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要約

ここに提示されるホスホプロテオミクスアプローチ、すなわち、シロイヌモゼスホスファプロテオームのハイスループットと深いカバレッジを提供するリンポプロテオミクスに基づく抽出チップを停止して行く。このアプローチは、シロイヌナズナの浸透性ストレスシグナル伝達の概要を示す。

要約

タンパク質リン酸化は、浸透状態下での酵素活性と遺伝子発現の調節に不可欠です。質量分析法(MS)ベースのホスホプロテオミクスは、植物シグナル伝達の研究方法を変えました。しかし、カバレッジの深さを達成するための多くの出発材料と長期のMS測定時間の要件は、植物の世界的なホスホプロテオミクス変化のハイスループット研究の制限要因となっています。植物ホスホプロテオミクスの感度とスループットを向上させるために、浸透応力に応答して植物リン酸化摂動の迅速かつ包括的な分析のためのタンデムマスタグ(TMT)標識と相まって、ストップアンドゴー抽出(ステージ)チップベースのホスホプロテオミクスアプローチを開発しました。ステージチップ技術のシンプルさと高スループットを活用して、全体の手順は、リンペプチド濃縮、分画、およびサンプルクリーニングステップを完了するために2つのヒントを使用して約1時間を要し、アプローチの使いやすく、高い効率を示唆しています。このアプローチは、植物のリンプロテオミクス分析(>11,000リンペプチド同定)を提供するだけでなく、隣接する分画間の優れた分離効率(<5%のオーバーラップ)を示します。また、TMT標識を用いて多重化が行われ、野生型および snrk2 デクプル変異型植物のホスホプロテオミクス変化を定量化した。このアプローチは、陸上植物における初期の浸透シグナル伝達の理解に光を当てる浸透性ストレスに応答して、Raf様キナーゼのリン酸化事象を明らかにするためにうまく使用されている。

概要

高いサリン性、低温、干ばつは浸透応力を引き起こし、これは植物の生産性1,2に影響を与える主要な環境要因である。タンパク質リン酸化は、浸透ストレス3、4、5に対する植物応答におけるシグナル知覚および伝達を媒介する最も重要な翻訳後修飾の1つである。SNF1関連プロテインキナーゼ2s(SnRK2s)は、浸透性ストレスシグナル伝達6に関与している。SnRK2ファミリーの10人のメンバーのうち9人は、浸透性ストレス7、8に応答して有意な活性化を示す。snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 10デクサプル(snrk2-dec)全10個のSnRK2に変異を有する変異体は、浸透圧ストレスに対する過敏症を示した。snrk2-dec変異体において、イノシトール1,4,5-トリスリン酸(IP3)の浸透ストレス誘導蓄積、アブシジン酸(ABA)生合成、および遺伝子発現が強く減少し、浸透応力応答におけるSnRK2sの重要な役割を強調する6。しかし、SnRK2sキナーゼがこれらの生物学的プロセスをどのように調節するのかはまだ不明である。浸透性ストレスに応答してホスホプロテオミクスの変化をプロファイリングすることは、このギャップを埋め、植物の浸透性ストレス誘発防御メカニズムを引き出す効率的な方法です。

質量分析法(MS)は植物ホスホプロテオーム9をマッピングするための強力な技術です。しかし、植物ホスホプロテオミクスの特性評価は、植物プロテオームのダイナミックレンジと植物のリセート4の複雑さのために依然として課題である。これらの課題を克服するために、光合成顔料や二次代謝産物などの望ましくない干渉を排除し、植物ホスホプロテオーム10の深い被覆を可能にする普遍的な植物ホスホプロテオミクスワークフローを開発しました。固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)や金属酸化物クロマトグラフィー(MOC)などのいくつかのリンペプチド濃縮方法は、MS分析11、12、13、14、15、16の前にリンペプチドを濃縮するために開発されています。リンペプチドと共に精製する酸性非リンペプチドは、リンペプチド検出のための主要な干渉である。以前は、非リンペプチドの結合を排除するためにIMACローディングバッファーのpH値および有機酸濃度を標準化し、前分画工程11をバイパスして90%以上の濃縮特異性を得た。

