24時間臓器保存と連続テレメトリを用いた豚モデルにおける異形性腎臓自動移植

要約

大型動物モデルは、前臨床移植研究に不可欠な役割を果たしています。臨床セットアップとの類似性により、本稿で説明する直交性腎臓自動移植のブタモデルは、臓器保存技術および治療介入の検査のための優れた生体内設定を提供する。

要約

臓器移植の時代には、臓器が不足している現在、腎臓移植用の同種移植片のプールを拡大する様々な戦略が採用されています。しかし、拡張基準ドナー(ECD)からの同種移植片の使用は、臓器提供者の不足を部分的に緩和することができ、ECD臓器は劣った結果および術後合併症に対する潜在的に高いリスクを運ぶ。動的臓器保存技術、虚血再灌流および保存傷害の変調、および同種移植片療法は、KTにおける同種移植片の利用率および患者の転帰を改善する取り組みにおいて科学的関心のスポットライトを浴びている。

前臨床動物実験は、特に医療機器や医薬品開発において、翻訳研究において重要な役割を果たしています。エキビボまたは小さな動物実験に対するブタの整形外科的な自動移植モデルの主な利点は、臨床現場との外科的解剖学的および生理学的類似性の範囲内にある。これにより、新しい治療法と技術の調査が可能になり、知見の臨床翻訳が容易になります。このプロトコルは、24時間の保存時間とテレメトリモニタリングを使用して、ブタの直交性腎臓自動移植モデルの包括的かつ問題指向の記述を提供する。麻酔、動物ハウジング、周術期フォローアップ、モニタリングの高度に標準化された最先端の方法と洗練された外科技術の組み合わせは、このモデルの再現性と成功を保証します。

概要

ノーベル賞受賞者の外科医ジョセフ・マレー¹の先駆的なグループによって行われた1954年に一卵性双生児間の最初の成功したヒト腎移植が成功して以来、腎臓移植(KT)は末期腎疾患(ESRD)2の患者の治療の主力として進化してきた。KTは透析²と比較して優れた長期的な臨床結果と生活の質を示す。KT後の短期および長期生存率は、外科技術、臓器保存、免疫抑制療法、およびクリティカルケアの進歩により、地球規模^2、3、4で広く利用可能になった。

重大な臓器不足のために、同種移植片の需給^3、5、6の間には絶え間なく格差が拡大している。2018年には、約12,031人の患者がドイツでKTを待っていましたが、移植のための臓器が極端に不足しているため、ドナー腎臓を受け取ることができたのは20%未満(2,291人)に過ぎません^。残念ながら、臓器提供者の絶対数だけでなく、移植のために提供される同種移植片の一般的な品質は、過去数十年^で低下しています^8,9.移植のために受け入れられなければならなかった、損傷を受けた腎臓同種移植片または「限界」の腎臓同種移植片の数に増加傾向が認^められた。ECD同種移植片の使用は、待ち時間および待機リストの罹患率および死亡率を減少させるが、しかしながら、原発移植片非機能(PNF)および/または遅延移植片機能(DGF)8、9、10などの移植片関連合併症の発生率の増加と関連している。さらなる研究は、同種移植片の利用を最適化し、ドナープールを拡大し、最終的に患者の転帰を改善する可能性のある限界同種移植片を保護し、再調整するために不可欠である^3,6.

大規模な動物移植モデルのリソース集約的で複雑な性質のために、多数の研究が小動物を使用して、またはex vivo設定11、12、13、14、15で行われます。これらのモデルは重要な科学的データを提供することができますが、これらの知見を臨床現場に翻訳することはしばしば限られています。異形性腎臓自動移植のブタモデルは、臨床的に関連するin vivo設定で新しい革新的な治療アプローチをテストすることを可能にする確立された再現性モデルであり、潜在的に長いフォローアップ期間と反復サンプルコレクション^16、17のための豊富な可能性を有する。同等の大きさの利点を超えて、臨床現場への比較的直接的な翻訳(特に医療機器開発および薬剤投与量)、虚血再灌流傷害(IRI)応答および腎臓損傷の点での外科的解剖学的および生理学的類似性を、翻訳研究^17、18、19においてこのモデルの使用を支持する。このモデルはまた、臨床臓器移植²⁰の技術的課題のために若い移植外科医を準備するための優れたトレーニング機会を提供する。

人間の設定に比べて多くの違いがあり、モデルの様々な技術的な変更は、文献16、17、19、20、21で見つけることができます。本稿では、豚の直交性腎臓自動移植のモデルを確立するのに役立つ技術的な詳細、落とし穴、および推奨事項を包括的に説明します。記載されたテレメトリおよびビデオ監視方法および私達の特に設計されたハウジングの施設は動物の厳密な重大度の評価および臨床観察を可能にする。経皮尿カテーテルおよび指定されたブタのジャケットの使用は、代謝ケージを使用せずに腎機能の詳細な評価の可能性を提供する。これらの技術的な変更は、3Rの原理(交換、削減および改良)の現代的な課題に準拠し、大型動物モデル²²を用いて動物実験を改善するための潜在的な解決策として説明されている。

プロトコル

本研究は、ARRIVE(動物研究:In Vivo実験の報告)ガイドライン²³の原則に従って設計されました。動物の保護に関する制度ガイドラインおよびドイツ連邦法に従って実験を行った。完全な倫理的提案は、責任ある当局によって承認されました(政府動物ケアと使用委員会、LANUV NRW - 「ランデサムト・フュル・ナトゥール、ウムヴェルト・ウント・ヴェルブラウチャーシュッツ・ノルトハイン・ヴェストファーレン」、レックリングハウゼン、ドイツ、プロトコルID:81-02.04.A018.A051)。本研究のすべての動物は、「実験動物のケアと使用のためのガイド」(第8版、NIH出版、2011年、米国)と科学的目的で使用される動物の保護に関する指令2010/63/EUの原則に従って人道的ケアを受けました(欧州連合の公式ジャーナル、2010)。ドイツの陸上豚は、衛生的に最適化されたバリア繁殖施設(ハインリヒスGbR、ハインスベルク、ノルトハイン・ヴェトファーレン)から得られた。 図1 は、説明した実験プロトコルの概要を示している。

