JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ヒストンアセチルトランスビシ酵素(HAT、リジンアセチルトランスビセラーゼとも呼ばれる)の阻害剤は、CBP/p300などの、癌を治療するための潜在的な治療薬です。しかし、これらの阻害剤を検証するための厳格な方法が必要です。検証のための3つのin vitro方法には、組換えアセチルトランスファー酵素によるHATアッセイ、細胞培養におけるヒストンアセチル化のための免疫ブロット法、およびChIP-qPCRが含まれる。

要約

リジンアセチルトランスビセラーゼ(KATs)は、ヒストンや他のタンパク質上のリジン残基のアセチル化を触媒し、クロマチンのダイナミクスと遺伝子発現を調節します。CBP/p300などのKATは、多様な癌の腫瘍形成における重要な役割のために、治療標的として激しい調査を受けている。KASのヒストンアセチルトランスビセラーゼ(HAT)機能を標的とした新しい低分子阻害剤の開発は困難であり、潜在的な阻害剤の特異性および効力を検証できる堅牢なアッセイが必要である。

この記事では、新しい HAT 阻害剤 (HATi) に対して厳密な in vitro 検証を提供する 3 つのメソッドのパイプラインについて概説します。これらの方法には、試験管HATアッセイ、クロマチンハイアセチル化阻害(ChHAI)アッセイ、クロマチン免疫沈降定量PCR(ChIP-qPCR)が含まれる。HATアッセイでは、組換えHATは試験管反応でヒストンでインキュベートされ、ヒストンテール上の特定のリジン残基のアセチル化を可能にする。この反応はHATiによってブロックすることができ、部位特異的ヒストンアセチル化の相対的なレベルは、免疫ブロット法を介して測定することができる。HATアッセイで同定された阻害剤は、細胞環境で確認する必要があります。

ChHAIアッセイは、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(HDACi)によって誘発されるヒストンの堅牢な過アセチル化を減衰させる新しいHATiをスクリーニングするために免疫ブロッティングを使用します。ヒストンアセチル化の基底レベルは免疫ブロッティングを介して検出することが困難であり得るので、HDACiの添加は有用である。

HATおよびChHAIアッセイはヒストンアセチル化の世界的な変化を測定するが、特定のゲノム領域におけるアセチル化に関する情報は提供しない。したがって、ChIP-qPCRは、遺伝子調節要素におけるヒストンアセチル化レベルに対するHATiの影響を調べるのに使用される。これはヒストンDNA複合体の選択的免疫沈降とqPCRを介した精製されたDNAの分析によって達成される。これら3つのアッセイは、一緒に、新しいHATiの特異性、効力、および作用機序を慎重に検証することを可能にする。

概要

リジンアセチルトランスバシラーゼ(KATs)は、ヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質1、2、3、42,の両方にリジン残基1のアセチル化を触媒する。3,4最近の研究では、KATとそのアセチルトランスファーゼ機能が固形腫瘍の成長を促進できることを明らかに4、5、6、7、8、9 。,5,6,7,8,9例えば、CREB結合タンパク質(CBP)/p300は、癌2,33における多数のシグナル伝達経路を調節する2つのパラパスKAである。CBP/p300はヒストンアセチルトランスファー酵素(HAT)機能をよく特徴付け、ヒストン3リシン27アセチル化(H3K27ac)2、4、5、10、11、活性エンハンサー、プロモーター領域および活性遺伝子転写2,4,5,10,1112、13、1413,の重要12なマーカーを有する。14CBP/p300は、ヒストンおよび他の転写,因子,44、9、15、16、17、189,のアセチル化を介して腫瘍遺伝子の転写を活性化することによって16、17固形腫瘍における増殖促進シグナル伝達経路の重要な共活性化因子として機能する。1518腫瘍の進行におけるその役割のために、CBP/p300および他のKATは、発癌機能,,,,,,4、5、6、7、8、9、18、19、205,6を遮断する新規阻害剤の開発のために調査中である。4789181920A-485とGNE-049は、CBP/p30044,99に対する強力かつ特異的な阻害剤の開発に成功した2つの試みを表しています。CBP/p300および他のKATに対して現在、追加の阻害剤が調査中である。

先に説明したKAT阻害剤(KATi)の品質が問われ、多くの阻害剤が標的効果と悪い特性評価21を示している。そのため、高品質な化学プローブの開発には、新しい薬剤候補の厳密な特性評価と検証が不可欠です。ここでは、新しいKATiの効力と特異性をスクリーニングし、厳密に検証するためのパイプラインを形成する3つのプロトコルがあり、KATsのHAT機能(HATi)を阻害することに特に焦点を当てています。CBP/p300とその阻害剤が例として使用されていますが、これらのプロトコルは、HAT関数7を持つ他のKATに適応することができます。

第1のプロトコルは、精製された組換えp300およびヒストンを制御試験管反応に利用するインビトロヒストンアセチルトランスファー酵素(HAT)アッセイである。このアッセイは、実行が簡単で、費用対効果が高く、低スループット設定で化合物をスクリーニングするために使用することができ、放射性物質を必要としません。このプロトコルでは、組換えp300は、短いインキュベーション期間中にヒストン尾部のリジンアセチル化を触媒し、ヒストンアセチル化のレベルを標準的な免疫ブロッティング手順を使用して測定する。酵素反応は、ヒストンアセチル化を減少させる化合物をスクリーニングするCBP/p300阻害剤の存在または不在で行うことができる。さらに、HATアッセイは、PCAFなどの他の精製KATに対する活性を評価することによって、新規化合物がCBP/p300に選択的であるかどうかを検証するために使用することができる。HATアッセイは、そのシンプルさ、低コスト、および阻害剤の効力/選択性を決定する能力のために、新しい阻害剤を調査するための優れた出発点です。実際、このプロトコルは、多くの場合、in vitroスクリーン55、1010として文献で使用されています。しかしながら、HATアッセイで同定された阻害剤は、試験管反応が生細胞系よりはるかに単純であるため、細胞培養において必ずしも有効であるとは限らない。したがって、細胞培養実験22,23,23において阻害剤をさらに特徴付ける必要がある。

