機械評価のためのヒト筋学の上室から骨格筋生検の収集

要約

この技術報告書は、繊維損傷を制限する筋液脛節前部の生検のための修正されたベルクストローム技術のバリエーションを説明している。

要約

骨格繊維の収縮の機械的特性は、全体的な筋肉の健康、機能、および性能の重要な指標です。ヒト骨格筋生検は、これらの努力のためにしばしば収集される。しかし、生検手順の技術的な記述は比較的少なく、一般的に使用される筋肉性の外側の外側の外側の、利用可能である。生検技術は、多くの場合、研究中の各筋肉の特性に対応するように調整されますが, いくつかの技術的なレポートは、より大きなコミュニティにこれらの変化を共有しています.したがって、オペレータが車輪を再発明するにつれて、ヒト参加者からの筋肉組織はしばしば無駄になる。様々な筋肉から生検に利用可能な材料を拡大すると、失敗した生検の事件を減らすことができます。この技術レポートでは、繊維損傷を制限し、機械的評価に十分な繊維長を提供する筋学脛節前部に対する修正されたBergström技術のバリエーションについて説明します。手術は1時間で完了できる外来処置です。この処置の回復期間は、光活動(すなわち、歩行)、正常身体活動再開のために最大3日間、創傷ケアのために約1週間即時である。抽出された組織は機械的な力の実験に使用することができ、ここで我々は代表的な活性化データを提示する。このプロトコルは、ほとんどの収集目的に適しており、他の骨格筋に適応可能であり、収集針の変更によって改善される可能性がある。

概要

臨床や研究目的のための人間の筋肉生理学の研究は、多くの場合、筋肉の生検を必要とします.例えば、ヒトの筋肉生理学とバイオメカニクスにおける大きな課題は、運動する筋肉の性能の様々な適応を区別し、理解することです。パフォーマンスの適応には、構造的適応(例えば、収縮タンパク質の変化、筋肉アーキテクチャ)だけでなく、神経適応¹も含まれており、それは不可能ではないにしても、その人の筋肉でそのままテストするときに別々に評価するのが非常に難しい。繊維レベルの実験は、これらの高次成分を除去し、筋肉収縮のより直接的な評価を可能にし、生検技術を介して収集することができる。筋肉生検は、少なくとも1868²以来収集されている。今日、筋肉生検を収集する主な技術は、修正されたベルクストローム技術^{33、4、5ですが、4,5}ワイル・ブレイクスリー・コンコトーム⁶またはいわゆるファインニードル^77、88の使用を含む他の技術が利用可能である。これらの技術はすべて、筋肉に渡し、組織の一部を切断するように設計された特別な針のような楽器を使用しています。具体的には、変更されたベルクストローム技術は、大きな変更された針(ここでは5ミリメートルの針のサイズ)を使用しています。図 1)針先に近い窓と針の上下に移動する小さな内部トロカールがあり、針の窓の上を通過するときに筋肉を切断します。このハロートロカールの中には、トロカールのシャフトを上下に移動し、生検を針の窓に向かって押すラムロッドがあります。針の窓に筋肉を引っ張るために、吸引ホースが取り付けられ、針から空気を吸い出し、負圧で筋肉を針の窓に引き込みます。

