洗浄剤と酵素を含まない方法を用いた組織全体からの核分離

要約

単核単離は、細胞膜の解離および洗剤ベースの透過性、最適化を必要とし、技術的なアーティファクトを導入する傾向があるステップに依存しています。我々は、単核RNA-seq(snRNA-Seq)またはATAC-seqに適した核を得て、組織全体から直接無傷核を迅速に単離するための洗浄剤および酵素フリープロトコルを実証する。

要約

ハイスループットのトランスクリプトームおよびエピゲノムプロファイリングには、単一細胞または単一核懸濁液の調製が必要です。無傷の細胞または核を有する懸濁液の調製は、解離および透過性、望ましくない騒音および望ましくない損傷を引き起こす可能性のあるステップを伴う。特に、ニューロンなどの特定の細胞タイプは、個々の細胞への解き分けに挑戦しています。さらに、核を放出する細胞膜の透過性は試行錯誤による最適化を必要とし、時間がかかり、労働集約的で財政的に不可能である。ハイスループットシーケンシング用のサンプル調製の堅牢性と再現性を高めるために、迅速な酵素および洗浄剤を含まないカラムベースの核単離法について説明します。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの脳全体から20分以内に核を効率的に分離することができます。単離核は、無傷の核形態と凝集する傾向が低い。さらに、フローサイトメトリーは、下流の適用のための細胞デブリの核濃縮およびクリアランスを可能にする。このプロトコルは、軟組織および培養細胞で動作する必要があり、高スループットプロファイリングに使用できるサンプル調製のための簡単でアクセス可能な方法を提供し、単核RNA-seqおよびATAC-seq実験を成功させるために必要なステップを簡素化します。

概要

単細胞RNA-セク(scRNA-Seq)およびATAC-seqは、単一細胞分解能で複雑な生物学的システムを研究するための汎用性の高いツールです。これらは、細胞のサブタイプおよび状態、遺伝子ネットワークを定義し、細胞の不均一性を評価するために広く利用されています。scRNA-seqを行うための前提条件は、組織解離による単一細胞懸濁液の調製である。細胞外マトリックス組成および機械的特性のばらつきにより、個々の組織は単一細胞懸濁液の調製のための解離プロトコルの最適化を必要とする。

組織を単一細胞に解離することは典型的に、コラゲターゼ、ディスパーゼまたはトリプシンを含む消化酵素を37°C1、2、3、4で処理することを含^1,2,3,む。転写機械は37°Cで活性を保つため、酵素解離はmRNA発現アーチファクトとノイズ^5,6,6を導入する可能性がある。特に、長時間のインキュベーションは、ストレス応答性遺伝子と熱ショック応答を不均一な方法で誘導し、実験7における技術的な変動をもたらす^。

単一の細胞懸濁液を生成するもう一つの欠点は、複雑な形態を有する生存可能かつ無傷の細胞型を得るのが難しい点である。特に、ニューロン、アディポサイト、およびポドサイトは^{、8、9、10、119,10,11}を分離するのに挑戦しています。⁸例えば、Wuたちは、成人マウス腎臓¹²からのscRNAプロファイルにおける糸球体ポドサイトの欠如を実証した。^,脳組織⁸8,13,14からの相互接続ニューロンの回復に関して同様の非最適な観測がなされている。^,1314要するに、解離プロトコルは、細胞タイプの解離が容易に向けて検出バイアスを導入し、器官の細胞アーキテクチャの虚偽表示につながる可能性がある。

scRNA-Seq.でサンプル調製中に導入された技術的なノイズとバイアスを克服するために、核の単離およびプロファイリングは魅力的な代替手段を提供する。核形態は異なる細胞タイプ間で類似しているので、核の単離は、複雑な形態を有する無傷で生存可能な細胞を単離する問題を回避する。例えば、Wuたちは、scRNA-Seq¹²から欠けていた成体マウス腎臓の単核RNA-Seq.(snRNA-Seq.)を有する糸球体ポドサイトのプロファイリングに成功したことを実証した。興味深いことに、単一細胞と単核RNA-seqの比較研究は、snRNA-Seq¹²を用いたストレスおよび熱ショック応答遺伝子の誘導の減少を示唆している。この研究は、この2つの方法で検出された遺伝子間の高い相関関係をさらに示唆している。しかし、ヒトミクログリアに関する最近の研究では、アルツハイマー病¹⁵における遺伝的活性化を検出できなかった。したがって、特定の文脈において、snRNA-SeqはscRNA-Seq^16、17,17に適した代替手段である。さらに、核分離は単一細胞ATAC-Seq.に利用することができ、個々の細胞内のオープンクロマチンの領域に関する情報を提供する。