パイプラインの第2のプロトコルは、クロマチンハイパーアセチル化阻害(ChHAI)アッセイである。この細胞ベースアッセイは、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤(HDACi)をHATi24と共培養する前にクロマチン中のヒストンを高アセチレートするツールとして利用する。基底ヒストンアセチル化は細胞培養において低く、アセチル化を増加させるためにHDACiを添加せずに免疫ブロット法を介してプローブすることが困難になる。ChHAIアッセイの目的は、HDAC阻害によって引き起こされるヒストンアセチル化の増加を減衰させることができる新しいHATiを同定することです。このアッセイの利点は、その低コスト、実行する比較的容易さ、および試験管HATアッセイよりも生理学的関連性を提供する培養中の細胞の使用を含む。HATアッセイと同様に、このプロトコルはデータ収集に標準免疫ブロット法を使用します。

HATおよびChHAIアッセイは、グローバルヒストンアセチル化を阻害するための新規化合物の効力に関するデータを提供するが、これらの化合物が特定のゲノム領域における修飾にどのような影響を与えるかについての洞察を提供しない。そこで、最終プロトコルであるクロマチン免疫沈降定量ポリメラーゼ連鎖反応(ChIP-qPCR)は、ゲノムの特定の領域におけるDNAタンパク質相互作用を調べる細胞培養実験である。ChIP プロトコルでは、クロマチンは、DNA とタンパク質の相互作用を維持するために架橋されます。次いで、クロマチンを細胞から抽出し、DNA-タンパク質複合体は目的のタンパク質に対して選択的な免疫沈降を受ける(例えば、H3K27acに特異的な抗体を使用)。次いで、dnaを精製し、qPCRを用いて分析します。例えば、ChIP-qPCRは、Cyclin D125のような個々の腫瘍遺伝子におけるヒストンアセチル化を新規HATiがダウンリデンスするかどうかを判断するために使用することができる。ChIP-qPCR はフィールドで使用される一般的な手法ですが、4、10、26を最適化することは困難な場合があります。このプロトコルは、ChIP-qPCR 手順の実行中に発生する可能性のある落とし穴を回避するためのヒントを提供し、データに対して実行する必要がある品質管理チェックを含んでいます。

これら3つのプロトコルを併用すると、新しいHATiの厳密な特性評価と検証が可能になります。さらに、これらの方法は、実行が簡単で、比較的安価であり、グローバルおよび地域ヒストンアセチル化に関するデータを提供するため、多くの利点を提供します。

プロトコル

1. インビトロ HAT アッセイ

  1. バッファ準備
    注: バッファレシピについては 、表 1 を参照してください。
    1. 5xアッセイバッファーと6xナトリウムドデシル硫酸塩(SDS)を準備し、-20 °Cで保存します。 アリコートSDS 1 mLアリコートで。
    2. 10x SDSゲルランニングバッファと10x TBSTを準備し、室温で保存します。
    3. 1x転送バッファーを準備し、4 °Cで保管してください。
      注意: このプロトコルで使用されるすべての化学物質の安全性データシートを確認してください。SDS、DTT、およびブロモフェノールブルーは有毒であり、摂取、吸入、または皮膚または眼に曝されるべきではない。適切な取り扱い手順については、安全データシートを参照してください。危険な化学品を取り扱う際は、化学発煙フードをご使用ください。
  2. 帽子反応
    注:アナカルディン酸は既知のp300阻害剤3 であり、HATアッセイが新しいp300阻害剤を同定する方法を示す例として使用されています。ステップ 1.2.1 の概略については、 補足プロトコル (Schematic 1) を参照してください。
    1. 0.2 mL PCRチューブで以下の酵素反応を調製します:2 μLの5xアッセイバッファー、1 μLの精製p300(0.19 μg/μL)、アナカルディン酸(HATi)1 μL、または1xアッセイバッファーで希釈した1μLの制御、オートクレーブdDH2Oのプレラキュレートを行います。その後、3 μLの100 μMアセチルCoAを加え、精製されたH3.1(0.2 μg/μL)を1 μL加えます。
    2. PCRサーマルサイクラーで30°Cで1時間完全反応混合物をインキュベートします。
    3. 6x SDSサンプルバッファーに対して1:10比で2-メルカプトエタノールを加えます。
    4. PCR サーマルサイクラーからサンプルを取り出し、6x SDS の 2 μL (2-メルカプトエタノールを加えたもの) を反応ミックスに加えます。
      注意:2-メルカプトエタノールは有毒であり、化学発煙フードの内部で使用する必要があります。適切な取り扱いについては、安全データシートをご覧ください。
    5. 95°Cで熱ブロックで5分間加熱し、氷の上で冷却します。サンプルを-20または-80°Cで保存するか、以下の詳細に従ってゲル電気泳動および免疫ブロットを行ってください。
  3. ゲル電気泳動と免疫ブロット
    注: ゲル電気泳動と免疫ブロッティングに慣れていない場合は、ステップ 1.3.1~ 1.3.17 の実行方法の詳細については、この標準手順27を参照してください。追加情報は、ここに見つけることができます 28,,29,,30,31,32,,33.
    1. ピペット10 μLのサンプル(ステップ1.2.5から)を4〜20%の勾配ポリアクリルアミドゲルのウェルに入れる。タンパク質のラダーのピペット5 μLは、分子量の基準としてウェルの1つに。ゲルタンクを使用して、120 Vで90分間ゲルを実行します。
    2. 転写槽を用いてゲルを100Vでポリビニリデンジフッ化物(PVDF)膜に70分間移動させる。
    3. 転写装置から膜を取り出し、プラスチック容器に入れます。容器に1x TBST(5%ミルクを含む)を加えて膜をブロックし、室温で1時間軽く振ります。
    4. ステップ 1.3.3 から 1x TBST を削除します。選択した部位特異的アセチル抗体(例えば、5%乳を含む1x TBSTで1:5,000希釈でH3K18acまたはH3K27ac一次抗体)を穏やかに振って4°Cで膜を一晩インキュベートします。
    5. 一次抗体溶液を除去します。膜2xを室温で1x TBST(ミルクなし)で洗浄し、各洗浄ごとに15分間穏やかに揺れます。
    6. 2次抗体を1x TBST(5%乳を含む)で1:20,000で希釈し、穏やかな揺れで室温で1時間膜をインキュベートします。
    7. 二次抗体溶液を取り除きます。膜2xを室温で1x TBST(ミルクなし)で洗浄し、各洗浄ごとに15分間穏やかに揺れます。
    8. 膜から1x TBSTを排出します。HRP基質過酸化物溶液とHRP基質ルミノール溶液を1:1比(各1mL)とピペット2mLの膜表面に混合します。
    9. 室温で5分間膜で溶液をインキュベートします。
    10. 膜からペーパータオルに余分な化学発光基材を排出し、X線カセットホルダーの内側にラップで膜を置きます。
    11. X線フィルム処理専用の暗い部屋に移動します。膜を膜の上に置き、カセットを30sで閉じて、膜をX線膜に露出させる。
      注:膜と膜の接触時間は実験的に決定されなければならない。強い信号は短い露出(秒)を必要とし、弱い信号はより長い露出を必要とするかもしれません。
    12. カセットからX線フィルムを取り出し、X線フィルムプロセッサを介してフィルムを動かしてフィルムを処理します。X線フィルムの処理方法については、製造元のマニュアルを参照してください。
    13. ラップから膜を取り出し、穏やかな揺れで室温で5分間ddH2Oで洗います。
    14. 穏やかな揺れで室温で5分間0.2 M NaOHで膜をインキュベートします。
    15. 穏やかな揺れで、室温で5分間、ddH2Oで膜を洗浄します。
    16. 容器に1x TBST(5%ミルクを含む)を加えて膜をブロックし、室温で1時間軽く振ります。
    17. 次の一次抗体希釈液(例えば、最初に使用した抗体がH3K18acであった場合はH3K27ac用プローブ)を加え、4°Cで一晩振る。 すべての抗体プローブが完了するまで、ステップ1.3.4~1.3.17を繰り返します。