1. 動物と住宅

1. このプロトコルには、女性のドイツの陸上戦の豚(または同等)を使用してください。動物を順応のために最初の手術(遠隔測定注入)の14日前に研究施設に送り、12時間の明暗サイクルで温度と湿度制御されたバリア環境に収容する(図2)。
2. 部屋の天井に2つのテレメトリレシーバーを取り付け、登録されたデータを観測室にあるPCに直接転送できるようにします。獣医官や担当の動物管理人(8時間ごと、オンデマンド)によって定期的に動物が観察されることを確認してください。
   注:さらに、この実験では、ローカルネットワークに接続された統合された熱画像を持つリアルタイムカメラ映像が使用されました。この研究で使用される住宅施設の詳細を 図2に示します。

2. 基本的なテクニックと一般的な手順

1. 手術前に動物を一晩速くする。
2. アザペロン(4mg/kg)とアトロピン(0.1mg/kg)の最初の筋肉内注射によるプレメディケーション、10分後にケタミン(15mg/kg)の注射が続いた。
3. 前投薬後、動物の重量を量り、住宅施設から中央OR施設麻酔準備室に直接移します。
4. 18Gの末梢静脈カテーテルを使用して、大きな耳静脈の1つをカンヌレートします。標準的なECGおよび脈拍のオキシメトリーによって動物を監護しなさい。
5. プロポフォール(3mg/kg)で麻酔を開始します。
6. 喉頭鏡で声帯を露出させ、7.5mm気管チューブを差し込みます。袖口は製造業者の推薦に従って空気で妨げされる。
7. 胃から液体や空気を除去するために、オロ胃の排液管を挿入します。
8. 尿道を介して尿カテーテルを挿入します。
9. 続いて、外科的切開部の領域で皮膚を整える。
10. 手術中の角膜の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布する。
11. 耳障り管挿管後、イソフルラン(最終呼気1.45-2.0 Vol.%)およびフェンタニル(3 -7.5 μg/kg/h)で麻酔を維持します。
12. 加熱パッドと加温空気を使用して、動物のアクティブな術中温度制御を確保します。直腸プローブを挿入して体温を監視します(目標温度36.5 °C ~37.5°C)。
13. セフロキシム(35mg/kg i.v.)を使用して抗生物質予防を行う。4 mL/kg/hでリンゲル溶液を注入し、皮膚切開後8mL/kg/hに増加する。耳静脈アクセス上のパントプラゾール(40mg i.v.)の予防用量を投与する。
14. 外科用敗血症および抗敗血症の一般原則に従って、無菌状態下ですべての手術を行う。ポビドネ-ヨウ素溶液で外科分野を消毒し、外科用ドレープで覆う。

3. テレメトリ注入

1. プロトコルのセクション2に記載の手順に従って手術のために動物を準備し、心拍数の低下と動物の意識的な動きの欠如によって適切な麻酔を確認します。
2. 血液および尿サンプルを収集して、個々のベースラインラボ値を決定します。
3. 永久的なマーカーを使用して切開部位をマークします。
4. テレメトリトランスポンダの動脈センサを移植するために、鼠径部に3〜4cmの切開を行う。360°の方法で動脈を露出し、解剖する。
5. オーバーホルトクランプを使用して、動脈の下の2つの容器ループを引っ張り、蚊クランプでそれらを固定します。
6. ブレードメスを使って動脈#11開いた後、動脈センサーを挿入します。単一結び目縫合糸を用いて5-0ポリプロピレン縫合糸を使用して動脈開管を閉じ、これらの縫合線の1つを使用して動脈センサーを固定します。
7. 動物の左脇腹に3〜4cmの大切開を行い、鈍い解剖によってトランスポンダーのための皮下ポーチを作成します。
8. テレメトリ トランスポンダを側面にトンネルし、筋筋膜(3-0 ポリプロピレン、単一結び目)に固定します。赤と白のECG電極を胸郭の左右にトンネルします。2つの1cm切開を行い、筋肉組織の電極を固定して、単一結び目縫合(3-0ポリグラクチン)で良好なECG信号を確保します。
9. テレメトリデータの登録を開始し、様々な信号(例えば、トランスポンダ本体自体によって登録された体温、動脈血圧、心電図信号)を確認します。
10. 鼠径部の切開を閉じ、左脇腹と筋肉と皮下縫合糸(3-0ポリグラクチン)を使用して2つの小さな経嚢切開を閉じ、非吸収性モノフィラメント縫合(例えば、2-0プロレン)を使用して皮膚を閉じる。
11. スプレーフィルムドレッシングを使用して、切開部位を密封します。
12. この時点で、動物が研究期間の残りの部分のために着用する指定されたブタジャケットを着用するように動物を準備します。すべての外科的介入に続いて、ジャケットを清潔なジャケットに置き換えます。
    注: 安定したベースラインデータを記録するために、インデックス手術の14日前にテレメトリトランスポンダが移植されます(左腎摘出術、 ディスカッションも参照してください)。