筋肉生検は、多くの場合、疾患によって引き起こされるタンパク質含有量、遺伝子発現、または形態の変化を研究するために、または運動プログラム^{11、9、10、119,10,11}に応答して取得される。筋肉生検のもう一つの重要な用途は、繊維収縮力の測定、筋線維の剛性、および歴史依存性の筋肉特性^{12、13、14、15、1613,14,15,16}などの機械的実験である。¹²単繊維または繊維束の力学は、長さのモーターと力のトランスデューサの間に繊維を取り付けることによって、同時に力を測定しながら繊維長を制御する特殊なリグに測定される。繊維を透過(例えば、スキニング)することにより、サルコレンマ膜は、浴液中の化学物質に透過性となり、カルシウム濃度を変化させることによって活性化制御を可能にする。さらに、化学物質/医薬品/他のタンパク質に対する収縮特性の効果は、問題の試薬を浴液に添加することで容易に評価することができます。しかし、この技術は他の動物モデルで非常に使用されているが、著しく少ない研究は、ヒト筋肉生検^{17、18、1918}から皮膚繊維の機械的試験^を19行った。¹⁷その理由の1つは、生検ツールとプロトコルが、組織抽出中に持続する構造的損傷のレベルをあまり考慮していない限り多くの筋肉組織を除去するように設計されているからです。確かに、最近の生検プロトコルは、生検針を筋肉に駆動し、筋肉³の2〜4個の塊を収集することを示唆している。このプロセス自体はDNAやタンパク質材料にほとんどダメージを与えませんが、筋線維の活性化が不安定になったり不可能になるような方法で繊維や肉体の構造を破壊することがよくあります。さらに、バイオプシー内の繊維の相対的な長さは、通常、短い(<2 mm)、機械的なテストのために容易に処理されません。機械的試験のために、理想的な繊維は長く(3-5 mm)、構造的に損傷を受けていない。

より高度な組織抽出技術は、繊維損傷を制限するために使用することができる。例えば、あるグループ²⁰ は、以前に計画されていた前腕の「開いた手術」(例えば、骨折修復)を利用して、筋肉が完全に露出し、外科医が筋肉構造を可視化し、筋肉組織の比較的大きく構造的に損傷のないサンプル(15mm x 5mm x 5mm)を慎重に解剖することができた。この「オープンバイオプシー」技術は、参加者が以前に計画された手順を受けているときに好まれるので、特に手術が行われない健康な成人のために、潜在的な参加者のプールを制限します。したがって、研究目的で行われる多くの生検は外来処置として行われ、切開部位は感染リスク、瘢痕化、治癒時間を制限するために可能な限り小さく保たれる。したがって、ほとんどの生検は 盲目的に 収集されます(すなわち、オペレータは筋膜を通って筋肉に入る収集針を見ることができません)。これは、生検の質がオペレータのスキルと経験にほぼ完全に基づいていることを意味します。すべての筋肉は、神経や血管を侵すリスク、理想的な採取深度と位置の選択、筋肉を可能な限り緩く保つための適切な身体位置の決定など、組織を収集する際に独自の困難を抱えています。残念ながら、筋肉特有のスキルセットのほとんどは書き留められていないので、各医師は新しい筋肉の生検を行う際に「車輪を再発明する」必要があります。経験のこの欠如は、医師がその筋肉の生検のためのベストプラクティスを識別するまで、通常、低品質でいくつかのコレクションにつながります.初心者の医師は、多くの場合、彼らの経験豊富な同僚との会話を通じてスキルを学びますが、特に生検コレクションに伝統的に使用されていない筋肉のために、この問題に関しては比較的有益で査読されたテキストが存在します。上記の情報を考慮すると、生検のための人間のボランティアを募集することの難しさと共に、すべての参加者の成功の可能性を最大化するより多くの教育情報が必要であることは明らかです。

したがって、本論文の目的は、機械的検査のために長く損傷を受けていない線維片を有する筋肉生検の収集を成功させるためのプロトコルを提供する筋肉生検技術を提示することであった。ヒトの筋肉生検は通常行われ、生検の訓練材料の大部分が上にあり、筋肉スの広大な側面が上にある。皮膚に対する比較的大きな筋肉サイズと表面的な位置は、患者の不快感と身体的外傷^を最小化しながら、十分な筋肉組織の収集を可能^にする^1、21。しかし、縦方向のトレーニング研究のために広大な横方向の分析を使用することにはいくつかの制限があります。例えば、トレーニングプログラムを含む実験的なプロトコルの間、参加者はしばしば2〜6ヶ月に及ぶ期間、研究外の追加のトレーニングを控えなければなりません。アスリートにとって、広大なラテラリスは通常、典型的な運動(例えば、スクワット、ジャンプ)中に訓練されるか、または一般的にスポーツ(例えば、ランニング、サイクリング)のために使用されるので、これはしばしば不可能である。研究の目的から離れたこれらの別々のトレーニング経験は、筋肉の特性に対する研究の実験プロトコルの真の影響を知ることは困難または不可能であるような方法で筋肉の力学、アーキテクチャ、および生理学を変える筋肉の適応を引き起こす可能性があります。これらのタイプの研究では、多くの場合、訓練連隊の焦点ではないターゲット筋肉を選択するのが理想的であろう。筋力脛筋(TA)は、上記の要件を満たす理想的なターゲット筋肉です。さらに、ダイナモメーターを使用するなど、制御可能なアプローチを使用してTAに向けてトレーニング介入を行うことができます。TA筋肉生検に関するトレーニング資料はほとんどありません。そこで、TAから比較的損傷のない筋肉生検を収集する改質プロトコルを開発しました。