2. ChHAIアッセイ

  1. インビトロ薬物治療とアセチル化ヒストンの分析
    注:A-485は強力でよく特徴付けられるp300 HATiである2,4 .この阻害剤は、細胞培養におけるその有効性および特異性のために残りのアッセイに利用される。MS-275 (エンティナスタット)24 ヒストンアセチル化レベルを著しく増加させ、標準的な免疫ブロット法でアセチル化プローブの検出を容易にするために使用されるHDACiです。見る 補足プロトコル (回路図2)ステップ2.1で使用される薬物希釈液の概略について。
    1. 12ウェルプレートに100,000個のMCF-7細胞をシードし、細胞培養培地の1mLで80〜90%の合流まで細胞を増殖させます。次の実験計画のためにウェルをマーク: ウェル 1: DMSO 制御 (基準点);ウェル2:A-485(3 μM)ウェル3:A-485(10 μM)ウェル4:MS-275(3 μM)ウェル5:MS-275(3 μM)+A-485(3μM)。ウェル6:MS-275(3 μM)+A-485(10 μM)。
      注:MCF-7細胞を培養するには、完全なDMEM培地を使用し、セルが5%CO2で372°Cで増殖できるようにします。完全な DMEM レシピについては、表 1を参照してください。
    2. 播種後24時間で、完全なDMEM培地のピペット4 mLを滅菌15 mL円錐管にする。ピペット2 μL MS-275(DMSOでは6 mM)を培地の4 mLに、最終濃度は3 μM MS-275です。
    3. DMSOのピペット2 μLを、独立した滅菌15 mL円錐管内の培地4 mLにする。
      注意: DMSO の適切な取り扱いについては、安全データシートを確認してください。一部のグローブタイプは、DMSOの処理に対して評価されていません。
    4. 細胞培養培地をウェル4-6およびピペット1mLの3μM MS-275培地(ステップ2.1.2)から各ウェルに吸引する。未使用の希釈MS-275を破棄します。
    5. 希釈したDMSOのウェル1~3及びピペット1mLから各ウェルに細胞培養培地を吸引する。未使用の希釈 DMSO を破棄します。
    6. 細胞をインキュベーターに戻し、4時間インキュベートして、MS-275(ウェル4-6)に曝露した細胞中のアセチル化ヒストンの蓄積を可能にする。
      注:MS-275はHDACiであり、ヒストンハイパーアセチル化24を引き起こすでしょう。この4時間前培養は、MS-275がA-485を添加する前に過アセチル化を誘導できるようにするために必要であり、ヒストンアセチル化22、44を減少させる。
    7. MS-275で4時間のインキュベーションを行った後、次の希釈液を別々の滅菌1.5 mLチューブにピペット処理して準備します:1.0 μLのDMSOから1 mLのDMEM培地。DMEMメディアのDMSOの0.5 μLおよび0.5 μL A-485(6 mM)1 mL;DMEMメディアの0.5 μLおよびA-485(20 mM)の0.5 μL(20 mM);DMEMメディアのDMSOの0.5 μLおよびMS-275(6 mM)の0.5 μL(1 mL)。0.5 μLの A-485 (6 mM) および 0.5 μL MS-275 (6 mM) から 1 mL の DMEM メディア。0.5 μLの A-485 (20 mM) および 0.5 μL の MS-275 (6 mM) から 1 mL の DMEM メディア。
    8. この細胞培地をウェル1~6およびピペット1mLの希釈1からウェル1へ吸引し、希釈2~ウェル2、希釈3~ウェル3、希釈4~ウェル4、希釈5~ウェル5、希釈6~ウェル6に吸引する。
      注: 一般的なルールは、実験グループ間で DMSO (溶媒) の内容をバランスを取り、細胞の毒性や増殖の変化を避けるために、細胞培養で DMSO の含有量を 0.1% 超えないようにすることです。
    9. 培養器に細胞を戻し、20時間培養します。
    10. 20時間後、ウェル1〜6から細胞培養培地を吸引する。
    11. 1 mLのPBSをウェル1-6にピペットして細胞を洗浄する。PBSを吸引する。
    12. 1x受動リシスバッファ100μL( 表1参照)をウェル1~6に加えます。細胞の凍結融解およびリシスのために、細胞培養板(受動リシスバッファー内のサンプル)を一晩で−80 °Cに保存します。
      注意:バッファーを作る前に、すべての化学物質の安全データシートを確認してください。CDTAは、深刻な眼の損傷や刺激を引き起こす可能性があります。
    13. 室温でサンプルを解凍し、穏やかな揺れを10分間行います。サンプルを1.5 mLチューブに分け、すぐに氷の上に置きます。
    14. 各サンプルのタンパク質濃度を測定します。タンパク質濃度は、いくつかの確立されたプロトコル34を用いて決定することができる。
    15. 必要に応じて、1x受動リシスバッファーを使用してサンプル1~6間のタンパク質濃度を平衡化します。
    16. 2-メルカプトエタノールを6x SDSサンプルバッファーに対して1:10の比率で加えます。
    17. サンプル 1~6 に 2-メルカプトエタノールを含む 6x SDS サンプル バッファーを加えた後、最終的な濃度の 1 x SDS サンプル バッファーを得ます。
    18. 95°Cで熱ブロックで5分間加熱し、氷の上で冷却します。サンプルは、ステップ2.1.19まで-20°Cまたは-80°Cで保存することができます。
    19. ピペットは、サンプル1〜6のタンパク質の30 μgを含む体積を4〜20%の勾配ポリアクリルアミドゲル内のウェルに対して行う。プロトコル1に記載されたプロトコルに従って免疫ブロット法を実行する。