4. 腎摘出と腎臓移植片の検索

1. セクション2に記載の手順に従って、移植片検索手術のために動物を準備する。
2. 麻酔の誘導後、外部頸静脈をカニューレ化する。外科分野の無菌消毒に続いて、頸部溝の右側に4cmの切開がなされる。
3. 皮下組織および筋肉を解剖し、外的頸静脈を露出させる。
4. 360°の方法で静脈を露出し、解剖する。
5. オーバーホルトクランプを使用して、静脈の下の2つの容器ループを引っ張り、蚊のクランプでそれらを固定します。
6. 動物の後ろに頸部カテーテルをトンネルします。このためには、豚を左側に置きます。セルディンガー法を使用して、頸部カテーテルを挿入します。
7. 静脈の開口部を閉じ、5-0ポリプロピレン縫合糸を使用してカテーテルを固定します。
8. 2層で切開を閉じます(例えば、3-0ポリグラクチンは筋肉と皮下、皮膚用のポリプロピレンは2-0)。
9. 複数の縫合線(2-0ポリプロピレン)でカテーテルを皮膚に固定します。
10. 自由な吸引および注入のための頸静脈カテーテルをテストする。続いて、静脈から中央静脈線に静脈内線を切り替える。
11. 外科的消毒およびドレープの後、腹部(25〜30cm)を開くために中腹開術を行う。標準的な腹部リトラクタを使用して外科分野を露出する。
12. 結腸と小腸を覆うために濡れた暖かい腹部タオルを使用してください。腎臓とその血管構造を暴露する右半腹部の方向に腸を保持するために2番目のアシスタントに依頼.
13. 腹膜層を開き、単極性の焼灼、双極鉗子、および細かいはさみを使用して、任意の付着組織から左腎臓と尿管を解剖する。
14. リゲートと左尿管(3-0ポリグラクチン)を分け、少なくとも10〜12cmの長いセグメントを残す。
15. 左腎静脈の解剖と下の大動脈からその起源に動脈をそれぞれ完了します。
    注:この解剖学的領域での大きなリンパ管の損傷や開口部を避けてください。また、アチゴ腰椎静脈が静脈からその起源に近い腎静脈に結合する潜在的な傷害に注意してください。
16. 2つの合字(3-0ポリグラクチン)の間のアチゴ腰椎静脈を解剖し、リゲートする。
17. 氷のボウルと滅菌カバーを使用して、バックテーブル解剖の準備をします。
18. 移植片腎臓を取り出すために、腎動脈と腎静脈を大動脈と静脈の近くに血管クランプで固定します。クランプの近くのはさみで血管を切断して腎臓移植片を取り除き、腎臓を後方テーブルチームに引き渡します。
19. 5-0ポリプロピレン縫合糸を使用して、腎動脈の切り株を閉じます。5-0ポリプロピレンを用いた2層連続縫合糸を使用して腎静脈を閉じます。血管クランプを取り外します。
20. 出血やリンパ漏れの領域を確認した後、4層の腹部を閉じます。
    注:腹腎:3-0ポリグラクチンランニング縫合線;筋膜: 0 ポリグラクチンランニング縫合;皮下層: 3-0 ポリグラクチンの流れ縫合;皮膚:腎臓検索手術後の皮膚ステープラーは、翌日に腹部を再開けしやすくし、2-0ポリプロピレン単結糸縫合糸を移植後に決定的な閉鎖を促進する。
21. 無菌創傷包帯を塗布した後、動物を住宅施設に戻し、気管内挿管後に回復することを許可する。術後鎮痛の場合は、ブプレノルフィン(0.05-0.1mg/kg)を筋肉内8時間ごとに使用して、自動移植を行う。

5. バックテーブルと臓器保存

1. 移植片の検索後、標準14G(オレンジ)の末梢カテーテルを用いて直ちに腎動脈をカニュール化し、3-0ポリグラクチンから調製した止血帯を用いて固定する。
2. 腎臓を冷たい臓器保存液ですすます。
3. 500 mLの臓器保存液で洗い流した後、動脈カニューレを取り出し、無菌臓器袋に腎臓移植片を包み込み、コンピュータ制御冷却回路を使用して4°Cで24時間の目標冷間虚血時間(CIT)で臓器保存液に保存します。
   注:4°Cの通常の生理液溶液の500 mLを使用して、簡単な保存後のフラッシュをお勧めします。

6. 逆側腎摘出術と整形性腎自動移植

1. 受取者の手術中に、制限された腎代謝に前投薬と初期麻酔を適応させ、ケタミンの使用を避ける。誘導はプロポフォール(3-5 mg/kg i.v.)、ミダゾラム(0,25mg/kg i.v.)、およびアトロピン(0.1mg/kg i.m)で行われる。その後、術前準備はセクション2で説明した手順と同一である。
2. イソフルラン(最終呼気1.45-2.0 Vol.%)およびフェンタニル(3 - 7,5 μg/kg/h)およびプロポフォール(2 - 4 mg/kg/h)で麻酔を維持します。
3. ECG、パルスオキシメトリー、直腸温度、およびテレメトリトランスポンダの機能を確認し、継続的に監視します。
   注:厳密な麻酔と血圧制御は、移植手順の間に非常に重要です。
4. テレメトリトランスポンダ上に登録された動脈血圧信号が動物の圧入り位置に起因して満足のいくものではない稀な場合には、経皮穿刺法とセルディンガー技術を用いてさらに動脈カテーテルを右大腿動脈に入れる。
5. 無菌ドレープの後、中央開腹性開腹術を再開し、腹部リトラクタを使用して外科フィールドを露出させる。結腸と小腸は腹部の左側に置かれ、無傷の右腎臓を露出する。
6. ドナー処置と同様に、周囲の組織から対側腎臓とその血管を解剖する。右腎静脈と腎動脈を腎結膜の方向に解剖し、吻合に十分な血管長を確保する。
7. 血管クランプの5分前に、ナトリウムヘパリンを静脈内に注入する(100 I.U./kg)。
8. 血管クランプを使用して右腎動脈と右腎静脈をクランプします。右の腎臓は取り除かれる。血管は、アナストモーゼを開始する前に完全性をチェックされます。
9. 保存された移植片腎臓を腹部に入れ、静脈および動脈のアナストモーセを開始する。
10. この時点以降、平均動脈圧を80~90mmHg以上に保ち、再灌流後の腎臓移植片の良好な早期灌流を確保する。これを部分的に適切な容積管理とノルエピネフリンの投与によって部分的に達成する(0.1 - 1.0 μg/kg/minは、平均動脈血圧と心拍数を使用して効率を監視するための継続的な注入として)。
11. 腎静脈のエンドツーエンド吻当を行う:
    1. 5-0ポリプロピレンを使用して2つのコーナーステッチを配置した後、連続的な方法で背面壁を縫合します。
    2. 頭蓋のコーナーステッチを結び、後壁に使用する糸と一緒に結びます。
    3. 後ろの壁を終えたら、頭蓋コーナーステッチを使用して、頭蓋-尾状方向に前壁を縫合します。アヘパリン化した生理食水溶液(100 I.U./mL)で静脈を洗い流します。コーダルコーナーステッチを結びます。
       注:ドナー側と受取人側の間にサイズの不一致がある場合、小さな成長因子を使用して、広く十分な吻合を確実にすることができます。豚の腎静脈の枝の多くの可能なバリエーションがあります。.複雑な静脈解剖学の場合、改変された解剖学のアプローチが必要である( 図3を参照)。
12. 腎動脈のエンドツーエンド吻当を行う:
    1. 動脈吻合を行うために6-0ポリプロピレン頭蓋コーナーステッチを使用してください。後で取り除かれるコーナーステッチを支持するさらにカウダルを配置することは任意です。
    2. パラシュート技術を使用して連続的に後壁を縫合します。コーダルコーナーに到着した後、2番目のコーナーステッチを取り外します(該当する場合)。
    3. 二重武装6-0ポリプロピレン縫合の反対側で前面壁を縫合します。ヘパリン化した生理的な溶液(100 I.U./mL)で動脈を洗い流す。コーダルコーナーで2本の糸を結びます。
13. 両方のアナストモーゼを実行するために必要な時間を<40分の目標暖かい虚血時間で記録します。
14. 静脈血管クランプを開き、続いて動脈クランプを開くことによって腎臓を再浸透する。著しい出血がないか確認してください。
15. もし、アナストモーゼから有意な出血が見られない場合、腎臓移植片を解き放ち、再移植片を覆う腹部に温かい正常な生理液を注ぐ。
16. 必要に応じて移植片を再配置して、均質な再灌流を確保し、輻輳を回避します。
17. パパベリンを腎動脈の外側および動脈吻合(5 mL未希釈)の外側に局所的に投与する。
18. 再灌流後、20%グルコース溶液の250mLを注入し、浸透性のジエレシスを誘導し、続いて80mgのフロセミドを単回投与した。
    注:これに続いて、最初の尿の生産が観察されるかもしれません。
19. 尿の排液を確実にするために、動物の右側面の腹壁を通って12フランスの小児尿カテーテルを後腹膜に通す。
20. 合字(2-0ポリグラクチン)を使用して尿管内のカテーテルを固定し、2 mL生理液でカテーテルをブロックします。さらに縫合糸は、腹壁(2-0ポリプロピレン)の腹膜に尿管を適応させ、固定するために使用される。カテーテルはまた、少なくとも2つの単一結び目縫合糸(2-0ポリプロピレン)で皮膚に固定されています。
21. 腎臓移植片の転位と血管性アナストモーゼ(3-0ポリグラクチン)のキンキングを防ぐために、腎臓の上に腹膜層を閉じます。
22. 移植片の検索のために先に述べたように同様の4層の方法で腹部を閉じます。
23. 腹部閉鎖後、ORテーブルのノルマニアを維持する。
    注:平均動脈血圧は、動物が目を覚まし、起こりやすい位置になるまで80mm Hg以上維持する必要があります。
24. 腹部閉鎖後、色ドップラー超音波を使用して、腎臓移植片の十分な動脈および静脈灌流を確保する(図4)。動物が完全に目を覚まし、自発的に歩いたり飲んだりできるまで、動物を注意深く監視してください。動物は、回収段階でリンゲル溶液の1Lを与えられる。
25. その後、動物を住宅施設の箱に戻します。

