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要約

このプロトコルは、虚血性脳卒中のマウスモデルである一過性中大脳動脈閉塞後の肺環境における免疫細胞組成、サイトカインプロファイル、およびケモカインプロファイルの変化を同定するためのフローサイトメトリーの使用を記載している。

要約

複数のサイトカインおよびケモカインの発現によって制御される免疫細胞の増殖、活性化、および肺への輸送は、重度の脳損傷によって変化し得る。これは、肺炎が虚血性脳卒中に罹患した患者の死亡の主な原因であるという事実によって証明される。このプロトコルの目的は、一過性中脳動脈閉塞による虚血性脳卒中誘導後の肺胞マクロファージ、間質マクロファージ、CD103+またはCD11b+樹状細胞(DC)、形質細胞様DC、好酸球、単球/単球由来細胞、好中球、リンパ球由来TおよびB細胞、NK細胞、およびNKT細胞を含む、マウスの肺における13種類の免疫細胞を同定するための多色フローサイトメトリー分析の使用を記述することである。さらに、ビーズホモジナイゼーション法を用いた肺ホモジネートの調製について記載し、フローサイトメトリー分析と結合したマルチプレックスビーズアレイによって13種類のサイトカインまたはケモカインの発現レベルを同時に決定する。このプロトコルはまた、感染性肺疾患またはアレルギー性疾患などの他の疾患設定における肺免疫応答を調査するためにも使用することができる。

概要

肺はバリア器官であり、外部環境にさらされているため、病原体やアレルゲンなどの免疫学的課題を絶えず受けています1。肺環境から病原体を除去するためには、肺常在免疫細胞の活性化と末梢からの免疫細胞の浸潤が必要です。さらに、肺常在性免疫細胞は共生細菌に対する耐性を維持しており、これらの細胞が病原体のクリアランスおよび恒常性の維持に役割を果たしていることを示唆している1。肺胞マクロファージおよび間質マクロファージは、パターン認識受容体を介して病原体を感知し、貪食作用によってこれらの病原体をクリアする肺常在性センチネル免疫細胞の1つです2。肺常在樹状細胞は、抗原提示を介して自然免疫応答と適応免疫応答を橋渡しする 3.また、活性化された局所自然免疫細胞は、炎症反応を増幅し、単球、好中球、リンパ球などの免疫細胞の肺への浸潤を刺激するサイトカインやケモカインを産生する1。虚血性脳卒中は、全身性免疫を改変し、肺感染症に対する感受性の増加につながることが示されている;しかし、虚血性脳卒中後の肺区画を評価した研究はほとんどないが、炎症状態4,5,6,7,8,9の間にそれを調べた研究もある。本明細書に記載される方法の目標は、肺病理、免疫細胞組成、ならびに肺におけるサイトカインおよびケモカイン発現のレベルを同時に決定して、肺区画への変化を評価し、虚血発作後の肺免疫応答への潜在的な変化を評価することである。

ここに記載するのは、13種類の免疫細胞を同定するためにマウスの肺から単一細胞懸濁液を得るためのプロトコールである。このプロトコルは、自動化された組織解離器を必要とせずに、コラゲナーゼDによる組織消化に基づいています。さらに、フローサイトメトリーベースのマルチプレックスビーズアレイを使用して、13種類のサイトカインまたはケモカインの発現レベルを決定するために使用できる組織ホモジネートを調製するプロトコルを開発しました。このプロトコルは、虚血性脳卒中が肺免疫に及ぼす影響を調査するために首尾よく使用され、他の疾患モデルでも使用することができる。

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プロトコル

実施されたすべてのプロトコルと手順は、ウェストバージニア大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました。マウスを、ウェストバージニア大学のビバリウム中の特異的病原体フリー条件下で飼育した。

1. 溶液の調製

  1. 灌流緩衝液(リン酸緩衝生理食塩水、PBS)を調製する。マウス1匹あたり約2つの氷冷PBSの10mLアリコートを使用する。
  2. 肺細胞培地/FACSバッファーを調製する。FACS緩衝液は、1%ウシ胎児血清(FBS)を添加したPBSを含有する。肺の切除と移動の全プロセスのために培地を冷たく保ちます。肺サンプルあたり約8mLを調製する。実験前に新鮮な培地/FACSバッファーを調製してください。
  3. 単一細胞単離のための解離バッファーを調製する。緩衝液は、ハンクス緩衝塩溶液(HBSS)中に1mg/mLコラゲナーゼDおよび200μg/mLDNase Iを含有する。実験前に、原液(100 mg/mL コラゲナーゼ D および 10 mg/mL DNase I) から新鮮に調製します。肺サンプルあたり約6mLが必要です。使用前にバッファが室温に達していることを確認してください。
  4. 肺組織均質化のための均質化緩衝液を調製する。緩衝液は、PBSおよび1xプロテイナーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル(ストック=100x)を含有する。実験前に新たに準備してください。均質化プロセス全体を通してバッファーを冷たく保ちます。約200μLの緩衝液は、肺の単一の右葉を均質化するのに十分である。