3. ChIP-qPCR

注: p300 の阻害剤については、以下のプロトコルを例に説明します。

  1. バッファ準備
    注: バッファレシピについては、表 1を参照してください。以下のChIPプロトコルの一般的なステップ(例えば、バッファレシピ、洗浄時間および遠心時間)は、市販キット(資料表を参照)のメーカーの推奨と文献35、36から変更され、36適応される。
    1. ChIP希釈バッファー、核膨潤緩衝液、低塩洗浄バッファー、高塩洗浄バッファー、LiCl洗浄バッファーおよびTEバッファーを準備する。4 °Cで保管。
    2. SDS溶解バッファー、10xグリシンバッファーおよびChIP溶出バッファーを準備します。室温で保管してください。
      注意:適切な取り扱いを確実にするために、バッファーを作る前にすべての化学物質の安全データシートを確認してください。
  2. 薬物治療
    注: ステップ 3.2 で使用される薬物希釈の概略については、 補足プロトコル (Schematic 3) を参照してください。
    1. 2つの15cm培養皿にMCF-7細胞をシードし、完全なDMEM培地の12 mLで90%の合流度に細胞を成長させます。次の実験設計のために皿をマークします: ディッシュ 1: DMSO コントロール (基準点);皿2:A-485(3 μM)。
      注:MCF-7細胞を培養するには、完全なDMEM培地を使用し、5%CO2で372°Cで成長してください。完全な DMEM レシピについては、表 1を参照してください。
    2. 滅菌15 mL円錐管で、DMEM培地のピペット12 mLおよびDMSOのピペット6 μL。よく混ぜます。
    3. 別の滅菌15 mL円錐管で、ピペット12 mLのDMEM培地とピペット6 μLのA-485(DMSOでは6 mM)で、最終的な濃度は3μM A-485を得る。よく混ぜます。
    4. ディッシュ1と2からメディアを吸引します。
    5. DMEMに希釈DMSOの12 mLを加えます(ステップ3.2.2.)をディッシュ1に追加します。
    6. DMEMの3μM A-485の12 mLを皿2に加えます(ステップ3.2.3.
    7. 培養物をインキュベーターに戻し、24時間インキュベートする。
  3. 細胞固定
    1. ピペット330 μL(27.5 μL/mL)のホルムアルデヒドを完全な培地に対し、プレートをそっと旋回して混合します。
      注意:ホルムアルデヒドは有毒です。適切な取り扱い手順については、安全データシートを参照してください。
    2. 室温で10分間インキュベートします。
    3. ピペット2mLの10xグリシンをプレートにし、旋回して混合する。
    4. 室温で5分間インキュベートします。
    5. インキュベーションの後、皿を氷の上に置き、プロテアーゼ阻害剤カクテルのアリコートを解凍します。
    6. ステップ3.1で用意したバッファを使用して、DMSOとA-485の両方のサンプルに対して、以下のソリューションを準備します。
      1. プロテアーゼ阻害剤カクテルの1:1,000希釈を用いたPBSの2 mL
      2. 1:1000希釈したプロテアーゼ阻害剤カクテルを用いた核膨潤緩衝液1mL
      3. プロテアーゼ阻害剤カクテルの1:1,000希釈を有するSDS溶解バッファーの0.5 mL
    7. 培地を細胞培養皿から吸引し、15mLの冷たいPBSで細胞を2回洗浄する。
    8. ピペット2 mLのPBSをプロテアーゼ阻害剤カクテル(ステップ3.3.6.1)を用いて細胞培養皿にする。セルスクレーパーを使用してセルを溶液に持ち上げます。
    9. 細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移します。必要に応じて、追加の PBS で残りのセルを収集します。
    10. スピンチューブは、4°Cで800 x g で5分間細胞をペレット化する。
    11. 上清とピペット1mLの核膨潤緩衝液をプロテアーゼ阻害剤カクテル(ステップ3.3.6.2)でペレットに吸引する。ペレットを再び懸濁し、氷の上で10分間インキュベートします。
    12. 4 °Cで2,700 x g で、ペレット核に5分間遠心分離します。
    13. 上清とピペット0.5mLのプロテアーゼ阻害剤カクテル(ステップ3.3.6.3)をペレットに吸引する。ペレットを再び懸濁し、氷の上で10分間インキュベートします。
    14. クロマチンサンプルを-80 °Cで保管し、ステップ3.4.1まで、またはステップ3.4に直ちに進みます。
  4. DNA超音波処理
    1. 130 μL のクロマチンを DMSO サンプル (ステップ 3.3.14) からピペット (130 μL) を使用して 2 つの DNA 超音波処理チューブに移します。
    2. 130 μL のクロマチンを A-485 サンプル (ステップ 3.3.14) からピペット (130 μL) を使用して 2 つの DNA 超音波処理チューブに移します。
    3. 次のソシレーター設定を使用して約150-200塩基ペア断片にDNAを超音波処理:175のピークインシデントパワー(W)、デューティファクター10%、バーストあたり200サイクル、430秒の処理時間。
      注: 超音波処理の設定はモデルによって異なる場合があり、設定は、異なるセルラインに適切なフラグメントサイズを達成するために調整する必要があります。
    4. 超音波処理後に氷の上にサンプルを保管してください。