7. フォローアップ、サンプル、データ収集

1. 彼らは自発的に飲むことができるとすぐに動物に水アドリビタムを提供します。術後1日目から固形食品を提供する。
2. 術後鎮痛の場合、ブプレノルフィン(0.05-0.1mg/kg)を72時間8時間毎に筋肉内投与し、パントゾール(40mg i.v.)を1日1回72時間投与する。抗生物質治療(セフロキシム35mg/kg i.v.毎日2倍)および血栓症予防(術後1日目から500mgのアセチルサリチル酸)を全観察期間の間に提供する。
   注:出血合併症が発生した場合、アスピリンは中止されます。
3. 観測期間全体を通して連続したテレメトリ データを登録します。動物が獣医官および/または経験豊富な獣医技術者によって少なくとも8時間ごとに訪問されることを確認し、その臨床状態は、動物の臨床状態によって必要とされる場合に実験を早期に終了するための基礎として使用されるスコアシートを使用して評価されます。
   注: これらのいわゆる人道的エンドポイント基準は、前に説明した²⁴のように定義されています。
4. 中央静脈線と経皮尿カテーテルを使用して毎日サンプル収集を行います。尿袋(2,000 mL)を毎日2倍に変更します。
5. サンプル採取または液体または薬物の投与に続いて、閉塞を避け、新しい滅菌キャップでそれをカバーするために、すべての使用の間にヘパリン化生理食い溶液(100 I.U./mL)を用いて中央静脈カテーテルをブロックします。
6. 5〜7日の対応する観察期間に続いて、腎臓移植片の再ラパロトミー、サンプル採取および排泄後の深部麻酔で動物を犠牲にする。犠牲はペントバルビタールの単一の注入を使用して行われる(50 - 60 mg /kg i.v.)。
   注:3R原則に従って、犠牲動物の残りの器官および組織は、社内機関で様々なex vivo研究と教育目的のために使用することができる。

結果

我々のグループは、小動物および大型動物における固体臓器移植モデルに関して数年の経験を有し、豚の整形性腎臓自動移植モデルを利用し、様々な実験設定^{16、25、26、27}で再現可能な結果を得た。実験の設定に応じて、実験チーム全体の十分な学習曲線を確保する予備実験として3〜5の自動移植を行うことをお勧めします。本設置では、外科医を訓練するために5回の移植が必要であり、移植手術の分野における8年間の実験的および5年間の臨床外科経験を有し、これらの実験を行った。これは、これらの技術への外科医の以前の暴露によって異なる場合があります。

このプロトコルの枠組みの中で、5つの豚の整形性腎臓自動移植実験のセットの結果が実証されている。トランスポンダ移植は、観察期間を通じて十分なテレメトリ信号を有する各動物(部分的なトランスポンダー機能不全を有する1匹の動物を除く)で成功した。トランスポンダ移植のためのナイフ間間隔は85分±5分(表1)であった。移植片の検索に続いて、すべての動物は住宅施設でよく回復した。検索手術のためのナイフ間間隔は135分±32分(頸部カテーテルの挿入、トンネリングおよび固定のための約30〜45分を含む)。左腎臓は、24時間(24時間±30分)の目標冷たい虚血時間を有する冷水浴中に貯蔵された。翌日、麻酔の誘発および再ラパロトミーの後、対側(右)腎臓を取り除き、続いて先に述べたように貯蔵された左腎臓移植片の異所性自動移植を行った。自己移植手術のナイフ間間隔は、27分±168分(右腎臓の排泄を含む)であった。暖かい虚血時間は34分±7分であった。各移植された腎臓移植片は、再灌流後の尿の産生が最小限であったが直接的であった。腹部閉鎖後、色ドップラー超音波は、すべての症例において腎臓の満足のいく動脈および静脈灌流を示した(図4)。麻酔から回復したすべての動物と有意な合併症は観察期間を通して観察されなかった。毎日の血液および尿サンプルを採取した。すべての豚は、フォローアップ中に良好な臨床状態にあり、5日後に屠殺された。血清クレアチニンとカリウム値はPOD3-4でピークに達した。血液pHは正常範囲内にとどまっている(図5)。尿の出力は、術後の最初の4日間で正常な値に回復した。白血球数は、フォローアップ期間の終わりにわずかに増加した(図5)。連続したテレメトリモニタリングによって測定された体温は、術後の期間にわたってわずかな変動を示した。