2.一過性中大脳動脈閉塞(tMCAO)

注:中大脳動脈へのモノフィラメント挿入を介したtMCAOの手順は、以前に詳細に文書化されていました10。これらの実験では、体重25〜30gの8〜12週齢の雄性C57BL/6Jマウスを使用した。

  1. 簡単に言えば、手術前にマウスに2mg / kgメロキシカムを皮下投与する。 5%イソフルランを用いて誘導チャンバー内でマウスを深く麻酔する。つま先ピンチ法で深麻酔を確認します。鼻錐を使用して手術中に1〜2%のイソフルランで麻酔を維持します。マウスの下に暖かい毛布を置いて、手順を通して体温を36.5〜38°Cに保ちます。すべての手術器具は、手術の前日にオートクレーブ滅菌する必要があります。
  2. 70%エタノールとそれに続くクロルヘキシジンスクラブを使用して腹側頸部の皮膚を剃り、準備する。最初の切開を行う前に、切開領域に2mg / kgのブピバカインを皮下投与する。乾燥を防ぐために目を覆うために眼軟膏を使用してください。正中線頸部切開を行います。気管の周りの柔らかい組織を静かに脇に引っ張ります。
  3. 左総頚動脈と外頸動脈を特定します。
  4. 血液の流れを止めるために、総頸動脈に一時的な縫合糸(サイズ6/0)を塗布する。外頸動脈を切開する。
  5. シリコーンゴムコーティングされたモノフィラメント(サイズ6-0)を外頸動脈に挿入し、モノフィラメントを中大脳動脈に進める。モノフィラメントを中大脳動脈に60分間放置する(閉塞)。
  6. レーザードップラー流量測定を使用して血流速度を監視します。中大脳動脈への流量が>80%減少したことは、閉塞が成功したことを示す。
  7. 60分間の閉塞に続いて、モノフィラメントを取り出し、再灌流が起こるようにする。切開部を閉じます。
  8. 偽手術マウスでは、モノフィラメントを挿入せずにステップ2.1〜2.6を実行する。これらのマウスでは、血流の速度は、手順全体を通して安定したままであるべきです。
  9. マウスを毎日モニターし、標準的なスコアリング基準11を使用して神経学的欠損を測定する。0 – 神経学的欠陥なし;1 – 尾によって持ち上げられたときに対側前足を引っ込めます;尾によって持ち上げられたときの対側への2-円;3-歩行中に対側に落ちる。4 – 自発的に歩かないか、昏睡状態です;5 - 死んだ。
  10. 手術後3日間、24時間ごとに通常の生理食塩水と鎮痛剤(メロキシカム、2mg / kg)の皮下注射を行います。
  11. 下流分析のためにtMCAOの24時間および72時間後に肺を単離する。