    5. 超音波クロマチンをピペットと遠心分離機を4°Cで10,000 x g で1.5 mLチューブに移し、ペレットデブリに10分間移動します。
    6. 上清(超音波クロマチンを含む)を新しいチューブにピペットし、破片を捨てます。超音波クロマチンは-80°Cで保存することができます。
  5. クロマチン免疫沈降(ChIP)
    注: ステップ 3.5 の IP グループの概略については、 補足プロトコル (Schematic 3) を参照してください。
    1. DMSOおよびステップ3.4.6のA-485サンプルの超音波クロマチンのタンパク質含有量を測定します。タンパク質含有量は、確立されたプロトコル34を用いて測定することができる。
      注:このプロトコルは、分かりやすくするために、タンパク質の含有量が等しく、100 μLの超音波クロマチンが使用されると仮定します。それ以外の場合、タンパク質の含有量は、等しい体積内のすべてのサンプル間で平衡化する必要があります。
    2. DMSO超音波クロマチンのピペット100 μLを2つの1.5 mLチューブ(それぞれ100 μL)にします。各チューブにChIP希釈バッファーのピペット400 μL(プロテアーゼ阻害剤カクテルの1:1,000希釈を含む)を各チューブに合計体積を500 μLまで取り出し、1本のチューブから5μLの溶液を取り出し、DMSO入力として-20°Cで保存します。
    3. ピペット100 μLのA-485超音波クロマチンを2つの1.5 mLチューブ(それぞれ100 μL)にします。各チューブにChIP希釈バッファーのピペット400 μL(プロテアーゼ阻害剤カクテルの1:1000希釈液を含む)を各チューブに合計体積を500 μLまで取り出し、1つのチューブから5μLの溶液を取り出し、-20°Cで-20°CでA-485入力として保存します。
    4. ピペットを使用して、DMSOおよびA-485サンプルの対応するチューブに免疫沈降(IP)抗体(例えば非特異的IgG対照またはH3K27ac特異的抗体)を加える:IGG抗体を有するIP#1 DMSOクロマチン(5-10μg)H3K27ac抗体(5-10 μg)を用いてDMSOクロマチンを#2 IP;IgG抗体を用いてA-485クロマチンを#3 IP(5-10 μg);H3K27ac抗体(5-10 μg)を用いたIP#4 A-485クロマチン。
    5. 各チューブに20μLのプロテインA磁気ビーズを加えます。ビーズがうまく再中断されていることを確認してください。
    6. サンプルを4°Cで一晩回転させます。
    7. タンパク質Aのペレットは、磁気セパレータを用いて磁気ビーズを使用し、上清を除去する。ビーズを邪魔しないでください。
    8. 低塩洗浄バッファーの500 μL~1 mLでビーズを洗浄し、4°Cで5分間回転させます。 素早くスピンダウンし、磁気セパレータを使用してビーズをペレットにし、上清を取り除きます。
    9. 高塩洗浄バッファーの500 μL~1 mLでビーズを洗浄し、4°Cで5分間回転させます。 素早くスピンダウンし、磁気セパレータを使用してビーズをペレットにし、上清を取り除きます。
    10. LiCl洗浄バッファーの500 μL~1 mLでビーズを洗浄し、4°Cで5分間回転させます。 素早くスピンダウンし、磁気セパレータを使用してビーズをペレットにし、上清を取り除きます。
    11. 500 μL ~1 mL の TE バッファーでビーズを洗浄し、4 °C で 5 分間回転させます。 クイックスピンダウンを実行します。ステップ 3.5.14 まで、このビードを TE バッファに保管します。
    12. 入力サンプル(ステップ 3.5.2 および 3.5.3 から)をフリーザーから取り除き、氷の上に保管します。
    13. プロテイナーゼKのアリコートを解凍する。
    14. 磁気セパレータを使用してビーズをペレットにし、ビーズからTEバッファを取り除きます(ステップ3.5.11から)。
    15. 入力サンプルを含むすべてのサンプルに100 μLのChIP溶出バッファー+ 1 μL のプロテインナーゼ K を加えます。サーモサイクラーを用いて、62°Cで2時間揺れるサンプルをインキュベートします。
    16. 2時間後、サーモサイクラーを用いてサンプルを95°Cに10分間加熱する。
    17. サンプルを室温まで冷却します。
    18. 磁気セパレータを使用してペレット磁気ビーズを使用し、新しい1.5 mLチューブに上清(対象のDNAを含む)を移動します。
    19. 標準 PCR クリーンアップ キットを使用して DNA を精製します。
    20. 精製されたDNAは-20°Cで貯えることができるし、標準的なqPCRの議定書のテンプレートとして使用することができる。qPCR を実行するための製造元のプロトコルに従ってください。
  6. ChIP-qPCR データ分析
    注:ChIP-qPCRの結果を分析する2つの一般的な方法は、IgG抗体と1%入力法に対するフォールド濃縮です。両方の分析方法のための優れたテンプレートは、商業的なソースによって提供され、関心の各IP抗体/ターゲットのフォールド濃縮を迅速に計算するために使用することができます37.
    1. フォールディングと% 入力を計算するには、各抗体(非特異的IgG、IP H3K27ac抗体、および1%入力)について取得したqPCRデータからΔCt値をコピーして、分析テンプレートの対応する領域に貼り付け、フォールディングと収率入力が自動的に入力されます。