図1: 研究フローチャートとプロトコル 使用される略語: POD術後日;心電図心電図検査. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:最大6匹の動物のリアルタイムかつ連続テレメトリモニタリングを備えた動物用住宅施設(A)最大6匹の動物の住宅・テレメトリ監視に適した施設の模式図。単一のホールディングボックスのサイズは、EU指令2010/63とETS 123付録A.パネルA-Eのガイドラインに基づいて決定されました。(B)6匹の動物の住宅のための動物室。(C) テレメトリデータの連続登録に使用されるパソコン付きの観測室。(D) 動物のリアルタイム映像と熱映像。(E) 社会的孤立を避けるために、動物と動物の音響・嗅覚の接触を確保する個人この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:異形性腎臓の自己移植と解剖学的変動と再建の可能性.(A,B)「標準的な」血管解剖学の場合の正交性腎臓自動移植モデルのステップ(C)バリエーション 1: 1 つの大きな静脈はドナー腎臓に付属していますが、レシピエント側には 2 つの静脈があります。管理:小さい静脈は合字によって閉じられ、吻合は腎静脈の間でエンドツーエンドで行われる。(D)バリエーション 2: 1 つの大きな静脈はドナー腎臓に付属しているが、反対側に適切なレシピの血管がない(例えば、サイズのミスマッチ)。管理:下の静脈に腎静脈のエンドツーサイド吻当。(E)バリエーション 3: 両側に 2 つの類似した大きさの静脈.管理:2つの静脈性アナストモーゼによる再建。(F)バリエーション 4: 2つの類似した大きさの静脈がドナー腎臓に付属するが、反対側には適切なレシピエント血管はない。管理:2つの腎静脈の場合には下静脈に腎静脈のエンドツーサイド吻当。(G)バリエーション5:ドナー腎臓は早期分岐を示す静脈を伴い、反対側には1つの大きな静脈がある。管理:レシピエント側に1つの大きな静脈を有するドナー腎静脈の短い共通チャネルのエンドツーエンドの吻合。(H)バリエーション 6: ドナー腎臓には早期分岐を伴う単一の腎静脈が付属するが、反対側には適切なレシピエント血管はない。管理:下の静脈にドナー腎静脈の短い共通チャネルの側の吻当を終了する。この図は、より頻繁なバリエーションの一握りを示しており、ドイツの競走豚で可能なすべてのバリエーションの点で統計的に包括的ではありません。使用される略語:KG-腎臓移植片;RK右腎臓;IVC劣った大静脈。AO-aortaこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:代表的な色ドップラー超音波画像は、直交性腎臓自動移植および腹部閉鎖後の。(A)色ドップラー超音波は、腎臓および腹部閉鎖の移植後に直接行われ、腎臓移植片の良好な動脈および静脈灌流を確保し、潜在的な刺激性血管のキンキングをスクリーニングする。超音波はまた、様々な問題をスクリーニングする動物の臨床性能に基づいて、毎日およびオンデマンドで使用されました。(B-E)移植後の腎臓移植片の代表的な超音波画像。色付きと無色の腎臓移植片の画像ドップラー(B,C)は、優れた動脈(D)および静脈灌流(E)を示す。この図は、同じ動物からの代表的な画像を示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5 :24時間の冷間虚血時間を有する異所性腎臓自動移植モデルの代表的な検査所見と遠隔測定データ(A) 血清カリウム値 (B) 血清クレアチニン値 (C) pH (D) 白血球数 (WBC) (E) 尿出力.(F)4回連続の腎移植における観察期間を通して遠隔測定モニタリングによって登録された平均体温(部分トランスポンダ機能不全による5^番目の動物からのデータは提示されていない)。使用される略語: POD術後日。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図6:周辺術の合併症および落とし穴の例(A-C)移植された腎臓移植片の移植後の鬱血は、移植後のPOD3に続く親切な自動移植である。(D)輻輳の理由は、皮膚のレベルで縫合糸が引き締まり過ぎ、カテーテルのキンキングと見なされた。縫合糸をほぼ完全に24時間で整形した後に、鬱血が解消された(E)ここでは、直交性腎臓の自動移植に続くPOD2上の他の腎臓移植片が示されている。アステリックス(*)は、移植片の下竿の周りの流体コレクション(血まみれのコレクション対リンパ球)を示しています。腎臓の上腹の閉鎖と我々の技術のためにこれらのコレクションは、通常、局所圧縮の有利な効果のために自己制限である。動物は、局所的な発見、出血または感染の徴候の観点から注意深く監視されるべきである。(F)住宅施設で毎日(およびオンデマンドで)行われる修飾色ドップラー超音波は、その学業利用(例えば、ドキュメンテーション、動脈系レジスタンス指数の登録)に加えて、早期のサブクリニカル段階における潜在的な合併症を認識する上で重要な診断役割を有する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

実験タスク/ステップ	日	時間 (分)	外科 医	獣医官	獣医技術者	研究室の技術者	博士課程の学生	合計
								Nr
プリオプリブケア	D-29 から D-15	Na。		1	1		1	3
遠隔測定移植手術	D-15	85±5	1	1	1	1	1	5
遠隔測定移植後の術後ケア	D-15 から D-1 へ	Na。		1	1		1	3
移植片検索手術	D-1	135±32	1	2	1	2	2	8
腎臓自動移植手術	D 0	168 ±27	1	2	1	2	2	8
腎自動移植後の術後ケア	D 0 から D5	Na。		2	1		2	5
犠牲	D 5	Na。		2		1	1	4

表 1.ブタ腎臓自動移植モデルの様々な実験ステップを実行するための必要な人材および時間スケジュールの説明。

ディスカッション

KTのブタモデルは、臨床的に関連する大きな動物の設定^15、17、21における新規治療アプローチおよび医療機器の調査を可能にする。ブタと人間の設定の間の解剖学的、病理学的および外科的技術的な類似点は、データの臨床的解釈と臨床検査^{15、16、17、18、19、21}に調査結果および技術の迅速な翻訳を容易にすることができる。

同種性腎臓自動移植のモデルは、単臓器移植に比べて必要な動物の数を減らすことによって3R原理に準拠するだけでなく、例えば別のドナー動物は必要ないが、免疫応答および免疫抑制薬^17,21の交論効果なしにIRIおよび保存傷害の影響を調査するユニークな機会を提供する。

