Caracterização de Células Imunes e Mediadores Proinflamatórios no Ambiente Pulmonar

Resumo

Este protocolo descreve o uso de citometria de fluxo para identificar as alterações na composição das células imunes, perfil de citocina e perfil de quimiocina no ambiente pulmonar após a oclusão da artéria cerebral média transitória, um modelo murino de derrame isquêmico.

Resumo

A expansão, ativação e tráfico de células imunes aos pulmões, que são controladas pela expressão de múltiplas citocinas e quimiocinas, podem ser alteradas por lesões cerebrais graves. Isso é evidenciado pelo fato de que a pneumonia é uma das principais causas de mortalidade em pacientes que sofreram de AVC isquêmico. O objetivo deste protocolo é descrever o uso de análises citométricas de fluxo multicolorido para identificar 13 tipos de células imunes nos pulmões de camundongos, incluindo macrófagos alveolares, macrófagos intersticiciais, células dendríticas CD103+ ou CD11b+ (DCs), DCs plasmacitoides, eosinófilos, monocitos/células derivadas de monocitos, neutrófilos, células T e B derivadas de linfoides, células NK e NKT, após indução de derrame isquêmico por oclusão de artéria cerebral média transitória. Além disso, descrevemos a preparação de homogeneizadores pulmonares utilizando um método de homogeneização de contas, para determinar os níveis de expressão de 13 citocinas diferentes ou quimiocinas simultaneamente por matrizes multiplex de contas acopladas à análise citométrica de fluxo. Este protocolo também pode ser usado para investigar a resposta imune pulmonar em outros ambientes da doença, como doença pulmonar infecciosa ou doença alérgica.

Introdução

Os pulmões são um órgão de barreira, exposto ao ambiente externo e, portanto, estão constantemente recebendo desafios imunológicos, como patógenos e alérgenos¹. A ativação de células imunes residentes no pulmão e a infiltração de células imunes da periferia são necessárias para limpar patógenos do ambiente pulmonar. Além disso, as células imunes residentes no pulmão mantêm a tolerância às bactérias commensais, sugerindo que essas células desempenham um papel no desembaraço do patógeno e na manutenção da homeostase¹. Macrófagos alveolares e intersticiais estão entre as células imunes sentinelas residentes no pulmão que sentem patógenos através de receptores de reconhecimento de padrões e limpam esses patógenos por fagocitose². Células dendríticas residentes no pulmão conectam a resposta imune inata e adaptativa através da apresentação de antígeno³. Além disso, células imunes inatas locais ativadas produzem citocinas e quimioterapias que amplificam a resposta inflamatória e estimulam a infiltração de células imunes como monócitos, neutrófilos e linfócitos nos pulmões¹. O AVC isquêmico mostrou-se modificar a imunidade sistêmica e levar ao aumento da suscetibilidade à infecção pulmonar; no entanto, poucos estudos avaliaram o compartimento pulmonar após o acidente vascular cerebral isquêmico, embora alguns estudos o tenham examinado durante as condições inflamatórias 4,5,6,7,8,9. O objetivo dos métodos descritos aqui é determinar simultaneamente a patologia pulmonar, a composição das células imunes e os níveis de citocina e expressão de quimiocina nos pulmões para avaliar alterações no compartimento pulmonar e avaliar possíveis alterações na resposta imune pulmonar após ataque isquêmico.

Descrito aqui é um protocolo para obter suspensões de células únicas dos pulmões dos camundongos para identificar 13 tipos de células imunes. Este protocolo é baseado na digestão tecidual com colagemnase D sem a necessidade de um dissociador de tecido automatizado. Além disso, desenvolvemos um protocolo para preparar homogeneizadores teciduais que podem ser usados para determinar os níveis de expressão de 13 citocinas diferentes ou quimiocinas usando matrizes de contas multiplex baseadas em cytometria de fluxo. Este protocolo foi usado com sucesso para investigar os efeitos do derrame isquêmico na imunidade pulmonar e também pode ser usado em outros modelos de doenças.