3.肺組織の収穫

  1. 100mg/kgのケタミンおよび10mg/kgのキシラジンの腹腔内(すなわち)注射により、マウスを深く麻酔する。つま先ピンチ法で深麻酔を確認します。
  2. 全身心経灌流12を行うには、マウスを手術台にピン留めし、70%エタノールで毛皮を濡らして体腔内への毛皮分布を減少させる。細かい解剖はさみを使用して、尾腹部に横方向の切開を行い、次に腹膜の正中線切開を行い、横隔膜を突き刺す前に胸腔で止まる。
    1. 筋肉を切断したり、腹腔に隠れたり、腹部を過ぎて切開を続けたりしないでください。
  3. 横隔膜を穿刺する前に胸腔に到達したらすぐに切開を停止します。灌流の質や細胞の回復を損なう可能性のある心臓や肺を傷つけないように注意してください
  4. 細かい解剖はさみを使用して、横隔膜を突き刺す前に胸腔で止まる腹膜の正中線切開を行う。
  5. 鉗子を使用して胸骨の遠位端でマウスをつかみ、心臓、肺、または血管系を傷つけないように横隔膜を切り裂きながら上に持ち上げます。臓器が見えたら、胸郭を切開し、心臓と肺が完全に露出するようにリブケースを分離してピン留めします。
  6. 大動脈弓の近くの右心房に慎重に小さな切開をしてください。これは灌流のための流出として役立つでしょう。
  7. その直後に、10mLの冷たいPBSを充填したシリンジに取り付けられた25G x 5/8針を左心室の遠位上面に静かに挿入する。心室中隔を通って右心室に挿入しないように注意してください。針は左心室にかろうじて挿入する必要があります。
    注:心室中隔が穿孔されている場合、マウスの鼻から液体が飛び出します。これは灌流の質を低下させ、細胞損失をもたらす。
  8. 所望により、灌流中に針を左心室内の所定の位置にしっかりと保持するためにクランプが使用され得る。
  9. 10mLの冷たいPBSを着実に、しかし穏やかに心臓に押し込みます。マウス組織は、体液が右心房から出るにつれて血液を灌流し、一掃し始めるべきである。
    1. 十分な血液クリアランスが生じるまで、PBSの10mLの第2アリコートを押す。肝臓は明るい茶色の外観を持ち、肺は赤みがかったピンク色からほとんどが白色に変わります。
  10. 鉗子と細かい解剖はさみを使って、心臓、気管、食道、胸腺、結合組織、リンパ節、大きな気管支など、周囲の組織をすべて慎重に取り除きます。
  11. 個々の肺葉を分離し、1〜2mLの冷肺細胞培地のアリコートを含む氷上のシャーレに葉を置く。

4. ビーズホモジナイザーを用いたマルチプレックスビーズアレイの肺組織の均質化

  1. 滅菌2.3 mmジルコニア/シリカビーズ3個を含む2 mL円錐形スクリューキャップチューブを事前に冷却します。200 μLの冷ホモジナイズバッファーをチューブに加えます。
  2. ローブを秤量し、ビーズおよび均質化緩衝液を含む予め冷却された円錐管にローブを移す。
    注:200 μLのバッファーでホモジナイズされた約50〜100 mgの組織で十分であり、サンプル中のサイトカインおよびケモカイン発現を検出するのに十分です。
    1. ビーズベースのホモジナイザー( 材料表を参照)を使用して、4,000rpmで2分間ローブを均質化します。
    2. 組織が完全に均質化されていることを確認します。必要に応じて時間を増やします。
  3. 均質化に続いて、チューブを予め冷却した(4°C)マイクロ遠心分離機中で15,870 x g で3分間遠心分離する。
  4. 上清を予め冷却した1.5mLマイクロチューブに移す。
  5. すぐに使用できるようにサンプルを氷の上に直接置くか、将来の使用のためにサンプルを-80°Cで保管してください。複数の凍結融解サイクルは避けてください。

5. 肺組織の解離と単一細胞の単離

  1. 肺細胞培地を注ぎ、残りの肺葉の解離緩衝液の希釈を避ける。次いで、1mLの解離緩衝液を含む25Gおよび5/8針を含む1mLシリンジを肺組織に慎重に挿入する。
  2. 解離バッファーの小さな画分(約1/4~ 1/5番目)を各肺葉に注入し、穏やかに膨らませます。
    注:ほとんどのバッファは、ローブが切除されているため、膨らんだ直後に飛び出します。
  3. 解離緩衝液の注入を1〜2倍繰り返す。
  4. 肺葉を解離緩衝液と共に室温で2分間インキュベートする。
  5. 細かい解剖はさみを使用して肺葉を細かく刻みます。
  6. 解離バッファーでミンチした肺片を15 mL遠沈管に移します。 追加の解離緩衝液を合計6mLまで補充する。1分間激しく渦を巻きます。
  7. サンプルを37°Cで45分間インキュベートする。 渦は7〜8分ごとに激しくなります。
  8. 45分間のインキュベーション後、最適な結果を得るためにサンプルを1分間激しく渦巻きます。
  9. さらに、100μmの細胞ストレーナーを通過することによってサンプルを解離させ、残留組織、望ましくない結合組織、および間質組織を除去する。
  10. サンプルを380 x gで10分間遠心分離し、上清を捨てる。
  11. 5 mLの冷肺細胞培地をサンプルに加える。穏やかなボルテックスによって細胞ペレットを再懸濁する。
  12. サンプルを380 x gで10分間遠心分離し、上清を捨てる。
  13. 1mLの冷肺細胞培地を加える。穏やかなボルテックスによって細胞ペレットを再懸濁する。
  14. 100μmのセルストレーナーを通過し、細胞を数えます。