プロトコル

注:以下では、別の進行中の研究に登録されたボランティアのTAから機械的に損傷のない繊維を収穫するためのプロトコルを概説します。このプロトコルは、シャネリーら³によって記述されたものと似ていますが、その中で、変性されたベルクストローム法を広大なラテラリスで説明しています。ここに示す情報は、研究グループによって洗練されていますが、すべてのラボ グループや組織のセットアップに適しているわけではありません。私たちはガイドラインのみを与え、生検コレクションに新しい研究室は、人間の試験を試みる前に経験豊富な実験室グループに相談することを強く示唆しています。

本論文で実施された全ての研究は、ルール大学ボーフムのスポーツ科学部倫理委員会によって承認された。参加者は、研究に参加する前に、無料の書面によるインフォームド・コンセントを与えました。

1. 実験準備

1. 参加者相談中に参加者の詳細な病歴を取りながら除外基準を評価します(下記参照)。
   1. 生検に至るまでの6週間の間に標的筋に損傷を負った場合は、参加者を除外する。参加者は一般的に健康であり、筋肉や凝固障害を認識しておらず、現在血液の間引き(例えばアスピリン)を引き起こす薬を服用していないことを確認してください。
      注:ここでは、適度に活動的な参加者を選び、生検の少なくとも3日前に集中的または慣れない脚の運動を控えるように指示しました。しかし、他の研究問題については、これらの基準が変更される場合があります。
2. ドイツの法律と一般的な慣行によって規制され、チームの医師^22、23によって監督されるように、殺菌と無菌技術^に従^います。この手順は、多くの場合、「ベッドサイド」手順として、または外来外科スイートで行うことができます。ガイダンスについては、現地の規制機関に相談してください。
3. 生検チームを構成します。生検チームには4人が含まれていることを提案します。医師(または生検コレクションの訓練を受けた個人)、医師と協力する1人の医療アシスタント、参加者を監視して対話する1人のアシスタント、抽出直後に筋肉生検を扱う1人のアシスタント。これらの数字を使用すると、処置中に医療緊急事態が発生した場合、迅速な患者ケアを行うことができます。手順に慣れていれば、チームは医師と医療アシスタントの2人だけで作られ、同時に患者ケアと組織処理を同時に受け入れます。
4. 参加者がプロジェクトの主任/医師と会い、ユーザーの同意書を確認、議論、署名してもらいます。詳細な病歴(下肢とTAへのアレルギー、怪我または手術)を取り、除外基準のいずれかを満たしている場合は参加者を除外します。回復と切開衛生について徹底的に議論する。
   1. 参加者は、痛いが、手順の直後に歩き回ることができることを説明する。斜面や階段を下りることは、最初の48時間は不快であることが多く、通常は72時間後に完全な活動が戻ります。最後に、感染および機械的擦過傷を制限するために、切開部位は少なくとも1週間包帯されたままで、清潔に保たれるべきであることを説明する。