Protocolo

Todos os protocolos e procedimentos realizados foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia Ocidental. Os camundongos foram alojados sob condições específicas sem patógenos no vivarium da Universidade da Virgínia Ocidental.

1. Preparação de soluções

1. Prepare o tampão de perfusão (salina tampão fosfato, PBS). Use aproximadamente duas alíquotas de 10 mL de PBS geladas por mouse.
2. Prepare o tampão médio/FACS da célula pulmonar. O tampão FACS contém PBS suplementado com 1% de soro bovino fetal (FBS). Mantenha o meio frio durante todo o processo de excisão pulmonar e transferência. Prepare aproximadamente 8 mL por amostra de pulmão. Prepare um buffer médio/FACS fresco antes dos experimentos.
3. Prepare o tampão de dissociação para o isolamento de célula única. O buffer contém 1 mg/mL de colagenase D e 200 μg/mL DNase I na solução de sal tampão da Hank (HBSS). Prepare-se fresco da solução de estoque (100 mg/mL colagenase D e 10 mg/mL DNase I) antes dos experimentos. Aproximadamente 6 mL por amostra de pulmão é necessário. Certifique-se de que o buffer atinja a temperatura ambiente antes do uso.
4. Prepare o tampão de homogeneização para homogeneização do tecido pulmonar. O buffer contém PBS e 1x proteinase e coquetel inibidor de fosfatase (estoque = 100x). Prepare-se recentemente antes dos experimentos. Mantenha o tampão frio durante todo o processo de homogeneização. Aproximadamente 200 μL do buffer é suficiente para homogeneizar um único lobo direito dos pulmões.

2. Oclusão da artéria média transitória (tMCAO)

NOTA: Os procedimentos para tMCAO via inserção de monofilamento na artéria cerebral média foram documentados em detalhes anteriormente¹⁰. Nestes experimentos, foram utilizados camundongos C57BL/6J masculinos de 8 a 12 semanas, pesando 25-30 g.

1. Resumindo, subcutâneamente administre 2 mg/kg de meloxicam nos camundongos antes da cirurgia. Anestesiar profundamente os ratos em uma câmara de indução usando 5% de isoflurane. Confirme a anestesia profunda usando o método de aperto do dedo do dedo do dedo. Mantenha a anestesia com isoflurano de 1 a 2% durante a cirurgia usando um cone no nariz. Mantenha a temperatura corporal em 36,5 - 38 °C durante todo o procedimento, colocando um cobertor quente sob os ratos. Todas as ferramentas cirúrgicas devem ser esterilizadas automaticamente um dia antes da cirurgia.
2. Raspe e prepare a pele no pescoço ventral usando 70% de etanol seguido de esfoliante de clorexidina. Administrously administrou 2 mg/kg de bupivacaína sobre a área de incisão antes de fazer a primeira incisão. Use pomada para cobrir os olhos para evitar o ressecamento. Faça uma incisão no pescoço. Puxe suavemente os tecidos moles ao redor da traqueia.
3. Identifique a artéria carótida comum esquerda e a artéria carótida externa.
4. Aplique uma sutura temporária (tamanho 6/0) na artéria carótida comum para conter o fluxo do sangue. Faça uma incisão na artéria carótida externa.
5. Insira um monofilamento revestido de borracha de silicone (tamanho 6-0) na artéria carótida externa e, em seguida, avance o monofilamento para a artéria cerebral média. Deixe o monofilamento na artéria cerebral média por 60 minutos (oclusão).
6. Monitore a taxa de fluxo sanguíneo usando laser Doppler Flowmetry. Uma redução da vazão para a artéria cerebral média que é > 80% indica uma oclusão bem sucedida.
7. Após os 60 minutos de oclusão, remova o monofilamento para permitir que a reperfusão ocorra. Feche a incisão.
8. Em camundongos operados por farsa, realize as etapas 2.1-2.6 sem a inserção do monofilamento. Nestes camundongos, a taxa de fluxo sanguíneo deve permanecer estável durante todo o procedimento.
9. Monitore os camundongos diariamente e meça os déficits neurológicos usando critérios de pontuação padrão¹¹. 0 – sem déficit neurológico; 1 – retrai a prenéus contralateral quando levantada pela cauda; 2- círculos para o contralateral quando levantados pela cauda; 3- cair para o contralateral enquanto caminhava; 4 – não anda espontaneamente ou está em coma; 5 – morto.
10. Fornecer injeções subcutâneas de soro fisiológico normal e analgésico (meloxicam, 2 mg/kg) a cada 24 horas durante 3 dias após a cirurgia.
11. Isole os pulmões 24 e 72 h após a tMCAO para a análise a jusante.