6. 肺免疫細胞ニッチのフローサイトメトリー解析

  1. 種子1-2 x 106個の細胞/抗体を96 ウェルの丸底プレート(合計3セット)にセットします。細胞を830 x gで3分間遠心分離する。上清を捨てる。
  2. 細胞ペレットを、固定可能な生/死垢を含む50μLの冷PBSに再懸濁する。製造元の指示に従って汚れを準備します。
  3. 細胞を4°Cで20分間インキュベートし、光から保護します。細胞を830 x gで3分間遠心分離する。上清を捨てる。
  4. 5 μg/mL の抗マウス CD16/32 抗体を含む 25 μL の低温 FACS バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。4°Cで10〜15分間インキュベートする。
  5. 表1に列挙した抗体組合せを含む25μLの低温FACS緩衝液を細胞に加える。穏やかなピペッティングで混ぜる。
    注:抗体染色用のFACSバッファーの総容量は50 μLです。したがって、25 μLの抗体のマスターミックスを調製する場合、抗体の濃度は最終濃度の2倍にする必要があります。
  6. 細胞を4°Cで20分間インキュベートし、光から保護します。細胞を830 x gで3分間遠心分離する。上清を捨てる。
  7. 細胞を100 μLの低温FACSバッファーで再懸濁します。細胞を830 x gで3分間遠心分離する。上清を捨てる。
  8. 細胞を100 μLの低温FACSバッファーで再懸濁します。追加のFACsバッファーを150 μL含むポリスチレン製丸底5 mL FACSチューブに移します。フローサイトメーターを用いて直ちに試料を分析する。
    注:次の手順を使用した細胞固定により、サンプルを後で分析できます。
  9. ステップ6.7に続いて、PBS中の1%パラホルムアルデヒド100μLでサンプルを再懸濁する。
  10. サンプルを4°Cで15分間インキュベートし、光から保護します。細胞を830 x gで3分間遠心分離する。上清を捨てる。
  11. 細胞を100 μLの低温FACSバッファーで再懸濁します。細胞を830 x gで3分間遠心分離する。上清を捨てる。
  12. 細胞を100 μLの低温FACSバッファーで再懸濁します。セルを4°Cで保管し、光から保護します。72時間以内にサンプルを分析します。

7. サイトカインおよびケモカイン検出のためのマルチプレックスビーズアレイ

注:市販の炎症誘発性ケモカインおよび炎症多重パネル( 材料表を参照)を使用して、詳細に記載されている製造業者のプロトコールに従ってtMCAO誘導後の肺におけるケモカインおよびサイトカインの発現を決定した13。

  1. 簡単に言えば、分析種が組織均質化後に-80°Cで保存された場合、氷上で解凍する。使用前にサンプルを590 x g で4°Cで2分間遠心分離し、残留組織を除去します。
  2. 既知の濃度 10 ng/mL の標準カクテル (C7) を 7 つの標準物質 (C1-6) に段階的に希釈し、最後の標準をアッセイバッファーのみ (C0) にして、標準曲線を生成します。
  3. すべての試薬が室温まで温まったら、各標準物質25 μLおよびアッセイバッファー25 μLをV底96ウェルプレートに加えます。
  4. 各サンプルウェルに、25 μLの肺ホモジネート(検体)と25 μLのアッセイバッファーをV底96ウェルプレートに加えます。
  5. プレコートビーズを激しくボルテックスし、次いで25μLのプレコートビーズを標準ウェルおよびサンプルウェルのそれぞれに加える。
  6. プレートを密封し、ホイルで覆って光から保護します。プレートを室温で110rpmで2時間振る。
  7. 230 x g で5分間遠心分離する。200 μLの洗浄バッファーを1xで加えます(原液は20x、水で1xに希釈します)。1分間インキュベートする。
  8. 230 x g で5分間遠心分離する。標準物質とサンプルを25 μLの検出抗体で再懸濁します。
  9. 光から保護するためにプレートを密封して覆います。プレートを110rpmで室温で1時間振盪する。
  10. 25 μLのストレプトアビジン-フィコエリスリン(SA-PE)を各標準物質に加え、ウェルをサンプリングする。
  11. 光から保護するためにプレートを密封して覆います。室温で110rpmで30分間振盪する。
  12. プレートを230 x g で5分間回転させます。標準品とサンプルを1x洗浄バッファーに再懸濁します。
  13. 追加の150 μLの1x洗浄バッファーを含む、十分に標識されたポリスチレン丸底5 mL FACSチューブに移します。
  14. フローサイトメーターを用いて標準物質および試料についてのPEシグナル蛍光強度を決定する。
  15. 予め決定された濃度に対するPEの平均蛍光強度(MFI)を用いて、各ケモカインおよびサイトカインの標準曲線を構築する。
  16. 各試料からの標準曲線およびMFIを用いて各ケモカインおよびサイトカインの濃度を決定する。マルチプレックスパネルは、各分析物の濃度を決定するために使用できるデータ分析ソフトウェアを提供します。頂端/上葉の重量は、組織のミリグラムあたりのサイトカインまたはケモカインの濃度を決定するために使用されます。