リンペプチド濃縮および分画の多段階プロセスにおけるサンプル損失は、リンペプチド同定の感度およびリンタンパク質被覆の深さを妨げる。ストップアンドゴー抽出のヒント(ステージのヒント)は、先端の端部をキャップする小さなディスクを含むピペットチップであり、ペプチド分画および洗浄17のためのクロマトグラフィーと組み込むことができる。段階の先端プロシージャの間のサンプル損失は管間のサンプルの移動を避けることによって最小にすることができる。Ga3+-IMACおよびFe3+-IMACでは、低い多量リン酸化ペプチドを単一リン酸化ペプチドから分離し、ヒトホスホプロテオーム15の深さを改善したステージチップの導入に成功しました。また、高pH逆相(Hp-RP)ステージ先端の使用は、強いカチオン交換(SCX)および強いアニオン交換(SAX)クロマトグラフィー18と比較して、ヒト膜プロテオームの広い範囲を実証している。そのため、IMAC と Hp-RP ステージチップ技術を統合することで、簡単さ、高い特異性、高スループットで植物のホスホプロテオームのカバレッジを向上させることができます。我々は、この戦略が、植物ホスホプロテオーム19の強化された深さを表す、シロイヌナズナの苗から20,000以上のリン酸化部位を同定したことを実証した。

ここでは、 シロイヌナズナ におけるホスホプロテオミクスプロファイリングのためのステージ先端ベースのホスホプロテオミクスプロトコルを報告する。このワークフローは、浸透応力に応答して野生型および snrk2-dec 変異苗のホスホプロテオミクス摂動を研究するために適用された。ホスホプロテオミクス解析では、キナーゼ活性化と初期浸透ストレスシグナル伝達に関与するリン酸化部位が明らかになった。野生型と snrk2-dec 変異型ホスホプロテオームデータの比較分析は、高植物におけるオスモアストレスシグナル伝達において重要な役割を果たすRaf様キナーゼ(RAF)-SnRK2キナーゼカスケードの発見を導いた。

プロトコル

1. サンプル準備

  1. コントロールとストレス処理苗(1 g)をアルミニウム箔で収穫し、液体窒素でサンプルを凍結フラッシュします。
    注:通常、成熟した植物よりも2週齢の苗からより高いタンパク質濃度が観察されます。1グラムの苗木は約10mgのタンパク質ライセートを生成し、MS分析には十分です。すべての遠心段階は、ステップ1で16,000 x g で行われます。
  2. 液体窒素で満たされた乳鉢と害虫を使用して、冷凍苗を細かい粉末に粉砕します。
  3. 10 mM トリス(2-カルボキセチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)、40 mM 2-クロロアセタミド(CAA)、プロテアーゼおよびインヒビターアセクターゼ阻害剤を1mL加えて、乳鉢の中で、100 mMトリス-HCl、pH 8.5)を加えて、乳鉢を混ぜます。
  4. 植物のライゼートを1.5mLチューブに移し、95°Cで5分間加熱します。
  5. チューブを氷の上に10分間置きます。10 sの氷の上にチューブを超音波処理し、10 sのために一時停止し、3回繰り返します。
  6. 20分間チューブを遠心分離し、植物の150 μLを1.5 mLチューブに入れ、
  7. チューブに600μLの100%メタノールを加えます。渦とチューブをスピンダウン。
  8. 100%クロロホルムの150μLをチューブに加えます。渦とチューブをスピンダウン。
  9. 450 μLの ddH2O をチューブに加えます。3分間のボルテックスと遠心分離管。
  10. 上の水層を破棄します。チューブに600μLの100%メタノールを加えます。チューブを3分間遠心し、溶液を捨てます。
  11. 600 μLのメタノールを600 μLで洗浄します。溶液を捨て、空気乾燥してプロテインペレットを乾燥させます。
  12. タンパク質ペレットを600 μLの消化バッファー(12 mM ナトリウムデオキシコール酸ナトリウム(SDC)/12 mM ラウロイルサルコシナートナトリウム(SLS)を 100 mM Tris-HCl、pH 8.5 で再懸濁します。懸濁液が均質化されるまでチューブを超音波処理します。
  13. BCAキットを使用してタンパク質濃度を測定し、消化バッファーで濃度を4 μg/μLに調整します。100 μLのライセート(400 μgタンパク質)を新しいチューブに移します。
  14. 292 μLの50 mMの重炭酸トリエチラムモニウム(TEAB)と8 μLのLys-C(2.5単位/mL)をチューブに加えます。37°Cで3時間インキュベートする。
  15. チューブに8 μgのトリプシンを含む50 mM TEABの100 μLを加えます。37°Cで12時間インキュベートする。
  16. 25 μLの10%トリフルオロ酢酸(TFA)をチューブに加えます。4°Cで20分間、ボルテックスと遠心分離機を使用します。
  17. 上清を、脱塩用のコンディショニングデソルトカラムに移します。真空遠心濃縮器を使用して溶出液を乾燥させます。
    注:メタノール1mLで樹脂を活性化し、その後に0.1%TFAの1mLを80%アセトニトリル(ACN)で活性化します。5%ACNで0.1%TFAの少なくとも3 mLの有機溶媒を洗い流してください。工程1.16で調製した酸性化ペプチドサンプルをカラムにロードし、その後、少なくとも3 mLの0.1%TFAを5%ACNで洗浄した。高塩濃度のサンプルに対して、より多くのせい剤が必要な場合があります。80% ACNで0.1%TFAの1 mLでリンペプチドをエルプ。