結果

インビトロヒストンアセチルトランスファーゼ(HAT)アッセイは、ヒストン基質に対するp300 HAT活性を阻害する化合物をプローブするために使用することができる。図1Aは、HATアッセイの実験用回路図を提供する。アナカルディン酸は、公知のHATi33,3838であり、12.5〜100μMの濃度範囲でこのアッセイに利用された。100 μMでは、アナ?...

ディスカッション

リジンアセチルトランスビセラーゼ(KATs)は、ヒストンの尾部および転写因子上のリジン残基を数個アセチル化して、遺伝子転写22,33を調節する。過去20年間の作業は、CBP / p300、PCAFおよびGCN5のようなKATが発癌性転写因子と相互作用し、いくつかの固形腫瘍タイプ44、5、9、15、16、17、185,

開示事項

著者は、利益相反や開示を行う必要はありません。

謝辞

この研究は、ジェームズとエステルキング生物医学研究プログラム(6JK03と20K07)、バンクヘッドコーリーがん研究プログラム(4BF02と6BC03)、フロリダ州保健省、フロリダ乳がん財団、UF健康がんセンターからの助成金によって支えられました。また、公開プロセス中のザカリー・オスキング博士とアンドレア・リン博士のサポートに感謝します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml tubeFisher Scientific05-408-129For all methods
10 cm dishSarstedt AG & Co.83.3902For cell culture of MCF-7 cells
10 ul tipsFisher Scientific02-707-454For all Methods
1000 ul tipsCorning4846For all Methods
10X Glycine bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
10X Running BufferFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
10X TBSTFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
12 well plateCorning3513For Method 2
15 cm dishSarstedt AG & Co.83.3903For Method 3
15 ml conical tubeSanta Cruz Biotechnologysc-200249For Methods 2 and 3
1X TBST with 5% milk and 0.02% Sodium AzideFor Methods 1 and 2. Can be used to dilute primary antibodies that will be used more than once. Allows for short-term storage of primary antibody dilutions. Do not use for secondary antibody diluton. CAUTION: Sodium Azide is toxic.
1X TBST with 5% milkFor Methods 1 and 2. Used to block PVDF membrane and for antibody diltions. See Table 1 for recipe.
200 ul tipsCorning4844For all Methods
2-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148for SDS sample buffer preparation
4-20% polyacrylamide gelThermo Fisher: InvitrogenXP04205BOXFor Methods 1 and 2
5X Assay bufferFor Method 1. See Table 1 for recipe.
5X Passive lysis bufferFor Method 2. See Table 1 for recipe.
6X Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)For Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
A-485MedChemExpressHY-107455CBP/p300 Inhbitor for use in Methods 2 and 3. Dissolved in DMSO.
Acetyl-CBP(K1535)/p300(K1499) antibodyCell Signaling Technology4771For Method 1
Acetyl-CoASigma-AldrichA2056for use in Method 1
Acetyl-Histone H3 (Lys 27) antibody (H3K27ac)Cell Signaling TechnologyCST 8173antoibodies for H3K27ac for immunoblots and ChIP
Acetyl-Histone H3 (Lys18) antibody (H3K18ac)Cell Signaling TechnologyCST 9675antoibodies for H3K18ac for immunoblots and ChIP
alpha tubulin antibodyMillipore SigmaT5168For Method 2. Dilute 1:20,000
Anacardic acidCayman Chemical13144For Method 1
anti-mouse IgG HRP linked secondary antibodyCell Signaling Technology7076For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000
anti-rabbit IgG secondary antibodyJackson ImmunoResearch711-035-152For Methods 1 and 2. Dilute 1:10,000 to 1:20,000
Autoradiography filmMIDSCIBX810For Methods 1 and 2
Belly Dancer Rotating PlatformStovall Life Science Incorporatednot availableFor Methods 1 and 2
Bovine Calf Serum (BCS)HyCloneSH30072.03cell culture media
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153for buffer preparation
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126for SDS sample buffer preparation
CDTASpectrum Chemical125572-95-4For buffer preparation
cell scraperMillipore SigmaCLS3010For Method 3
ChIP dilution bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
ChIP Elution BufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Complete DMEM for MCF-7 CellsFor Methods 2 and 3. See Table 1 for recipe.
Covaris 130 µl microTUBECovaris520045Sonication tube for use with Covaris S220 in Method 3
Covaris S220 Focused-ultrasonicatorCovarisS220DNA sonicator for use in Method 3