プロトコルのわずかな変更は臨床状況の広いスペクトルをモデル化することを可能にする。循環死(DCD)腎臓の後に寄付を用いてKTを模倣するために、血管構造は腎臓検索前に30〜60分間その場でクランプされ、一方、長期にわたる冷たい虚血時間(24時間以上)をモデル広範な保存傷害^{16、17、28、29}に適用することができる。

ブタKTモデルは、小動物(例えばラットおよびマウス⁾²⁶における固形臓器移植モデルよりも外科的に挑戦性が低いが、結果を改善し、特定の合併症を避けるために心に留めなければならない複数の技術的側面および落とし穴^がある。

技術的な間違いや解剖学的変動による移植片の検索または移植中に、下の静脈と大動脈の周りの大きなリンパ管を避けることができないと、高出力リンパ瘻および術後腹部液採取、感染、および潜在的に技術的な故障につながる可能性があります。リンパ管は手術中に完全に避けるか、5-0または6-0ポリプロピレン縫合糸で閉じるべきです。また、リンパ漏れの場合には、バイポーラまたは他の凝固装置の使用を避けるのが賢明です。それは通常、状況の悪化につながります。低出力のリンパ漏れの場合、私たちのチームはフィブリンベースのコラーゲンパッチ(例えば、タコシル⁾³⁰の適用に良い経験を持っていますが、その高コストはこの設定での適用を制限します。

本プロトコルでは、腎臓の検索と自己移植のための経腹膜アプローチを示す。これは、腎臓移植片が通常腹膜外アプローチを使用して腸骨窩に移植される臨床状況と比較して大きな技術的な違いです。しかし、ほとんどの群はブタモデルにおいてトランス腹膜および同一交所性アプローチを用いているが、豚³¹では腸骨窩への異所性移植も可能である。しかし、30〜40kgのブタにおける外腸動脈の直径が比較的低いため、血管れん縮の傾向があるため、腎動脈の端から側までの吻合を外部腸骨動脈³¹に対して行うことが困難になることもある。その後の自己移植を行うために経腹膜アプローチを介して左腎臓を取り出すという事実に関しては、同じ切開を再開し、ストライグトフォワード直交アプローチを使用して移植を行うことがより可能であり、特にプロトコルごとに、動物が1つの損傷を受けた肉体だけで回復するようにネイティブ右腎臓を除去することも必要である。モデルのすべての可能な技術的なバリエーションの包括的な説明は、このプロトコルの範囲を超えており、包括的なレビュー記事³¹で他の人によって要約されています。

移植された腎臓移植片の転位および血管性アナストモーセの結果的な変位は、ブタKTモデルにおける主要な障害源であり、外科的合併症のために血管閉塞および実験の完全な失敗をもたらす急速に至る。これを避けるために、自動移植後、3-0ポリグラクチンを使用して実行中の縫合糸で腎臓の上の腹膜層を閉じます。さらに、色ドップラー超音波は、腎臓および腹部閉鎖の移植後に直接行われ、腎臓移植片の良好な動脈および静脈灌流を確保する。超音波はまた、毎日およびオンデマンドで、動物の臨床性能に基づいて、腎臓灌流、腎後の問題(例えば尿カテーテルの閉塞またはキンキング)、およびリンパ瘻、出血または感染症による体液採取をスクリーニングするために使用される(図4および図6)。

24時間の冷たい虚血はしばしば機能障害および遅延移植片機能を引き起こすので、動物は獣医官によって必要と考えられるならば、オンデマンドの医療療法を必要とするかもしれない。これには、中枢静脈ラインを介して投与される5%グルコースおよび/またはリンゲル溶液を用いた輸液療法、フロセミドボーラス注射(臨床状態および検査結果に応じてオリグリア/ア尿症の場合、200mg/日までの60〜80mgのボーラス注射)、および重度の高カリウム高カリウムスルホネートナトリウム(Resonium A)の経口投与が含^まれる。実験的な偏見を避けるために、動物の移植後の獣医ケアを担当する獣医官は、適用された治療とグループ化のために盲目にする必要があります。

腎動脈の解剖学は、通常1つの動脈を再構築するドイツの陸上豚ではむしろ簡単であるが、静脈再建中に一定の外科的創造性を必要とする腎静脈枝の解剖学的変化の広いスペクトルがある。しばしば2つの(またはそれ以上の)腎静脈の枝は、腎臓のヒラムと下の静脈の間の異なるレベルで結合する。最も頻繁に観察される変動と可能な再構成オプション¹⁷ を 図3に示します。

最初の外科的介入(1日目-15、テレメトリ注入)に続いて、すべての動物は実験の全期間を通して着用するブタジャケットを受け取る。これは、偶発的な傷害および埋め込まれたカテーテルの転位に対する優れた保護を提供し、尿のコレクションの袋の貯蔵のための部屋を提供する。これらのジャケットの使用はまた3R原則に従って精製方法としてクレアチニンクリアランスの評価のための代謝のケージのための必要性を除去するために実現可能な解決である。

当社の住宅施設は、テレメトリとビデオベースのペリオレーシーモニタリングの使用を統合しています。これらの方法は、獣医官や技術者による定期的な訪問を置き換えることはできませんが、迅速な介入を促進し、将来の実験設定をさらに洗練するために重症度評価を改善します。大型動物モデル³³には埋め込み型テレメトリデバイスの使用に関する広範な適応症があります。しかし、ECGなどの大手術後の臨床パラムダーの綿密なモニタリングは、血圧、体温が手術集中治療室および中間ケアユニットのヒト臨床設定において標準であると考えられるが、実験手術では動物が麻酔^33、34、35から目覚めたときにほとんど中止される。したがって、テレメトリは、これらの動物の継続的な監視のための実行可能な方法を提供します。これらのデータはすべて、術後合併症の可能性を正確かつタイムリーに早期に検出する(例えば、出血性ショック、または温度上昇、低血圧および頻脈によって検出された敗血症)に寄与すると考えています。これは、タイムリーな介入(例えば、治療用抗生物質療法の導入、体液置換、抗凝固の中止、または苦しみを避けるために動物の犠牲)を促進する可能性がある。これらの「リアルタイム」監視の側面に加えて、我々のグループは現在、動物実験^36、37、38の重症度評価^と洗練に焦点を当てています。これらの実験で収集された大量のテレメトリデータの遡及的分析は、このような外科的介入の重症度をより良く階層化し、実験動物における周術期ケア(例えば鎮痛)を最適化することを可能にするかもしれない。