2. タンデムマスタグ(TMT)ラベル付け

  1. 乾燥したペプチドを100 μLの200 mM 4-(2-ヒドロキイェチル)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)、pH 8.5に再懸濁します。
  2. 各チャネル(0.8mg)のTMT試薬を40μLの無水ACNに溶解します。5分間のTMT試薬チューブをボルテックスし、それをスピンダウンします。
  3. 40 μLのTMTをサンプルチューブに移し、室温で1時間インキュベートします。
    注:この実験では、チャネル126〜128をマンニトール処理なしで植物の3つの生物学的複製で標識し、チャネル129〜131はマンニトール処理を伴う植物の3つの生物学的複製で標識した。
  4. 5%のヒドロキシルアミンを8μL加え、15分間インキュベートします。
  5. 5 mLチューブに6サンプルを混ぜ、10%TFAの14 μLを加えます。
  6. チューブに0.1%TFAの3,876 μLを加えます。渦とスピンダウン。
  7. 溶液を、脱塩用のコンディショニング脱塩カラムに移します。エマルエーターを使用して溶出物を乾燥させます。

3. IMAC ステージチップの作成

  1. ポリプロピレンフリットディスクを貫通するために16G鈍エンドの針を使用してください。
    注: ディスクの表面に対してカッターを垂直に保持し、カッターを数回ロールして、ディスクが完全に切除されていることを確認します。保管のためにペトリ皿にディスクを置きます。針を200μLのピペットチップに入れ、プランジャーを使用してフリットを先端に押し込みます。
  2. プランジャーを使用して先端にそっとフリットを押し込み、先端の端をキャップします。
    1. 同じ圧力でフリットディスクをチップに入れ、再現性を向上させます。ステージチップの再現性は、遠心分離機のタイミングと技術的な複製の再現性に影響を与える一定の背圧にとって重要です。
    2. ステージのヒントがコンディショニングステップ中に高い背圧を示す場合は、サンプルをロードする際にチップが詰まらないようにチップを捨てます。ディスクが強く押し込みすぎて位置に収められている可能性があります。
  3. Ni-NTAスピンカラムを反転し、1.5 mLチューブに配置します。
  4. プランジャーを使用してNi-NTAビーズのフリットを軽く押し、ビーズをチューブに押し込みます。
    注:スピンカラムでビードの損失や吸着を防ぐために、フリットを軽く押してください。

4. Hp-RP ステージチップの準備

  1. C8 ディスクを使用して IMAC ステージチップの説明に従って、Hp-RP ステージチップを準備します。
    注:ディスクに大きな力を加えないでください。すべての遠心段階はステップ4の5分のための1,000 x g で行われる。
  2. 100 μL 100%メタノールに1mgのC18ビーズをサスペンドし、ビーズ溶液をチップに通します。
  3. 20 μLのバッファー 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2、pH10.0) をステージチップに加え、遠心分離によりチップを通過してバッファー 8 を通過します。
  4. ステージ先端にバッファA(200 mM NH4HCO2)の20μLを加え、遠心分離によって先端を通してバッファAを通過します。
    注:使用中に遠心分離機のバランスをとり、Hp-RPステージチップが完全に乾燥していないことを確認してください。

5. スピンアダプターの準備

  1. 1.5 mLチューブの蓋の中央に穴を穿刺するために鋭い端ピンセットを使用してください。
  2. スピンアダプタの穴にIMACステージチップまたはHp-RPステージチップを挿入します。
    メモ:ステージの先端がスピンアダプタの底部に近くないことを確認します。