2. Bモード超音波で前脛表を可視化

1. 参加者に、快適な仰向けの位置に横になって、足の筋肉をできるだけリラックスするように指示します。カスタムメイドのデバイス(下記参照)を使用するか、助手に少し反射した位置で足首を保持して、生検中に行われるものを模倣します。
   注:参加者は、処置中に筋肉の特性を複製するようにリラックスしたTAを持っていることを重要です。試験中、筋肉アーキテクチャの変化に注意できるように、参加者に筋肉を収縮させ、リラックスしてもらいます。
2. 超音波プローブを使用して、TAの表面的および深いコンパートメントを視覚化し、筋肉アーキテクチャを調査し、挿入の深さおよび針の攻撃角度を決定する(図2A-B)。皮膚のランドマークを示します。
   1. 主要な静脈、動脈、または神経を避けるターゲット領域の選択に特に注意を払う。
   2. TA筋腹内の中心アポンユーロシス(脚の約1/3、膝への遠位、脛堤の2cm横方向)を同定することを目的として、筋肉の断面を評価する(図2B)。中央アポンユーロシス(通常1.5〜3cm)の位置と深さを記録して、この時点を過ぎてコレクション(Bergström)針を駆動しないように注意してください。
   3. ターゲットの位置上の近位遠位方向に超音波プローブを配置し、筋膜のペニングと筋肉の厚さを視覚化します(図2A)。この情報を使用して、コレクションの針を筋肉の腹にうまく(盲目的に)駆動するのに役立ちます。手術中に将来の参照のために、ターゲット部位の画像を両方の平面に保存します。
3. この情報を使用して、ターゲット領域に向かって針の動きの計画を作成します。
   1. 切開を標的の生検領域から1〜3cm遠位にする計画を立てる。針が筋肉に渡された後、針を四肢の長い軸に沿って皮膚に対して〜45%の角度に回転させ、次いで生検領域に向かって近位的に駆動する。この戦略は、針があまりにも強く押された場合、中央アポンユーロシスに針を駆動する可能性を制限します。さらに、針は、針オペレータの手渡しに応じて、遠位または近位に駆動することができる。