埋め込み型テレメトリの面では、測定システムの移植後少なくとも12日の期間は、(個人的な通信に基づいて)安定した最適な測定データを確保するために推奨されます。大型動物向けのテレメトリーソリューションを提供する様々なメーカーや、これらのシステムを用いた他の研究グループと様々な実験設定で議論した後、テレメトリ移植と腎臓移植の間に14日間の期間を統合することにしました。以前の日の間に、瘢痕化および治癒プロセスがまだ未完了であるため、動物の動きのために偏差が依然として起こる可能性がある。

その利点にもかかわらず、上記のモデルには一定の制限がある。複雑さと必要なリソースとインフラストラクチャは、モデルの最も重要な制限事項です。時間のかかる実験プロトコル、複雑な技術、および激しい周術フォローアップは、重要な住宅およびOR容量の可用性を必要とし、博士仲間、外科医、獣医官、技術者を含むより大きなチームの関与を必要とします(表1)。したがって、我々の経験的観察に基づいて、通常、1日に2つ以上の手順を実行することは不可能です。ブタモデルの欠点は、小動物モデルと比較して、機械および分子生物学的調査の可能性が限られている。本プロトコルでは、5日間のフォローアップのみが報告された。これは、モデルの最も重要な実験的特性を実証するのに適していましたが、この比較的短いフォローアップは、特定の研究問題(例えば機能の長期回復と急性損傷)に答えるのに十分ではないかもしれません。したがって、フォローアップのプロジェクト関連の拡張が必要な場合があります。この原稿は、豚の整形性腎臓自動移植の実験環境における現在の「ベストプラクティス」を説明しています。このモデルを正常に確立するには特定のステップが必須ですが、マイナーな側面(例えば、膀胱カテーテルの術中使用、大腿動脈と頸動脈への動脈カテーテルの配置)は、学部であり、研究者の裁量で回避/変更することができる。それぞれの方法論的側面の説明と正当性は、現在のプロトコルの範囲を超えて、他の場所で議論されています³¹.最後に、高齢ドナー、急性腎障害を有する同種移植片および高血圧、糖尿病または動脈硬化などの複数の共罹患および慢性疾患を有するドナーが限界ドナープール^8,9の主要な部分を表すブタモデルにおけるECD KTの正確な臨床状況を再現することも困難である。