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結果

我々は最近、マウスにおける虚血性脳卒中誘導が肺の免疫細胞組成を変化させることを報告した11。具体的には、一過性脳虚血は肺胞マクロファージ、好中球、およびCD11b+ DCの割合を増加させ、肺区画内のCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、B細胞、NK細胞、および好酸球の割合を減少させた。さらに、細胞の変化は、肺における複数のケモカインの有意な減少レベルに対応していた。こ?...

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ディスカッション

ここで説明するプロトコールは、肺免疫細胞型の同定および同じマウスにおけるケモカインまたはサイトカインの発現を可能にする。組織病理学研究が必要な場合は、単一細胞単離ステップに進む前に、その目的のために個々の葉を除去して固定することができる。この方法の1つの制限は、免疫細胞組成の変化およびケモカインおよび/またはサイトカインの発現が肺の異なる葉間で不均等?...

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開示事項

著者らには開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、NIH助成金P20 GM109098とプラエスペロからエドウィン・ワンへのイノベーション賞プログラムによって支援されました。フローサイトメトリー実験は、NIH助成金S10 OD016165、U57 GM104942、P30 GM103488、およびP20 GM103434によってサポートされているWVUフローサイトメトリー&シングルセルコア施設で実施されました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
B220-APC, clone RA3-6B2Biolegend1032121:200 dilution
Beadbug 3 position bead homogenizerBenchmark ScientificD1030Tissue homogenizer
CCR2-BV421, clone SA203G11Biolegend1506051:200 dilution
CD103-BV421, clone 2E7Biolegend1214221:200 dilution
CD11b-PE/Cy7, clone M1/70Biolegend1012161:400 dilution
CD11c-PE/Cy7, clone N418Biolegend1173181:200 dilution
CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418Biolegend1173281:200 dilution
CD4-BV421, clone GK1.5Biolegend1004431:200 dilution
CD45-FITC, clone 30-F11Biolegend1031081:200 dilution
CD64-APC, clone X54-5/7.1Biolegend1393061:200 dilution
CD8-PE, clone 53-6.7Biolegend1007081:800 dilution
Collagenase DSigma Aldrich11088882001Component in the dissociation buffer
Conical screw cap tubeThermoFisher02-681-344Tube for tissue homogenization
DNase ISigma Aldrich10104159001Component in the dissociation buffer
Fc block CD16/32 antibodyBiolegend1013201:100 dilution
genlteMACS dissociatorMiltenyi Biotec130-093-235Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator
gentleMACS C tubesMiltenyi Biotec130-093-237Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator
Halt protease and phosphatase inhibitor cocktialThermoFisher78442Component in the homogenization buffer
Laser doppler monitorMoorMOORVMS-LDFBlood flow monitoring during tMCAO
LEGENDplex proinflammatory chemokine panelBiolegend740451Multiplex bead array
LIVE/DEAD fixable near-IR stainThermoFisherL34976Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis
Ly6C-PE, clone HK1.4Biolegend1280081:800 dilution
Ly6G-BV510, clone 1A8Biolegend1276331:200 dilution
MCAO suture L56 reusable 6-0 mediumDoccol602356PK10RetMCAO
MHC II-BV510, clone M5/114.15.2Biolegend1076361:800 dilution
NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136Biolegend1087281:200 dilution
Siglec F-PE, clone E50-2440BD Biosciences5521261:200 dilution
Silk suture thread, size 6/0Fine Science Tools18020-60tMCAO
SomnoSuite anesthesia systemKent ScientificSS-01Mouse anaesthetization for tMCAO
TCRb-BV510, clone H57-897Biolegend1092341:200 dilution
Zirconia/silica beads, 2.3 mmBiospec11079125zBeads for tissue homogenization

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