3. 生検の手順

1. 手術台の上に仰向けに寝かせ、足の筋肉をリラックスするように参加者に指示します。生検部位への参加者の視線がカーテンで塞がっていることを確認します。
   1. 少し伸び反射位置に足首を固定するデバイスに参加者の手足を置くことによって筋肉の腹から受動的な緊張を取り除く(ニュートラルから0〜5°; 図 3.あまりにも多くの過性反射が潜在的にリラックスするのを困難にすることができるので、彼らはまだ彼らの筋肉をリラックスできるかどうかを患者に尋ねます。
      注:私たちは、後ろ反射足から生検を収集し、中性の5°以下(すなわち、シャンクに垂直な足の裏)は、より多くの足底屈曲足首角度よりも一貫した、より大きな生検を生成することを発見しました。足首の反射を維持するデバイスは、カスタムメイドのデバイスです。しかし、任意の数の(安価な)デバイスを製造することができ、それでも望ましい結果を生み出すことができます。
2. 標準的な慣行²⁴に従って、選択された切開部を剃り、きれいにし、消毒する。
   注:参加者の「きれいな」領域は、提案された切開部位の約20cm近位遠位および10cm内側側面である。ただし、このトピックについては、必ず機関の規制や国の規制(もし存在する場合)に相談してください。消毒プロトコルには、皮膚をきれいにごしごし洗い、医療グレードの消毒スプレーを自由に使用して4回消毒することが含まれます。何らかの理由で参加者がテーブルから離れた場合は、消毒プロトコルを再起動する必要があります。
3. 生検部位でエピネフリンを用いた2%キシロシチンの1.5ccの上頭膜注射を投与し、局所麻酔薬および血管収縮剤として機能する。~20~30分の割り当てられた影響時間を待ちます。
   注:これらの薬物は筋毒性であり、したがって、皮下組織のみ、筋肉に注入されてはならない。血管収縮に対する反応として、注射部位の領域は白(明るい肌のトーンで)または灰色(暗い肌のトーン)に変わる可能性があります。
4. 無菌メスで肌のピッチと穏やかな突きで薬物効果を確認してください。
5. 以前にマークされた生検部位で、皮膚と筋膜を切断し、筋肉の腹を露出させる無菌メスで1cmの近位遠位切開を行う。針が鈍く、筋膜を通過しないので、鼻隠しを完全にカットするように注意してください。
6. 生検針0.5~1.0cmを皮膚に垂直な向きで筋肉に押し込む(図2C、2E)。
   注:オペレータは異なったティッシュタイプを通して針を動かすために必要な緊張の変化を感じるでしょう。脂肪組織は簡単で、筋膜は最も丈夫で、筋肉は間にあります(しかし、参加者に基づいて可変することができます)。
7. 針を、脚の長い軸に沿って、皮膚に対して〜45°の角度の位置に向けます(図2D,2F)。針先が筋肉内のターゲット位置になるまで、針を別の1〜2cm筋肉に押し込みます。
   注:医師は、筋肉の寸法の個々の変動を考慮するために保存された超音波画像を利用する必要があります。切開は針を挿入するのに十分な大きさだけなので、医師は皮膚を通して盲目的に針を駆動します。生検オペレーターが経験を得る「感触」があります。初心者は、訓練を受けた生検オペレーターからスキルを学ばなければなりません(これについては議論の中で詳しく説明しています)。
8. 100 mLの注射器とホースをバイオプシー針に取り付けます(図1G)。約15-20 mLでシリンジのプランジャーを引っ張って針に負圧を生じ、針の窓に筋肉組織を吸い込んで、Bergström針に吸引を適用します。その後、針窓の上にトロカーの素早いプッシュ(es)で筋肉を物品切りします。
   注:吸引の前と中に、針の窓のすぐ上の皮膚に軽い圧力を置いて、筋肉を針に押し込むのを助けるのが役立つ場合があります。
9. 脚から針をそっと取り出し、ゆっくりと回転させる。針を抽出しながら、唯一の光抵抗があるはずです.より多くの抵抗がある場合、これは部分的な生検の切り傷を示し得る。これは、これが起こり、標的の場所に必要性を戻し、そして組織採取を再試行する。
10. 内部ラムロッドを使用して、切除された組織を針の窓に向かって押します。
11. 針から慎重にサンプルを取り出します。
    注:針を回収液に沈める(繊維準備セクションを参照)、しばしば針から生検を取り除きます。さらに、注射器は針を通して空気を駆動し、サンプルを押し出すために使用することができる。これらの技術は、ピンセットで生検に物理的に触れる必要性を除去し、損傷の可能性を低減する。ツール、手(手袋をはめたかどうか)または非無菌溶液が針に接触した場合、針は処置の間に進んで使用することができない。したがって、2番目の即時生検が必要な場合は、新しい滅菌針を使用する必要があります。これはしばしば起こるので、いくつかの無菌針を予備に維持することがベストプラクティスです。
12. 脂肪や結合組織ではなく、筋肉として組織を識別します。筋肉組織は、その深い赤色のために他の組織から容易に同定される(図4A)。時には、収集された組織は筋肉ではなく、脂肪または結合組織である。
    1. 十分な量の筋肉組織が収集された場合は、プロトコルを継続します。十分な筋肉がない場合は、再び生検を試みる。
    2. 2回目の生検が必要な場合は、2回目の針のプッシュが参加者を最初のものよりも不快にさせるため、参加者を注意深く監視します。
13. 筋肉サンプルを回収液ですぐに洗浄し、単繊維実験の準備をします(筋肉生検の取り扱いと保管を参照)。
    1. 経験豊富なアシスタントにサンプルの品質を確認してもらい(下記参照)、2回目の生検を行う必要性を評価してください。別のアシスタントが処理のために生検を受け、チームの残りの部分は参加者と一緒に進みます。
14. 切開部位を閉じます。
    1. 滅菌ロイコストリップテープで切開傷を閉じます。1つ以上の部分を使用して、切開部位の端を結合し、切開の長い軸に垂直に配置し、多方向荷重から保護するために星型パターンでさらにストリップを敷設します。
       注:このステップを適切に処理すると瘢痕が減少します。創傷を縫合することは可能であるが、必要ではない。その他のオプションには、傷の接着剤が含まれます。
    2. 感染から保護するために切開部位の上に無菌創傷包帯(例えば、ロイコメッドTプラス)を置く。
    3. 脚を粘り合う弾性包帯(Unihaftなど)で包み込んで、初期出血を制限し、外部の機械的衝撃から保護します。
    4. 出血を防ぎ、より深い包帯が緩んだり破壊されたりするのを防ぐために、アクリル圧縮包帯で脚を包みます。