3. Colhendo os tecidos pulmonares

1. Anestesia profundamente o camundongo por injeção intraperitoneal (i.p.) de 100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina. Confirme a anestesia profunda usando o método de aperto do dedo do dedo do dedo.
2. Para realizar toda a perfusão transcárdia^{do corpo 12}, fixe o rato na plataforma cirúrgica e pele molhada com 70% de etanol para reduzir a distribuição de peles na cavidade corporal. Use uma tesoura de dissecção fina para fazer uma incisão transversal no abdômen caudal e, em seguida, uma incisão midline do peritônio, parando na cavidade torácica antes de perfurar o diafragma.
   1. Não corte o músculo/se esconda na cavidade peritoneal e não continue a incisão após o abdômen.
3. Pare a incisão assim que a cavidade torácica for alcançada antes de perfurar o diafragma. Tome cuidado para não danificar o coração e os pulmões que podem comprometer a qualidade da perfusão ou a recuperação celular
4. O uso de uma tesoura de dissecção fina faz uma incisão midline do peritônio parar na cavidade torácica antes de perfurar o diafragma.
5. Segure o rato pela extremidade distal do esterno usando fórceps e levante para cima enquanto corta o diafragma sendo certo para não danificar o coração, pulmões ou vasculatura. Uma vez que os órgãos são visíveis faça uma incisão através da caixa torácica e separe e fixe a caixa da costela para que o coração e os pulmões sejam totalmente expostos.
6. Faça cuidadosamente uma pequena incisão no átrio direito perto do arco aórtico. Isso servirá como saída para a perfusão.
7. Imediatamente depois, insira suavemente uma agulha de 25 G x 5/8 presa a uma seringa cheia de 10 mL de PBS frio na superfície superior distal do ventrículo esquerdo. Use cuidado para não inserir através do septo ventricular no ventrículo direito. A agulha mal deve ser inserida no ventrículo esquerdo.
   NOTA: Se o septo ventricular for perfurado, o fluido sairá correndo do nariz do rato. Isso diminuirá a qualidade da perfusão e resultará em perda celular.
8. Se desejar, um grampo pode ser usado para segurar a agulha firmemente no lugar no ventrículo esquerdo durante a perfusão.
9. De forma constante, mas suavemente, empurre 10 mL de PBS frio para o coração. O tecido do rato deve começar a perusumar e limpar o sangue à medida que o fluido sai do átrio direito.
   1. Empurre uma segunda alíquota de 10 mL de PBS até que tenha ocorrido uma liberação sanguínea suficiente. O fígado terá uma aparência marrom clara e os pulmões passarão de um rosa avermelhado para a cor mais branca.
10. Usando fórceps e tesouras de dissecção fina, remova cuidadosamente todos os tecidos circundantes, incluindo o coração, traqueia, esôfago, timo, tecido conjuntivo, linfonodos e brônquios grandes.
11. Separe os lóbulos pulmonares individuais e coloque os lóbulos em uma placa de Petri no gelo contendo uma alíquota de 1-2 mL de meio de célula pulmonar fria.