6. IMAC ステージチップを用いたリンペプチド濃縮

  1. 400 μLのローディングバッファー(6%酢酸(AA)、pH 3.0)を含む 10 mg の Ni-NTA ビーズをサスペンドし、すべてのビーズ溶液をチップごとにロードします。遠心分離によって先端を通して溶液を渡す。
    注:すべての遠心段階のステップはステップ6.8以外のステップ6で3分の200 x g で行われます。
  2. 50 mM エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)の100 μLを負荷し、IMAC ステージチップからニッケルイオンを取り除き、遠心分離によって溶液を先端に通します。
  3. 100 μLの負荷バッファをステージチップにロードし、遠心分離によってチップを通して溶液を渡します。
  4. 50 mM FeCl3 の 100 μL を 6% AA でステージチップにロードし、遠心分離によってチップを通して溶液を通過させます。Fe3+ イオンはIMACステージチップにキレートします。
  5. 100 μLの負荷バッファをロードしてステージチップを調整し、遠心分離によってチップを通して溶液を通過させます。
  6. ステップ2.7で調製したサンプルペプチドを用いた負荷バッファーの100 μLをステージ先端にロードし、遠心分離により溶液を先端に通します。
    注:新しいチューブをスピンアダプタとして取り、サンプルのフロースルーを収集し、フロースルーを冷凍庫に保存して今後の解析を行います。
  7. 100 μLの洗浄バッファー (4.5% AA および 25% ACN) をステージチップにロードし、遠心分離によってチップを通して溶液を通過させます。
  8. 2回目の洗浄は、ローディングバッファで行います。100 μLの負荷バッファをステージチップにロードし、1000×g遠心分離機を使用してチップを通して溶液を3分間渡します。
    注:洗浄バッファーをステージチップにローディングバッファで置き換え、溶出工程中のリンペプチドの損失を排除します。リンペプチド溶出前にIMACステージ先端を平衡化し、ACNの濃度が5%未満であることを確認した。
  9. IMAC ステージの先端をハサミで前面にトリムし、トリミングした IMAC ステージチップを Hp-RP チップの内側に配置します。ステージの先端の2つの層が遠心分離機のふたに触れないようにしてください。

7. Hp-RP C18ステージチップを使用したリンペプチド分画

  1. 100 μL の溶出バッファー (200 mM リン酸アンモニウム (NH4H2PO4))をトリミングした IMAC ステージチップに加え、遠心分離によりステージチップの 2 層を通過します。
    メモ:ソリューションがステージチップを通過しない場合は、スピンダウンの速度を上げます。すべての遠心段階はステップ7の5分のための1,000 x g で行われる。Hp-RP バッファはすべて 表 1にリストされています。
  2. ピンセットを使用してIMACステージチップを廃棄し、20 μLのバッファAをHp-RPステージチップに追加し、遠心分離によって先端を通してバッファを通過させます。
    メモ:すべての溶出バッファが破棄する前にIMACステージチップを通過していることを確認してください。
  3. 20 μLのバッファー 1 を加えて分数 1 を溶出し、遠心分離によって新しいチューブに溶出物を集めます。バッファー 2、3、4、5、6、7、および 8 でプロセスを繰り返し、各分数を新しいチューブに集めます。真空濃縮器を使用して各画分の最終的な溶出物を乾燥させます。
    注: 新しい分画バッファを準備します。各画分のスピンアダプターとして8つの新しいチューブを取ります。異なるスピンアダプターで各分数の溶出を収集します。リンペプチドは塩基性条件下では安定ではないので、濃縮器により溶出液を乾燥させるか、または10%TFAで直ちに酸性化する。