核単離のためのプロトコルは、3つの主要なステップを伴う:i)核を放出する細胞膜の洗浄剤ベースのリシス;ii) Dounceホモジナイザーを使用した組織均質化;iii)凝縮またはフローサイト^,メトリー^,18、19、20、21、22を使用して細胞^18,19デブリの核および除去の濃縮。^21,2220この中で、最初の2つのステップは組織タイプに依存し、経験的に最適化する必要があります。中性洗剤は、細胞膜の部分的な破裂と組織²³からの核の非効率的な検索をもたらす。一方、高レベルの洗剤と粗均質化は、核膜の破裂とその損失^24、25,を招^く。破裂した核はさらに凝集して凝集体を形成する傾向があり、除去しなければ下流プロファイリング実験でアーティファクトを引き起こす可能性があります。

核単離用の洗浄剤最適化に関する問題を回避するために、洗剤を含まないスピンカラムベースの方法を用いて、新鮮なサンプルから無傷の核を分離するプロトコルを導入します。このプロトコルは、20分以内に全器官から核を生成し、実際の転写の誘導を制限する。単核RNA-Seq.およびATAC-seqのためのFACSとの単一核の濃縮が可能であり、堅牢で再現可能なハイスループットプロファイリングを可能にする、シンプルで普遍的な方法を提供する。

プロトコル

以下に示す手順はすべて、機関(Libre de Bruxelles大学(ULB))および国家の倫理的および動物福祉ガイドラインおよび規制に従って行われ、ブリュッセル大学(プロトコル578N-579N)から動物福祉倫理委員会(CEBEA)によって承認されました。

1. 組織解剖前の準備

1. ゼブラフィッシュを安楽死させるPBSで0.2%トリケーヌ溶液を調製する。氷の上で溶液を冷やします。
2. ティッシュを刻む30mmのペトリ皿を準備する。
3. 氷冷1x PBS(組織サンプルあたり10 mL)を準備します。
4. 遠心分離機を4°Cに冷却します。
5. 核分離の場合は、洗剤を含まない核分離キット(資料表)を使用してください。
6. プロトコルを開始する前に、キットに提供されるプレチルバッファAおよびBは、核単離前に少なくとも30分間氷の上に置くことによって提供される。
7. 単離された核を処理するために、チューブやピペットチップなどのプラスチック試薬を5%BSA溶液でコーティングします。このために、40 mLのPBSに2gのBSAを溶解して溶液を調製する。5%BSAでプラスチックアイテムをコーティングすると、プラスチックに付着する核を減少させます。このステップは、単離された核の回復を強化する。
8. 5%BSA溶液を2〜3回ピペットしてピペットチップをコーティングします。チップを2時間エアドライします。サンプルごとに10個のプラスチックチップを用意します。
9. 5%BSAでそれらを充填することにより、核の収集のためのチューブをコーティングします。チューブを3回反転して、効率的なコーティングを確保します。溶液を取り除き、きれいなティッシュペーパーの上でチューブを逆さまに2時間空気乾燥させます。サンプルごとに、キットに用意されている1つのコレクションチューブをコーティングします。さらに、FACS後の核採取用にコーティングされた1.5 mLチューブを用意します。
   注:ガラスの先端は固着を最小限に抑えるためにプラスチックピペットの先端に代わるものを強く推奨します。

2. ゼブラフィッシュ脳の解剖

1. ゼブラフィッシュを安楽死させるには、25 mLの氷冷トリケーヌ溶液で90mmのペトリ皿を準備します。
2. 慎重に、漁網を使用してタンクからゼブラフィッシュを取り出し、ペトリ皿に入れます。
3. 魚を5分間トリケーヌに残して安楽死させる。
4. 鋭いカミソリの刃で動物の首を切る。
5. 鉗子を使用して、頭蓋骨をそっと壊し、頭蓋骨の腹側と後側から柔らかい組織、皮膚および骨を取り除く。
6. やさしく、氷冷PBSを含む新鮮な30ミリメートル皿に脳を移します。
7. スピン列のサンプルの読み込みを容易にするためにカミソリの刃を使用して脳を小片にミンチします。