4. Homogeneização do tecido pulmonar para matrizes de contas multiplex usando homogeneizador de contas

1. Pré-esfrie um tubo de tampa cônica de 2 mL contendo 3 contas estéreis de 2,3 mm de zircônia/sílica. Adicione 200 μL de tampão de homogeneização a frio ao tubo.
2. Pesar o lóbulo, transferir o lobo para o tubo cônico pré-refrigerado contendo as contas e o tampão de homogeneização.
   NOTA: Aproximadamente 50-100 mgs de tecido homogeneizado em 200 μL de tampão serão suficientes para detectar citocinas e expressão de quimiocina na amostra.
   1. Homogeneize o lobo usando um homogeneizador à base de contas (ver Tabela de Materiais) a 4.000 rpm por 2 min.
   2. Certifique-se de que o tecido está completamente homogeneizado. Aumente o tempo, se necessário.
3. Após a homogeneização, centrifugar o tubo em uma micro centrífuga pré-refrigerada (4 °C) a 15.870 x g por 3 min.
4. Transfira os supernantes para um microtubo pré-refrigerado de 1,5 mL.
5. Coloque a amostra diretamente no gelo para uso imediato ou armazene a amostra a -80 °C para uso futuro. Evite vários ciclos de congelamento.

5. Dissociação do tecido pulmonar e isolamento de células únicas

1. Despeje o meio da célula pulmonar fora dos lóbulos pulmonares restantes para evitar a diluição do tampão de dissociação. Em seguida, insira cuidadosamente uma seringa de 1 mL com agulha 25G e 5/8 contendo 1 mL do tampão de dissociação no tecido pulmonar.
2. Injete pequenas frações (aproximadamente 1^{/4 a} 1/5⁾ do tampão de dissociação em cada lobo pulmonar e infle suavemente.
   NOTA: A maior parte do buffer sairá logo após inflar, pois o lobo foi extirpado.
3. Repita a injeção de tampão de dissociação 1-2x.
4. Incubar os lóbulos pulmonares com tampão de dissociação por 2 minutos à temperatura ambiente.
5. Pique finamente os lóbulos pulmonares em pequenos pedaços usando uma tesoura de dissecção fina.
6. Transfira as peças pulmonares picadas com o tampão de dissociação para um tubo centrífuga de 15 mL.  Suplementar com tampão de dissociação adicional para um total de 6 mL. Vórtice vigorosamente por 1 min.
7. Incubar a amostra por 45 min a 37 °C. Vórtice vigorosamente a cada 7-8 minutos.
8. Após 45 minutos de incubação, vórtice a amostra vigorosamente por 1 min para resultados ideais.
9. Dissocia ainda mais a amostra passando por um coador de células de 100 μm para remover tecido conjuntivo residual, indesejado e intersticial.
10. Centrifugar a amostra por 10 min a 380 x g, descarte o supernaspe.
11. Adicione 5 mL de meio de célula pulmonar fria à amostra. Resuspend a pelota celular com vórtice suave.
12. Centrifugar a amostra por 10 min a 380 x g, descarte o supernaspe.
13. Adicione 1 mL de meio de célula pulmonar fria. Resuspend a pelota celular com vórtice suave.
14. Passe por um coador de células de 100 μm e conte células.

6. Análise citométrica de fluxo para o nicho de células imunes pulmonares

1. Semente 1-2 x 10⁶ células/anticorpos definidos em uma placa inferior bem redonda de 96 (3 conjuntos no total). Centrifugar as células por 3 min a 830 x g. Descarte supernantes.
2. Resuspenja a pelota de célula em 50 μL de PBS frio contendo mancha viva/morta fixa. Prepare a mancha de acordo com as instruções do fabricante.
3. Incubar as células a 4 °C por 20 min protegidas da luz. Centrifugar as células por 3 min a 830 x g. Descarte supernantes.
4. Resuspenha a pelota celular com 25 μL de tampão FACS frio contendo 5 μg/mL de anticorpo cd16/32 anti-rato. Incubar a 4 °C por 10-15 min.
5. Adicione 25 μL de tampão FACS frio contendo combinações de anticorpos listados na Tabela 1 às células. Misture por pipetação suave.
   NOTA: O volume total do tampão FACS para a coloração do anticorpo é de 50 μL. Portanto, ao preparar uma mistura mestre de anticorpos em 25 μL, a concentração de anticorpos deve ser o dobro da concentração final.
6. Incubar as células a 4 °C por 20 min protegidas da luz. Centrifugar as células por 3 min a 830 x g. Descarte supernantes.
7. Resuspenda as células com 100 μL de tampão FACS frio. Centrifugar as células por 3 min a 830 x g. Descarte supernantes.
8. Resuspenda as células com 100 μL de tampão FACS frio. Transfira para um tubo de 5 mL FACS de fundo redondo de poliestireno contendo 150 μL de buffer adicional de FACs. Analise a amostra imediatamente usando um citômetro de fluxo.
   NOTA: A fixação celular usando as seguintes etapas permite que as amostras sejam analisadas posteriormente.
9. Seguindo o passo 6.7., resuspenque a amostra com 100 μL de 1% de paraformaldeído na PBS.
10. Incubar a amostra a 4 °C por 15 min protegido da luz. Centrifugar as células por 3 min a 830 x g. Descarte supernantes.
11. Resuspenda as células com 100 μL de tampão FACS frio. Centrifugar as células por 3 min a 830 x g. Descarte supernantes.
12. Resuspenda as células com 100 μL de tampão FACS frio. Armazene as células a 4 °C, protegidas contra a luz. Analise a amostra dentro de 72 h.

