被験物質がさらに使用される場合は、パラフィルムで物質容器を閉じます。

3日目

11. 細胞の生存率

注:細胞生存率は、WST-1アッセイを用いてミトコンドリア活性を測定することにより粒子沈着後24時間測定した。アッセイは、メーカーのプロトコルに従って行った。細胞生存率は、他の細胞生存率試験(例えば、XTT)を用いて決定することもできる。

  1. 37 °Cでテンパー成長培地と光から保護されたWST-1溶液を解凍します。適切な数の新しい6ウェルプレートをウェルあたり2.5 mLの成長培地で準備し、プレートをインキュベーターでインキュベートします。
  2. 成長培地で十分な量のWST-1 1:7を希釈してWST-1希釈を準備する
  3. 新たに調製した6ウェルプレートに露光後に細胞培養挿入液を24時間挿入する。各細胞培養挿入物に、新鮮な調製WST-1溶液を1mL加える。溶液を細胞に均質に分配するためにプレートを慎重に揺らす。細胞培養インサートを用いて6ウェルプレートを1時間(37°C、5%CO2)インキュベートします。
  4. 各6ウェルから96ウェルプレートに三重体の上清の100μLを移します。マイクロプレートリーダーを使用して、基準波長650 nmの450nmで吸光度を測定します。

12. 統計

  1. 個々のインキュベーター制御の細胞の生存率を100%に標準化する。
  2. 個々のインキュベーターコントロールに関連して露出した細胞の生存率を表す。試験物質の細胞毒性は、それぞれのインキュベーターコントロールと比較し、毒性の指標として使用した。

結果

CULTEX RFSはALIで細胞の直接および均質な露出を可能にする特別に設計されたモジュラーのインビトロ露出システムである。以前の検証前の研究では、この暴露システムの一般的な適用性とその転写性、安定性および再現性が実証された。ドイツ連邦教育研究省が資金を提供した最近の研究プロジェクトでは、暴露システムが検証され、試験された化合物の急性吸入危険...

ディスカッション

近年、吸入可能粒子の急性吸入ハザードに関する情報を得て、3R原則25に従って動物実験を低減・置換するために、多くの非動物吸入毒性試験モデルが開発されている。

細胞培養モデルの面では、細胞の曝露は、水没条件下またはALIで行うことができる。水没した条件下で細胞を曝露すると、物理化学的性質に影響を及ぼす可能性があり、したがって、?...

開示事項

著者らは、AT、KG、AB、SH、HM、TG、HTおよびDSは開示するものは何もない。同社カルテックステクノロジーGmbH(旧カルテックス研究所GmbH)は、この記事で使用される楽器(例えば、CULTEX RFS、CULTEX DG)を生産しています。NMは、この研究の間にカルテックス研究所GmbHの従業員でした.OKは、カルテックステクノロジーGmbH(旧カルテックス研究所社)の従業員です。デバイスの特許PCT /EP2009/007054は、カルテックステクノロジーGmbH教授ウルリッヒ・モール(旧カルテックス研究所GmbH)の創設者によって保持されています。

謝辞

この研究は、ドイツ連邦教育研究省(ドイツ連邦大臣フュル・ビルドゥン・ウント・フォルチュン、BMBF、ドイツ(グラント031A581、サブプロジェクトA-D))、ドイツ研究財団(ドイツフォルシュンシュゲセルシャフト、DFG) によって支援されました。研究研修グループ GRK 2338)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells
A549ATCCCCL-185
Cell culture medium and supplies
DMEMBiochrom, Berlin, GermanyFG 0415used as growth medium
DMEMGibco-Invitrogen, Darmstadt, Germany22320used as exposure medium
FBS superiorBiochrom, Berlin, GermanyS 0615
Gentamycin (10mg/mL)Biochrom, Berlin, GermanyA 2710
HEPES 1MTh. Geyer, Renningen, GermanyL 0180
PBSBiochrom, Berlin, GermanyL 1825
Trypsin/EDTA (0.05%/0.02%)Biochrom, Berlin, GermanyL 2143
Cell culture material
CASY CupsRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, GermanyREF 05651794
Cell culture platesCorning, Wiesbaden, Germany35166­-well plates
Corning Transwell cell culture insertsCorning, Wiesbaden, Germany345024mm inserts; 6-­well plates; 0.4 µm
Chemicals
CASYtonRoche Diagnostic GmbH, Mannheim, GermanyREF 05651808001
Compressed Air (DIN EN 12021)Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleißheim, Germany2290152
WST-1Abcam, Cambridge, United Kingdomab155902
Instruments + equipment
CASY Cell CounterSchärfe System GmbH, Reutlingen, Germany
Circulation thermostatLAUDA, Lauda-Königshofen, GermanyEcoline RE 100
CULTEX HyP - Hydraulic PressCultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX insert sleeveCultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for particle exposure)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX RFS - Radial Flow System Type 2 (module for clean air exposure)Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany
CULTEX supply
Flow controller 0-30 ml/min (IQ-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Flow controller 0-1,5 l/min (EL-Flow)Bronkhorst Deutschland Nord GmbH
Filters (large)Munktell & Filtrak GmbH, Sachsen, GermanyLP-050Munktell Sterile Filter; Particle retention efficiency > 99,999%
Filters (small)Parker Hannifin Corporation, Mainz, Germany9933-05-DQBalston disposable filter
Medium pumpCole-Parmer GmbH, Wertheim, GermanyIsmatec IPC High Precision Multichannel Dispenserdigital peristaltic pump
Microplate Reader Infinite M200 ProTecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany
Vakuum pumpKNF, Freiburg, GermanyN86 KT.18
Vögtlin mass flow controller 0,2-10 l/minTrigasFI GmbHVögtlin red-y compact regulator, Typ-Nr.: GCR-C3SA-BA20
Water BathLAUDA, Lauda-Königshofen, GermanyEcoline Staredition RE 104

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