8. LC-MS/MS分析とデータ分析

  1. 0.1%のギ酸(FA)の5μLを加え、質量分析計でサンプルを分析します。
  2. 各画分に対して、6~30%のバッファB(80%ACNと0.1%FA)で90分の勾配を実行します。
  3. 高い衝突エネルギー解離(HCD)を用いて上位10個の標識ペプチドをフラグメント化する。データベース検索を完了してリン酸化部位を特定します。
  4. MaxQuant ソフトウェアに生のファイルをロードし、実験に名前を付け、分数と PTM を設定します。
    注: MaxQuant ソフトウェアのチュートリアルは、https://www.maxquant.org/ で見つけることができます。
  5. LC-MS/MS 実行のタイプでレポーターイオン MS2 を、アイソバリックラベルとして 6plex TMT を選択します。PIF 関数によるフィルターを有効にし、最小 PIF を 0.75 に設定します。
  6. アセチル(プロテインN-用語)、酸化(M)、およびホスホ(STY)を可変修飾のパネルに選択します。固定修正としてカルバミドメチル(C)を選択します。
  7. 特定のダイジェストモードを設定し、消化酵素としてトリプシン/Pを選択し、2つの切断を逃しました。
  8. PSM 偽検出率 (FDR) およびプロテイン FDR を 0.01 に設定します。変更ペプチドの最小スコアを40に設定します。
  9. ファスタファイルのパネルに シロイヌナナ・タリアナ データベースを追加し、データベース検索を実行します。
  10. 検索が完了したら、ホスホ (STY) サイトの txt ファイルを Perseus ソフトウェアに読み込みます。
    注:ペルセウスソフトウェアの詳細なチュートリアルは、https://www.maxquant.org/perseus/ で見つけることができます。
  11. 逆リン酸化部位を除外します。ローカライズ確率 75% をカットオフとして使用して、ローカライズされていないリン酸化部位を除外します。
  12. リン酸化部位の強度を使用して統計分析を行います。

結果

このワークフローの性能を実証するために、IMACステージチップとHp-RPステージチップ分画を利用して、マンニトール処理の有無にかかわらず野生型および snrk2-dec 変異苗のホスホプロテオミクス変化を30分間測定しました。各サンプルは生物学的三数で行われ、実験ワークフローは 図1に示されている。各サンプルの消化されたペプチド(400 μg)を1つのTMT-6plexチャネ...

ディスカッション

植物プロテオームとホスホプロテオームのダイナミックレンジと複雑さは、依然としてホスホプロテオミクス分析の深さに対する制限要因です。10,000リン酸化部位21、22を同定するLC-MS/MS分析の単回実行の能力にもかかわらず、植物全体のホスホプロテオームのカバレッジは依然として限られている。そのため、環境ストレスに対応した植物信号ネ?...

開示事項

著者らは利益相反を宣言しない。

謝辞

この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム、グラントXDB27040106によって支えられた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tubeeppendorf22431081Protein LoBind, 1.5 mL, PCR clean, colorless, 100 tubes
200 µL pipet tipGilsonF1739311
2-chloroacetamideSigma-AldrichC0267
acetic acidSigma-Aldrich5438080100
acetonitrileSigma-Aldrich271004
ammonium hydroxideSigma-Aldrich338818
ammonium phosphate monbasicSigma-Aldrich216003
BCA Protein Assay KitThermo Fisher Scientific23227
blunt-ended needleHamilton90516Kel-F hub (KF), point style 3, gauge 16
C18-AQ beadsDr. MaischReproSil-Pur-C18-AQ 5 µm
C8 Empore disk3 M221447 mm
Centrifugeeppendorf22620444
chloroformSigma-AldrichCX1058
data analysis softwarePerseus 1.6.2.1https://maxquant.net/perseus/
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-Aldrich
formic acidSigma-Aldrich5330020050
FritsAgilent12131024Frits for SPE Cartridges
Guanidine hydrochlorideSigma-Aldrich50933
H2OSigma-Aldrich1153334000
HEPESSigma-AldrichH3375
Iron (III) chlorideSigma-Aldrich157740
LTQ-orbitrapThermo Fisher ScientificVelos Pro
mass spectrometerThermo Fisher ScientificLTQ-Orbitrap Velos Pro
methanolSigma-Aldrich34860
nano LCThermo Fisher ScientificEasy-nLC 1000
Ni-NTA spin columnQiagen31014
N-Lauroylsarcosine sodium saltSigma-AldrichL9150
plungerHamilton1122-01Plunger assembly N, RN, LT, LTN for model 1702 (25 μl)
search engine softwareMaxQuant 1.5.4.1https://www.maxquant.org
SEP-PAK Cartridge 50 mgWatersWAT054960
sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
SpeedVacThermo Fisher ScientificSPD121P
TMT 6-plexThermo Fisher Scientific90061
Triethylammonium bicarbonate bufferSigma-AldrichT7408
Trifluoroacetic acidSigma-Aldrich91707
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideSigma-AldrichC4706
Trizma hydrochlorideSigma-AldrichT3253

参考文献

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