7. Matrizes de contas multiplex para citocina e detecção de quimiocina

NOTA: Os painéis de quimiocina proinflamatória disponíveis comercialmente e os painéis multiplex de inflamação (ver Tabela de Materiais) foram utilizados para determinar a expressão de quimiocinas e citocinas nos pulmões após a indução de tMCAO de acordo com o protocolo do fabricante, que foi descrito no detalhe¹³.

1. Em suma, descongele os analitos no gelo se forem armazenados a -80 °C após a homogeneização do tecido. Centrifugar a amostra a 590 x g por 2 min a 4 °C antes de usar para remover qualquer tecido residual.
2. Gere uma curva padrão diluindo serialmente o coquetel padrão (C7) que está em uma concentração conhecida de 10 ng/mL em 7 padrões (C1-6) com o último padrão sendo tampão de ensaio sozinho (C0).
3. Uma vez que todos os reagentes tenham aquecido à temperatura ambiente, adicione 25 μL de cada padrão e 25 μL de tampão de ensaio a uma placa de poço V inferior 96.
4. Para cada amostra bem, adicione 25 μL de homogeneizar pulmonar (analito) e 25 μL de tampão de ensaio a uma placa de poço fundo V 96
5. Vórtice as contas pré-revestidas vigorosamente, em seguida, adicionar 25 μL de contas pré-revestidas a cada um dos poços padrão e amostra.
6. Sele a placa e proteja da luz cobrindo com papel alumínio. Agite a placa a 110 rpm por 2h em temperatura ambiente.
7. Centrifugar a 230 x g por 5 min. Adicione 200 μL de tampão de lavagem em 1x (a solução de estoque é de 20x, diluída a 1x com água). Incubar por 1 min.
8. Centrifugar a 230 x g por 5 min. Resuspenda o padrão e a amostra com anticorpos de detecção de 25 μL.
9. Veda e cubra a placa para proteger da luz. Agitar a placa a 110 rpm por 1h em temperatura ambiente.
10. Adicione 25 μL de streptavidin-phycoerythrin (SA-PE) a cada padrão e prove bem.
11. Veda e cubra a placa para proteger da luz. Agite a 110 rpm por 30 min à temperatura ambiente.
12. Gire a placa a 230 x g por 5 min. Resuspenda o padrão e as amostras em 1x tampão de lavagem.
13. Transfira para um tubo de lavagem de poliestireno bem rotulado de 5 mL FACS contendo um adicional de 150 μL de tampão de lavagem 1x.
14. Determine a intensidade de fluorescência do sinal PE para os padrões e amostras usando um citômetro de fluxo.
15. Construa uma curva padrão para cada quimiocina e citocina usando a intensidade média de fluorescência (IMC) de PE contra as concentrações pré-determinadas.
16. Determine a concentração de cada quimiocina e citocina usando a curva padrão e o MFI de cada amostra. O painel multiplex fornece software de análise de dados que pode ser usado para determinar a concentração de cada analito. O peso do lobo apical/superior é usado para determinar a concentração de citocinas ou quimiocinas por miligrama de tecido.