3. 単核単離

1. 核分離キットに用意されているフィルターカートリッジにひき肉組織を移し、200 μLのコールドバッファーAを加えて組織を感作します。キットが提供するプラスチックロッドを2分間使用して組織を研削します。
2. 300 μL のコールドバッファー A を加え、キャップを 10 分間開いた状態で氷の上にフィルターカートリッジをインキュベートします。
3. カートリッジをキャップし、チューブを5回反転させて組織を再中断します。
4. 遠心分離機は16,000 x gで30s。この工程では、フィルターを通過すると細胞が破裂し、高速遠心力が加えられます。流れには無傷の核が含まれており、チューブの底にペレットが含まれています。
5. フィルターを捨てて、10sの間激しく渦を流してペレットを再中断する。
6. 溶液を500xgで3分間遠心してペレットをペレットにgする。
7. ペレットを0.8 mLのコールドバッファーBと遠心分離機で600 x gで10分間再懸濁します。この工程では、核は膜の破片から分離される。得られた無色ペレットは、単離された核を含む。
8. 5%BSAで500μLのPBSで単離された核を再懸濁する。核懸濁液を氷上に保管し、定量後にFACSを実行します。

4. 核形態の可視化

1. Hoechst染色による核形態を確認する。このために、BSAコーティングされた先端を使用して新しいチューブに100 μLの単核懸濁液を取り除きます。核を染色するには、0.1 μLのHoechst (1 mg/mL)を加えます。チューブを穏やかに渦にかします。
2. 核懸濁液をガラス底皿に移してイメージングします。
3. レーザー励起設定が~405 nm(バイオレット)波長の蛍光顕微鏡を使用して核を画像化します。

5. 核のFACSベースの濃縮

1. FACSを実行する前に、40 μmの細胞ストレーナーを使用して核をBSAコーティングチューブにフィルターします。
2. 5%BSAのPBSを最終体積1,000 μLに加えて、濾過した懸濁液を希釈します。
3. 2つの丸い底FACSチューブに「コントロール」と「ステイン」のラベルを付けます。「対照」チューブには染色されていない核が含まれ、「染色された」チューブはHoechst染色された核を有する。
4. BSAコーティングされたピペットチップを使用して、核懸濁液の250 μLを「コントロール」チューブに移します。
5. 残りの750 μL溶液を「染色」とラベル付けされたFACSチューブに移し、1 μLのHoechst色素を加えて核を染色します。スロー渦によって混ぜます。
6. 染色されていないコントロールサンプルをセルソーターにロードします。5000 のイベントを記録します。
7. 染色されたサンプルをロードし、5000 個のイベントを記録します。
8. 単一の核の識別を可能にするFACSゲートを描く。核は、コントロールと染色サンプルとの間でHoechst蛍光シグナルを比較することによって選択することができる。
9. 5%BSAで50 μLのPBSを含む新しい1.5 mLチューブに染色チューブからHoechst陽性核を選別します。
   注: 分離された核は、下流アプリケーションの要件に応じて所望の媒体に収集することができます。

結果

--上述のプロトコルは、ゼブラフィッシュの脳組織から直接単一核懸濁液を生成するために使用された。分離は通常20分を必要とし、洗剤または消化酵素の使用を避ける。図 1では、プロトコルの個々の手順を要約した回路図を示します。

図1:核単離用の洗剤を含まないスピンカラムベースの方法の概略図
新鮮なゼブラフィッシュ脳組織からの核の抽出中に行われた個々のステップのグラフィカルな表現。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

核形態の可視化

核形態の定性的確認のために、単離された核をHoechstで染色し、蛍光顕微鏡を用いて可視化した。核は、そのまま、丸く、よく分離されて現れた(図2)。重要なことに、核膜破裂の兆候である核凝集は存在しなかった。

図2:ゼブラフィッシュ脳からの単核単一分離。
その無傷の形態を示すHoechst染色された核の蛍光顕微鏡画像。スケールバー:10 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

インタクト核のFACSベースの濃縮

単離された核の濃縮および細胞デブリの除去は、Hoechst蛍光シグナルの存在下での測定によるフローサイトメトリーによって行われた。Hoechst信号は、バイオレット、405 nm、レーザー(ブリリアントバイオレット421 - BV421)で励起時に検出されました。未染色核は、バックグラウンド蛍光を示した(図3A、補足図1A)、染色された核が強い蛍光シグナルを示している間(図3B、補足図1B)。図3Cに示すように、未染色およびホークスト染色された核は、紫色チャネルに十分に分離されていた。