4. 生検後のケア

1. 参加者に,処置の直後に歩き回るように頼みます。局所的な痛みがあります。できるだけ普通に歩くように参加者に指示します。
2. 包帯を外したり、包帯に水を浸したりしないように参加者に指示します。彼らは少なくとも続けなければならない:アクリル形成包帯のための1日、まとまりのある弾性包帯のための3日間、および創傷包帯のための7日間。必要に応じて再バンドを組み替えることができることを参加者に伝えます。
   1. 参加者の生検後のケアを個人のニーズに合わせて調整します。訓練を受けたアシスタントまたは医師に参加者を評価してもらい、適切な生検後ケア計画を立てるようにしてください。この手順では、TAの脳神経筋検査をさらに生検から少なくとも1週間分離することを示唆する。

5. 筋肉生検の取り扱いと保管

1. 組織抽出後、すぐに組織を5mLバイアルに入れ、リゴール回収液(mM:Tris(50)、KCl(2)、NaCl(100)、MgCl2(2)、EGTA(1)、プロテアーゼ阻害剤錠剤(1)、pH7.0)を軽く振って血液を洗い流す。₂
2. リゴール溶液を新鮮な厳しさと交換し、4〜6分間軽く振り、4〜6時間4°Cで保存し、プロテアーゼ阻害剤の貯蔵溶液と血液の交換を可能にします。
3. 一晩の厳格な交換用リゴール溶液(mM:トリス(50)、KCl(2)、NaCl(100)、MgCl 2(2)、EGTA(1)、プロテアーゼ阻害剤錠剤(1)、50:50グリセロール、pH 7.0、4°Cで12〜18時間保存する。₂
4. 50:50コレクションの厳格なグリセロールのための一晩の厳しさを交換し、3ヶ月まで、または-80 °Cの冷凍庫で1年間-20 °Cで保存されます。
   注:このプロセスは、細胞の中にカルシウムを手動で加えることを可能にする繊維膜を透過させます。このプロセスは時間がかかり、異なる筋肉や種の間で異なる可能性があります。

結果

参加者の全時間のコミットメントは約1時間(10分の相談、10分超音波、20分手術準備と麻酔投与、10分手術、10分の回復)でした。多くの場合、参加者は無意識のうちにTAを活性化し、筋肉を可能な限りリラックスさせるために一貫したリマインダーを必要としました。生検針が筋肉の中にあったとき、参加者は通常、中等度から激しい不快感の時折期間で、生検針の周りの領域でユニークな「圧?...

ディスカッション

本報告では、TAから構造的に損傷を受けていない筋組織の生検の手法について述べた。この手順は、機械的検査のために使用可能な筋線維(収集された組織の50mgあたり5〜10繊維束調製物)の許容可能な含有量を生み出すことがわかった。さらに、我々は、フォローアップ機械的、遺伝的、およびプロテオーム実験のための十分な組織を持っていました。

筋肉生検^,

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe	B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany	4606027V	Drug administration
5mm Berstöm needle	homemade	N/A	Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	269700	elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11836145001	Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept	PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany	9805630	Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	7238201	Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip	Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain	66002876	wound closure
Surgical disposable scalpels	Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany	BA200 series	Incision
Unihaft cohesive elastic bandage	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	4589600	cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin	Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany	N/A	Controlled substance anesthesia, vasoconstriction