Resultados

Recentemente, relatamos que a indução de derrame isquêmico em camundongos altera a composição celular imune dos pulmões¹¹. Especificamente, isquemia cerebral transitória aumentou percentuais de macrófagos alveolares, neutrófilos e DCs CD11b+, enquanto diminuiu percentuais de células T CD4+, células T CD8+, células B, células NK e eosinófilos no compartimento pulmonar. Além disso, a alteração celular correspondeu a níveis significativamente reduzidos de quimiocinas múltiplas nos ...

Discussão

Os protocolos aqui descritos permitem a identificação de tipos de células imunes pulmonares e a expressão de quimiocinas ou citocinas no mesmo rato. Se um estudo de histopatologia for desejado, um lobo individual pode ser removido e fixado para esse fim antes de prosseguir para as etapas de isolamento de célula única. Uma limitação deste método é que essa abordagem pode não ser adequada em alguns cenários da doença se a mudança na composição das células imunes e a expressão de quimiocinas e/ou citocinas...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
B220-APC, clone RA3-6B2	Biolegend	103212	1:200 dilution
Beadbug 3 position bead homogenizer	Benchmark Scientific	D1030	Tissue homogenizer
CCR2-BV421, clone SA203G11	Biolegend	150605	1:200 dilution
CD103-BV421, clone 2E7	Biolegend	121422	1:200 dilution
CD11b-PE/Cy7, clone M1/70	Biolegend	101216	1:400 dilution
CD11c-PE/Cy7, clone N418	Biolegend	117318	1:200 dilution
CD11c-Percp/Cy5.5, clone N418	Biolegend	117328	1:200 dilution
CD4-BV421, clone GK1.5	Biolegend	100443	1:200 dilution
CD45-FITC, clone 30-F11	Biolegend	103108	1:200 dilution
CD64-APC, clone X54-5/7.1	Biolegend	139306	1:200 dilution
CD8-PE, clone 53-6.7	Biolegend	100708	1:800 dilution
Collagenase D	Sigma Aldrich	11088882001	Component in the dissociation buffer
Conical screw cap tube	ThermoFisher	02-681-344	Tube for tissue homogenization
DNase I	Sigma Aldrich	10104159001	Component in the dissociation buffer
Fc block CD16/32 antibody	Biolegend	101320	1:100 dilution
genlteMACS dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	Comparsion of lung digestion with or without mechanical dissociator
gentleMACS C tubes	Miltenyi Biotec	130-093-237	Tube for tissue disscoiation with genlteMACS dissociator
Halt protease and phosphatase inhibitor cocktial	ThermoFisher	78442	Component in the homogenization buffer
Laser doppler monitor	Moor	MOORVMS-LDF	Blood flow monitoring during tMCAO
LEGENDplex proinflammatory chemokine panel	Biolegend	740451	Multiplex bead array
LIVE/DEAD fixable near-IR stain	ThermoFisher	L34976	Use for dead cell exclusion during flow cytometric analysis
Ly6C-PE, clone HK1.4	Biolegend	128008	1:800 dilution
Ly6G-BV510, clone 1A8	Biolegend	127633	1:200 dilution
MCAO suture L56 reusable 6-0 medium	Doccol	602356PK10Re	tMCAO
MHC II-BV510, clone M5/114.15.2	Biolegend	107636	1:800 dilution
NK1.1-Percp/Cy5.5, clone PK136	Biolegend	108728	1:200 dilution
Siglec F-PE, clone E50-2440	BD Biosciences	552126	1:200 dilution
Silk suture thread, size 6/0	Fine Science Tools	18020-60	tMCAO
SomnoSuite anesthesia system	Kent Scientific	SS-01	Mouse anaesthetization for tMCAO
TCRb-BV510, clone H57-897	Biolegend	109234	1:200 dilution
Zirconia/silica beads, 2.3 mm	Biospec	11079125z	Beads for tissue homogenization