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich41639for drug dilution and vehicle control treatment
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma-Aldrich43815for SDS sample buffer preparation
DMEMCorning10-013-CVcell culture media
EDTAFisher ScientificBP120-1for buffer preparation
Example transfer tank and transfer apparatusBio-rad1704070For Methods 1 and 2
EZ-Magna ChIP A/G Chromatin Immunoprecipitation KitMillipore Sigma17-10086For Method 3
FK228 (Romidepsin)Cayman Chemical128517-07-7HDAC Inhibitor for use in Method 2
Formaldehyde solutionSigma-AldrichF8775for cell fixation
glycerolFisher ScientificBP229-1For buffer preparation
glycineSigma-AldrichG7126for buffer preparation
HEPESSigma-Aldrich54457for buffer preparation
High salt wash bufferFor Method 3
IGEPAL (NP-40)Sigma-AldrichI3021for buffer preparation
Immobilon Chemiluminescent HRP SubstrateMillipore SigmaWBKLS0500For Methods 1 and 2
KClFisher ScientificBP366-500for buffer preparation
LiClSigma-AldrichL9650For buffer preparation
LiCl wash bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Low salt wash bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Magnetic SeparatorPromegaZ5341For use in Method 3
MethanolSigma-Aldrich494437For buffer preparation
Mini gel tankInvitrogenA25977For Methods 1 and 2
MS-275 (Entinostat)Cayman Chemical209783-80-2HDAC Inhibitor for use in Method 2. Dissolved in DMSO.
NaClFisher Scientific7647-14-5for buffer preparation
NaOHFisher ScientificS318-100for buffer preparation in Methods 1 and 2
Normal Rabbit IgGBethyl LaboratoriesP120-101Control rabbit antibody for use in Method 3
Nuclei swelling bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
PCR Cleanup KitQiagen28104For use in Method 3
Penicillin/Streptomycin 100XCorning30-002-CIcell culture media
Phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-040-CVFor Methods 2 and 3
PIPESSigma-Aldrich80635for buffer preparation
powdered milkNestle CarnationFor Methods 1 and 2
Power Pac 200 for western blot transferBio-radFor Methods 1 and 2
Power Pac 3000 for SDS gel runningBio-radFor Methods 1 and 2
Prestained Protein LadderThermo Fisher26616For Methods 1 and 2
Protease Inhibitor CocktailSigma-AldrichPI8340for use in Method 3
Protein A Magentic BeadsNew England BioLabsS1425SFor use in Method 3
Proteinase KNew England BioLabsP8107SFor use in Method 3
PTC-100 Programmable Thermal ControllerMJ Research Inc.PTC-100For Method 1
PVDF Transfer MembraneMillipore SigmaIEVH00005For Methods 1 and 2
Recombinant H3.1New England BioLabsM2503Sfor use in Method 1
Recombinant p300ENZO Life SciencesBML-SE451-0100for use in Method 1
SAHA (Vorinostat)Cayman Chemical149647-78-9HDAC Inhibitor for use in Method 2
SDS lysis bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Sodium AzideFisher Scientific26628-22-8For Methods 1 and 2. CAUTION: Sodium Azide is toxic. See SDS for proper handling.
Sodium BicarbonateFisher ScientificS233-500for buffer preparation
Sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750for buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich71725for SDS sample buffer preparation
Standard HeatblockVWR Scientific ProductsMPN: 949030For Methods 1 and 2
Table top centrifugeEppendorf5417RFor all methods
TE bufferFor Method 3. See Table 1 for recipe.
Transfer bufferFor Methods 1 and 2. See Table 1 for recipe.
Trichostatin ACayman Chemical58880-19-6HDAC Inhibitor for use in Method 2
TrisFisher ScientificBP152-5for buffer preparation
Triton X-100Sigma-AldrichT8787for buffer preparation
Tween 20Sigma-Aldrich9005-64-5for buffer preparation in Methods 1 and 2
X-ray film processorKonica Minolta Medical & Graphic, Inc.SRX-101AFor Methods 1 and 2