図3:単離された核は、フローサイトメトリーにおいて強く特異的なHoechst蛍光シグナルを表示する。
1つの核懸濁液のためのヒストグラムプロットは、Hoechst染色の分布を表示する。Hoechstはバイオレット、405 nm、レーザー(ブリリアントバイオレット421 - BV421)によって興奮しています。染色されていないサンプル(A)は10^0-103の範囲の信号を表示し、一方、Hoechst染色された核(B)は10^3-105の範囲で信号を放出する。染色されていない(灰色)および染色された(青色)サンプル(C)によって放出される蛍光強度のオーバーレイは、2つの集団間の明確な分離を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:単離核のフローサイトメトリー測定戦略単離核懸濁液の代表的な流れプロット。分離核は、405nmでHoechstを励起する前方散乱およびバイオレットレーザーBV421を用いて分析した。未染色サンプル(A)は、10 0-103の範囲で⁰BV421信号を表示した。³13130件のイベントのうち、141のイベントがFSC-A(全体の1.07%)に基づく単一核として検出され、BV421信号に基づく不染色核に対する0事象(全体の0%)が検出されました。このHoechst染色原子核(B)は、103-105範囲でBV421⁵信号を表示した。³50000件のイベントのうち、FSC-A(全体の4.84%)に基づく単一核として2418件のイベントが検出され、BV421信号に基づくHoechst陽性核の2414件(全体の4.83%)が検出されました。こちらをダウンロードしてください。

ディスカッション

単一細胞分解能でトランスクリプトームとエピゲノムをプロファイリングすると、生物学的システムの研究に革命が起こった。固体組織に対する単一細胞の分解能の研究は、個々の細胞または核への器官の解離に依存する。解離は、技術的なアーティファクトを導入することができる破壊的な手順であり、システム^55、66の正確な表現の開発を妨げる可能性があります。例えば、酵素解離は、ニューロンやポドサイトなどの複雑な形態を有する細胞に害を及ぼし、ストレスおよび熱ショック応答遺伝子^77,1212の発現を誘発する可能性がある。さらに、解離中の洗剤の使用は、核膜を破裂させ、凝集^23、25,25を導くことができる。したがって、最高品質の単一の細胞または核懸濁液を得るために解離を最適化することが、ハイスループットプロファイリング実験の成功にとって最も重要である。

ここでは、ゼブラフィッシュの脳から20分以内に無傷の核を抽出できる洗剤と酵素を含まない核分離法を実証する。プロトコルは、典型的な形態と堅牢な完全性を有する核を生成する(図2)。6mgの重さの単一のゼブラフィッシュ脳から、プロトコルは、ヘモサイトメーター数によって決定される合計60,000核を生成します。単離された核は、snRNA-seq、ATAC-seqおよび免疫染色を含む複数の下流の適用のために利用することができる。単離された核には、細胞質画分からの交差汚染、特に小胞体およびミトコンドリアの成分からの交差汚染が含まれ得る。ハイスループットプロファイリング実験では、細胞デブリ、特にミトコンドリアのクリアランスが強く推奨されます。フローサイトメトリー(図3)は、核の精製のための実行可能な選択肢を提供する。あるいは、スクロース勾配は、破片の除去のために利用することもできる。

このプロトコルは、マウス甲状腺(データは示されていない)でテストされており、ゼブラフィッシュの脳組織に似た結果を提供します。全体的に見て、このプロトコルは、単一核懸濁液の調製のための堅牢で再現性のある普遍的な方法を提供し、ハイスループットプロファイリング実験のための物流を簡素化するのに役立ちます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Carl Roth	90604-29-8	Albumin fraction V
Cell sorter	BD Biosciences		FACSAria III
Centrifuge	Sartorius	A-14C
Eppendorf tubes (1.5 mL)	Eppendorf	22363204
Falcon (15 mL)	Corning	352096	Polypropylene centrifuge tubes
Falcon (5 mL )	Corning	352052	Polystyrene round bottom test tubes
Fine forceps	Fine Science Tools	11295-10
Flowmi cell strainer (40 μm)	Sigma	BAH136800040
Fluorescence microscope	Leica	DMI6000 B
Glass bottle (250 mL)	VWR	215-1593
Glass bottomed dish	World Precision Instruments	FD3510-100	Fluorodish 35 mm
Glass Pasteur pipettes	VWR	612-1701
Glass pipette socket	Carl Roth	388.1	Pipetting aid pi-pump 2500
Hoechst staining dye solution	Abcam	ab228551	Hoechst 33342
Minute Detergent-Free Nuclei Isolation Kit	Invent Biotechnologies	NI-024
PBS (10X)	ThermoFisher	70011069
Petri dish (30 mm)	FisherScientific	11333704	Pyrex
Petri dish (90 mm)	Corning	758-10178-CS	Gosselin
Pipette tips	VWR	89079	10 μL, 200 μL, 1000 μL
Pipettes	Gilson	F167380	Pipetman
Razor blade	Swann-Morton	7981809
Tricaine methane sulfonate	Sigma	E10521
Vortex machine	Scientific Industries	SI-0236	Vortex-Genie 2