上記の制限と技術的およびロジスティックな課題に関わらず、KTのこの確立された再現性の大きな動物モデルは、臓器保存および臨床結果を改善するための新しい治療法と技術を調査するユニークな機会を提供し、若い外科医が大規模な動物モデルで臓器移植技術を習得するための優れたプラットフォームを表しています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia materials, drugs and medications
Aspirin 500mg i.v., powder for solution for injection	Bayer Vital AG, Leverkusen, Germany	4324188	antiplatelet agents
Atropine sulfate solution for injection, 100mg	Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Bensheim, Germany	1821288	parasympatholytic agent, premedication
Bepanthen ointment for eyes and nose	Bayer Vital AG, Leverkusen, Germany	1578675	eye ointment
BD Discardit II syringes, 2ml, 5ml, 10ml,20ml	Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany	300928, 309050,309110, 300296	syringes
BD Micolance 3 (20G yellow) Cannula	Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany	305888	venous catheter
BD Venflon Pro Safety (20G pink)	Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany	4491101	venous catheter
Buprenorphine (Buprenovet)	Bayer Vital AG, Leverkusen, Germany	794-996	analgesia
Cefuroxime 750mg, powder for preparing  injection solution	FRESENIUS KABI Deutschland GmbH, Bad Homburg, Germany	J01DC02	antibiotics
Covidien Hi-Contour, Endotracheal Tube 7,5 with Cuffed Murphy Eye	Covidien Deutschland GmbH,Neustadt/Donau, Germany	COV-107-75E	endotracheal Tube
FENTANYL 0,5 mg Rotexmedica solution for injection	Rotexmedica GmbH Arzneimittelwerk, Trittau, Germany	4993593	opioide analgetic agent
Furosemide-ratiopharm 250 mg/25 ml solution for injection	Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany	1479542	loop diuretics
Glucose 5% solution for infusion (500ml, 250ml)	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	3705273,03705422	infusion fluid
Glucose 20% solution for infusion	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	4164483	osmotic diuresis
Heparin-Sodium 5000 I.E./ml	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	15782698	anticoagulant
Isoflurane-Piramal (Isoflurane)	Piramal Critical Care Deutschland GmbH, Hallbergmoos, Germany	9714675	volatile anaesthetic agent
Ketamine (Ketamine hydrochloride) 10%	Medistar Arzneimittelvertrieb GmbH, Ascheberg, Germany	0004230	general anaestetic agent
MIDAZOLAM 15mg/3ml	Rotexmedica GmbH Arzneimittelwerk, Trittau, Germany	828093	hybnotica, sedative agent
NaCl 0,9% solution for infusion (500ml,1000ml)	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	864671.8779	infusion fluid
Norepinephrine (Arterenol)	Sanofi-Aventis Deutschland GmbH, Frankfurt, Germany	16180	increase in blood pressure
Organ preservation solution (e.g. HTK)	Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Bensheim, Germany	should be decided based on preference and experimental design	organ preservation
Pantoprazole 40mg/solution for injection	Laboratorios Normon,Madrid, Spain	11068	proton pump inhibitor
Paveron N 25mg/ml solution for injection (Papaverine Hydrochloride)	LINDEN Arzneimittel-Vertrieb-GmbH, Heuchelheim, Germany	2748990	spasmolytic agent for vasodilatation
Pentobarbital (Narcoren)	Boehringer Ingelheim vetmedica GmbH, Ingelheim, Germany	1,204,924,565	used for euthanasia
Propofol 1% (10mg/ml) MCT Fresenius	FRESENIUS KABI Deutschland GmbH, Bad Homburg, Germany	654210	general anaesthetic agent
Ringer solution	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	1471411	infusion fluid
Sterofundin ISO solution for infusion (1000ml)	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	1078961	Infusion fluid
Stresnil (Azaperone) 40mg/ml	Elanco	797-548	sedative
Urine catheter ruffle 12CH	Wirutec Rüsch Medical Vertriebs GmbH, Sulzbach, Germany	RÜSCH-180605-12	transurethral urinecatheter
Surgical materials
Appose ULC Skin Stapler	Covidien Deutschland GmbH,Neustadt/Donau, Germany	8886803712	skin stapler
Cavafix Certo 375	B. Braun Deutschland GmbH & Co. KG, Melsungen, Germany	4153758	central venous catheter
EMKA Easytel +L-EPTA Transponder	emka TECHNOLOGIES S.A.S,Paris,France	L-EEEETA 100	telemetry transponder
EMKA Reciever and Data Analyzer System	emka TECHNOLOGIES S.A.S,Paris,France	Reviever	telemetry receiver
Feather Disposable Scapel (11)(21)	Feather, Japan	8902305.395	scapel
Prolene 2-0, blue monofil VISI-BLACK, FS needle	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	EH7038H	skin
Prolene 3-0,blue monofil,FS1 needle	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	EH7694H	skin
Prolene 5-0 (simply angulated, C1 needle) blue monofil VISI-BLACK	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	EH7227H	vascular
Prolene 5-0 (double armed, C1 needle) 60cm	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	KBB5661H	vascular
Prolene 6-0 (double armed, C1 needle) 60cm	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	EH7228H	vascular
Sempermed derma PF Surgical Gloves Seril Gr. 7, 7.5, 8	Semperit investment Asia Pte Ltd, Singapore	4200782,4200871,4200894	surgical gloves
Sentinex® PRO Surgical Gowns Spunlace XL 150cm	Lohmann & Rauscher GmbH & Co. KG, Neuwied, Germany	19302	surgical gown
Tachosil	Takeda Pharma Vertrieb GmbH & Co. KG, Berlin, Germany	MAXI 9,5 x 4,8 cm	haemostasis
Telasorp Belly wipes (green 45x45cm)	PAUL HARTMANN AG,Heidenheim, Germany	4542437	abdominal towel
Pediatric urine catheter	Uromed Kurt Drews KG, Oststeinbeck, Germany	PZN 03280856	used for the uretero-cutaneus stoma
VICRYL- 0 MH Plus	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	V324	fascial closure
VICRYL - 3-0, SH1 Plus needle, 75cm	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	W9114	subcutaneous suture, peritoneal suture,
VICRYL - 3-0, SH1 Plus needle, 4*45cm	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	V780	subcutaneous suture, peritoneal suture,
VICRYL - ligatures Sutupak purple braided, 3-0	Johnson & Johnson Medical GmbH - Ethicon Deutschland, Norderstedt, Germany	V1215E	threats for ligature
3M™ Standard Surgical Mask 1810F	3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany	3M-ID 7000039767	surgical mask
Surgical instruments
Anatomical forceps Standard	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	PZ0260	anatomical forceps
Atraumatic tweezers steel, De Bakey Tip 1,5mm 8"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	GF0840	anatmical atraumatic forceps
Bipolar forceps 16 cm straight, Branch 0,30 mm pointed, universal fit	Bühler Instrumente Medizintechnik GmbH,Tuttlingen, Germany	08/0016-A	biopolar forceps
Bulldog clamp atraumatic,curved, De bakey 78 mm, 3"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	GF0900	bulldog clamps
DE BAKEY-SATINSKY vascular clamp 215mm	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	GF1661	vascular clamp
Dissecting scissors Mayo,250 mm, 10"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	SC2232	Scissors for dissection
Dissecting scissors Metzenbaum-Fino, 260 mm, 101/4"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	SC2290	Scissors for dissection
Draeger CATO Anesthetic machine with PM8050 Monitor	Dräger, Drägerwerk AG & Co. KGaA, Lübeck, Germany	106782	Ventilation System
Fine Tweezers, ADSON 180 mm	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	ADSONPZ0571	fine forceps
Gosset abdomenal wall spreader	CHIRU-INSTRUMENTE, Kaierstuhl,Germany	09-621512	abdominal retractor
HALSTEAD MOSQUITO,curved, surgical 125mm	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	KL2291	mosquite clamps
HF surgical device ICC 300, Electrocautery	Erbe Elektromedizin Gmbh; Tübingen, Germany	20132-043	cautery, biopolar
MICRO HALSTED-MOSQUITO 100mm, curved	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	KL2187	mosquite clamps
Micro steel needle holder straight 0,5mm, with spring lock	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	MN1324D	microsurgical needle holder
Microsurgical/watermaker tweezers LINZ 150mm 6" Ergo round handle	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	MN0087	fine microsurgical forceps
needle holder Mayo-hegar,190 mm, 71/2"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	NH1255	needle holder
Overhold Slimline Fig. 0 8 1/2"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	KL4400	overholds
Sterile Gauze 10X10	Paul HaRTMANN AG,Heidenheim, Germany	401725	sterile gauze
Suction tip OP-Flex Handpiece Yankauer	Pfm Medical AG, Köln, Germany	33032182	suction
surgical forceps Standard 5 3/4"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	PZ1260	surgical forceps
surgical scissors standard pointed-blunt (thread/cloth scissors)175 mm, 7"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	SC1522	surgical Scissors
Titanit vascular scissors POTTS-SMITH,185 mm, 71/4"60°	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	SC8562	Pott scissors
Tunneling instrument	Marina Medical Instruments Inc,Davies,US	MM-TUN06025	subcutaneous tunneling
Vessel loops	Medline International Germany GmbH,Kleve, Germany	VLMINB	hold and adjust the vessel
Wound spreaders Weitlander, Stump,110 mm, 41/4"	ASANUS Medizintechnik GmbH, Tuttlingen, Germany	WH5210	wound care
Further material
Heating pad	Eickemeyer - Medizintechnik für Tierärzte KG, Tuttlingen, Germany	648050 MHP-E1220	maintain body temperature during surgery
Laryngoscope, customized	Wittex GmbH, Simbach, Germany	333222230	expose the vocal cord
Rectal temperature probe	Asmuth Medizintechnik, Minden, Germany	ASD-RA4	measure body temperature
Spray wound film	Mepro-Dr. Jaeger und Bergmann GmbH, Vechta, Germany	2830	keep sterile condition
Sterile organ bag	Raguse Gesellschaft für medizinische Produkte, Ascheberg, Germany	800059	organ preservation
swine jacket small, adult Landrasse swine 30-50kg, customized for Emka Telemetry and urinary catheterization	Lomir Biomedical Inc., United Kingdom	SS J1LAPMP	swine jackets to pretect implanted catheters and store urine bag
Ultrasound device, Sonosite Edge-II	FUJIFILM SonoSite GmbH, Frankfurt, Germany	V21822	ultrasound and color Doppler
Urine bag 2000ml Volume	ASID BONZ GmbH, Herrenberg, Germany	2062578	disposable urine bag connected to the uretero-cutaneous fistula catheter