参考文献

  1. Simon, R. P., Robaa, D., Alhalabi, Z., Sippl, W., Jung, M. KATching-Up on Small Molecule Modulators of Lysine Acetyltransferases. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (4), 1249-1270 (2016).
  2. Weinert, B. T., et al. Time-Resolved Analysis Reveals Rapid Dynamics and Broad Scope of the CBP/p300 Acetylome. Cell. 174 (1), 231-244 (2018).
  3. Dancy, B. M., Cole, P. A. Protein lysine acetylation by p300/CBP. Chemical Reviews. 115 (6), 2419-2452 (2015).
  4. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  5. Yang, H., et al. Small-molecule inhibitors of acetyltransferase p300 identified by high-throughput screening are potent anticancer agents. Molecular Cancer Therapeutics. 12 (5), 610-620 (2013).
  6. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  7. Coffey, K., et al. Characterisation of a Tip60 specific inhibitor, NU9056, in prostate cancer. Plos One. 7 (10), 45539 (2012).
  8. Majaz, S., et al. Histone acetyl transferase GCN5 promotes human hepatocellular carcinoma progression by enhancing AIB1 expression. Cell & Bioscience. 6, 47 (2016).
  9. Jin, L., et al. Therapeutic Targeting of the CBP/p300 Bromodomain Blocks the Growth of Castration-Resistant Prostate Cancer. Cancer Research. 77 (20), 5564-5575 (2017).
  10. Raisner, R., et al. Enhancer Activity Requires CBP/P300 Bromodomain-Dependent Histone H3K27 Acetylation. Cell Reports. 24 (7), 1722-1729 (2018).
  11. Jin, Q., et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation. The EMBO Journal. 30 (2), 249-262 (2011).
  12. Pradeepa, M. M. Causal role of histone acetylations in enhancer function. Transcription. 8 (1), 40-47 (2017).
  13. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  14. Wang, Z., et al. Combinatorial patterns of histone acetylations and methylations in the human genome. Nature Genetics. 40 (7), 897-903 (2008).
  15. Ianculescu, I., Wu, D. Y., Siegmund, K. D., Stallcup, M. R. Selective roles for cAMP response element-binding protein binding protein and p300 protein as coregulators for androgen-regulated gene expression in advanced prostate cancer cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (6), 4000-4013 (2012).
  16. Zhong, J., et al. p300 acetyltransferase regulates androgen receptor degradation and PTEN-deficient prostate tumorigenesis. Cancer Research. 74 (6), 1870-1880 (2014).
  17. Fu, M., et al. p300 and p300/cAMP-response element-binding protein-associated factor acetylate the androgen receptor at sites governing hormone-dependent transactivation. The Journal of Biological Chemistry. 275 (27), 20853-20860 (2000).
  18. Emami, K. H., et al. A small molecule inhibitor of beta-catenin/CREB-binding protein transcription [corrected]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (34), 12682-12687 (2004).
  19. Stimson, L., et al. Isothiazolones as inhibitors of PCAF and p300 histone acetyltransferase activity. Molecular Cancer Therapeutics. 4 (10), 1521-1532 (2005).
  20. Modak, R., et al. Probing p300/CBP associated factor (PCAF)-dependent pathways with a small molecule inhibitor. ACS Chemical Biology. 8 (6), 1311-1323 (2013).
  21. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nature Communications. 8 (1), 1527 (2017).
  22. Liao, D. Identification and characterization of small-molecule inhibitors of lysine acetyltransferases. Methods in Molecular Biology. 1238, 539-548 (2015).
  23. Gardberg, A. S., et al. Make the right measurement: Discovery of an allosteric inhibition site for p300-HAT. Structural dynamics. 6 (5), 054702 (2019).
  24. Ceccacci, E., Minucci, S. Inhibition of histone deacetylases in cancer therapy: lessons from leukaemia. British Journal of Cancer. 114 (6), 605-611 (2016).
  25. Tashiro, E., Tsuchiya, A., Imoto, M. Functions of cyclin D1 as an oncogene and regulation of cyclin D1 expression. Cancer Science. 98 (5), 629-635 (2007).
  26. Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Molecular Biotechnology. 45 (1), 87-100 (2010).
  27. JoVE. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot. JoVE. , (2020).
  28. Gooderham, K. Transfer techniques in protein blotting. Methods in Molecular Biology. 1, 165-178 (1984).
  29. Westermeier, R. . Electrophoresis in practice: A guide to methods and applications of DNA and protein separations. , (2004).
  30. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  31. Kurien, B. T., Scofield, R. H. Nonelectrophoretic bidirectional transfer of a single SDS-PAGE gel with multiple antigens to obtain 12 immunoblots. Methods in Molecular Biology. 536, 55-65 (2009).
  32. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 10 (3-4), 203-209 (1984).
  33. Tovey, E. R., Baldo, B. A. Comparison of semi-dry and conventional tank-buffer electrotransfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 8 (9), 384-387 (1987).
  34. Greenfield, E. A. Protein Quantitation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (6), (2018).
  35. Barrow, J. J., Masannat, J., Bungert, J. Neutralizing the function of a β-globin-associated cis-regulatory DNA element using an artificial zinc finger DNA-binding domain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (44), 17948-17953 (2012).
  36. Leach, K. M., et al. Characterization of the human beta-globin downstream promoter region. Nucleic Acids Research. 31 (4), 1292-1301 (2003).
  37. ChIP-qPCR and Data Analysis. Sigma-Aldrich Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/chip-qpcr-data-analysis.html (2020)
  38. Balasubramanyam, K., Swaminathan, V., Ranganathan, A., Kundu, T. K. Small molecule modulators of histone acetyltransferase p300. The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19134-19140 (2003).
  39. Using ImageJ to quantify blots. Diamantina Institute - University of Queensland Available from: https://di.uq.edu.au/community-and-alumni/sparq-ed-services/using-imagej-quantify-blots (2020)
  40. Kalkhoven, E., et al. Loss of CBP acetyltransferase activity by PHD finger mutations in Rubinstein-Taybi syndrome. Human Molecular Genetics. 12 (4), 441-450 (2003).
  41. Ortega, E., et al. Transcription factor dimerization activates the p300 acetyltransferase. Nature. 562 (7728), 538-544 (2018).
  42. Koutelou, E., Hirsch, C. L., Dent, S. Y. R. Multiple faces of the SAGA complex. Current Opinion in Cell Biology. 22 (3), 374-382 (2010).
  43. Wang, Y., et al. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases. Chemistry & Biology. 22 (2), 273-284 (2015).
  44. Hu, E., et al. Identification of novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307 (2), 720-728 (2003).
  45. Lee, B. I., et al. MS-275, a histone deacetylase inhibitor, selectively induces transforming growth factor beta type II receptor expression in human breast cancer cells. Cancer Research. 61 (3), 931-934 (2001).
  46. Leus, N. G. J., et al. HDAC1-3 inhibitor MS-275 enhances IL10 expression in RAW264.7 macrophages and reduces cigarette smoke-induced airway inflammation in mice. Scientific Reports. 7, 45047 (2017).
  47. Rossi, L., et al. HDAC1 inhibition by MS-275 in mesothelial cells limits cellular invasion and promotes MMT reversal. Scientific Reports. 8 (1), 8492 (2018).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

162 KATs CBP p300

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved