Collezione di biopsie muscolari scheletriche dal compartimento superiore del musolo umano Tibialis Anterior per la valutazione meccanica

Riepilogo

Questa relazione tecnica descrive una variazione della tecnica bergstrom modificata per la biopsia del musculus tibialis anteriore che limita i danni alle fibre.

Abstract

Le proprietà meccaniche di contrarre le fibre scheletriche sono indicatori cruciali della salute generale del muscolo, funzione, e le prestazioni. Le biopsie muscolari scheletriche umane sono spesso raccolte per questi sforzi. Tuttavia, sono disponibili relativamente poche descrizioni tecniche delle procedure di biopsia, al di fuori dei musculus vastus lateralis comunemente utilizzati. Anche se le tecniche di biopsia sono spesso regolate per adattarsi alle caratteristiche di ogni muscolo in fase di studio, pochi rapporti tecnici condividono questi cambiamenti alla comunità più grande. Così, tessuto muscolare da partecipanti umani è spesso sprecato come l'operatore reinventa la ruota. L'espansione del materiale disponibile sulle biopsie da una varietà di muscoli può ridurre l'incidente di biopsie fallite. Questa relazione tecnica descrive una variazione della tecnica bergstrom modificata sul musculus tibialis anteriore che limita i danni alla fibra e fornisce lunghezze di fibra adeguate per la valutazione meccanica. L'intervento è una procedura ambulatoriale che può essere completata in un'ora. Il periodo di recupero per questa procedura è immediato per l'attività leggera (cioè camminare), fino a tre giorni per la ripresa della normale attività fisica e circa una settimana per la cura delle ferite. Il tessuto estratto può essere utilizzato per esperimenti di forza meccanica e qui presentiamo dati di attivazione rappresentativi. Questo protocollo è appropriato per la maggior parte degli scopi di raccolta, potenzialmente adattabile ad altri muscoli scheletrici, e può essere migliorato da modifiche all'ago di raccolta.

Introduzione

Lo studio della fisiologia muscolare umana per scopi clinici o di ricerca spesso richiede biopsie muscolari. Ad esempio, una grande sfida nella fisiologia muscolare umana e nella biomeccanica è distinguere e comprendere i vari adattamenti delle prestazioni muscolari all'esercizio. Gli adattamenti delle prestazioni non includono solo adattamenti strutturali (ad esempio, cambiamenti nelle proteine contraili, architettura muscolare), ma includono anche adattamenti neurali¹, che sono molto difficili, se non impossibili, da valutare separatamente quando si testano intatti in situ muscoli umani. Gli esperimenti di livello in fibra rimuovono questi componenti di ordine superiore e consentono una valutazione più diretta della contrazione muscolare e possono essere raccolti tramite tecniche di biopsia. Le biopsie muscolari sono state raccolte almeno dal 1868². Oggi, la tecnica predominante per raccogliere le biopsie muscolari è la tecnica modificata Bergstrom^3,4,5, anche se sono disponibili altre tecniche tra cui l'uso di un conchotome Weil-Blakesley⁶ o il cosiddetto aghi sottili^7,8. Tutte queste tecniche utilizzano speciali strumenti aghi che sono progettati per passare nel muscolo e tagliare un pezzo di tessuto. In particolare, la tecnica modificata bergstrom utilizza un grande ago modificato (5 mm di ago; Figura 1) che ha una finestra vicino alla punta dell'ago e una trocar interna più piccola che si muove su e giù per l'ago, tagliando il muscolo quando si passa sopra la finestra dell'ago. All'interno di questo trocar hallow è un ramrod che si muove su e giù per l'albero della trocar e spinge la biopsia verso la finestra dell'ago. Per tirare il muscolo nella finestra dell'ago, viene attaccato un tubo di aspirazione, che aspira l'aria dall'ago e tira il muscolo nella finestra dell'ago tramite pressione negativa.

Le biopsie muscolari sono spesso acquisite per studiare i cambiamenti nel contenuto proteico, nell'espressione genica o nella morfologia causata dalla malattia o in risposta a un programma^{di esercizi 1,9,10,11}. Un altro uso critico per le biopsie muscolari sono gli esperimenti meccanici come la misurazione della forza contraili in fibra, la rigidità della fibra muscolare e le proprietà muscolari^{dipendenti dalla storia 12,13,14,15,16}. La meccanica del fascio di fibre singole o fibre viene misurata collegando fibre tra un motore di lunghezza e un trasduttore di forza su impianti specializzati che controllano la lunghezza della fibra e contemporaneamente misurano la forza. Permeabilizzando (ad esempio, la scuoiatura) le fibre, la membrana sarcolemma diventa permeabile alle sostanze chimiche nella soluzione del bagno, consentendo il controllo dell'attivazione variando la concentrazione di calcio. Inoltre, l'effetto delle proprietà contrattili sulle sostanze chimiche/prodotti farmaceutici/altre proteine può essere facilmente valutato aggiungendo il reagente in questione alla soluzione del bagno. Tuttavia, mentre questa tecnica è molto utilizzata in altri modelli animali, notevolmente meno studi condotti test meccanici su fibre scuoiate da biopsie muscolari umane^17,18,19. Uno dei motivi è che gli strumenti e i protocolli di biopsia sono progettati per rimuovere il maggior tessuto muscolare possibile con meno riguardo al livello di danni strutturali subiti durante l'estrazione dei tessuti. Infatti, un recente protocollo di biopsia suggerisce di guidare l'ago biopsia nel muscolo e raccogliere 2-4 pezzi di muscolo³. Il processo stesso fa pochi danni al DNA o al materiale proteico, ma spesso distrugge le strutture di fibre e sarcomerici in modo tale che l'attivazione delle fibre muscolari diventi instabile o impossibile. Inoltre, la lunghezza relativa delle fibre all'interno della biopsia è tipicamente breve (<2 mm) e non facilmente maneggiabile per le prove meccaniche. Per i test meccanici, le fibre ideali sono lunghe (3-5 mm) e non sono strutturalmente danneggiate.

Tecniche di estrazione dei tessuti più avanzate possono essere utilizzate per limitare i danni alle fibre. Ad esempio, un gruppo²⁰ ha approfittato di "interventi chirurgici aperti" precedentemente pianificati di avambracci (ad esempio, riparazione della frattura ossea), dove i muscoli sono stati completamente esposti e un chirurgo è stato in grado di visualizzare la struttura muscolare e analizzare attentamente campioni relativamente grandi e strutturalmente intatti di tessuto muscolare (15 mm x 5 mm x 5 mm). Questa tecnica di "biopsia aperta" è favorita quando i partecipanti sono sottoposti a una procedura precedentemente pianificata, e quindi limita il pool di potenziali partecipanti, soprattutto per gli adulti sani, dove nessun intervento chirurgico sarebbe altrimenti avvenuto. Così, molte biopsie condotte per scopi di ricerca sono fatte come una procedura ambulatoriale e il sito di incisione è mantenuto il più piccolo possibile per limitare il rischio di infezione, cicatrici, e il tempo di guarigione. Pertanto, la maggior parte blindly delle biopsie vengono raccolte alla cieca (cioè, l'operatore non è in grado di vedere l'ago di raccolta mentre passa attraverso la fascia nel muscolo). Ciò implica che la qualità della biopsia è quasi interamente basata sull'abilità e l'esperienza dell'operatore. Ogni muscolo ha le sue difficoltà durante la raccolta di tessuto, come i rischi di violare i nervi e vasi sanguigni, la selezione di una profondità di raccolta ideale e la posizione, e decidere su una posizione del corpo appropriata per mantenere il muscolo il più lento possibile. Sfortunatamente, la maggior parte delle competenze specifiche del muscolo non sono scritte e quindi ogni medico deve "reinventare la ruota" quando esegue biopsie sui muscoli nuovi per loro. Questa mancanza di esperienza di solito porta a diverse collezioni con bassa qualità fino a quando il medico identifica le migliori pratiche per le biopsie su quel muscolo. I medici alle prime armi spesso imparano l'abilità attraverso conversazioni con i loro colleghi più esperti, ma esistono relativamente pochi testi informativi e peer-reviewed sulla questione, soprattutto per i muscoli che non sono tradizionalmente utilizzati per la raccolta della biopsia. Se consideriamo le informazioni di cui sopra, insieme alla difficoltà di reclutare volontari umani per le biopsie, è chiaro che sono necessarie ulteriori informazioni didattiche che massimizzino le possibilità di successo per ogni partecipante.

Così, lo scopo di questo documento era quello di presentare una tecnica di biopsia muscolare che fornisce protocolli per la raccolta di successo di biopsie muscolari con lunghi frammenti di fibra non danneggiati per i test meccanici. Le biopsie muscolari umane sono di solito eseguite su, e la maggior parte del materiale di formazione biopsia è su, il musculus vastus lateralis. La sua dimensione muscolare relativamente grande e la posizione superficiale rispetto alla pelle consente la raccolta di un adeguato tessuto muscolare, riducendo al minimo il disagio del paziente e il trauma^{fisico 1,21}. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni all'utilizzo dei vastus lateralis per gli studi di formazione longitudinale. Ad esempio, durante i protocolli sperimentali che includono un programma di formazione, i partecipanti devono astenersi da una formazione aggiuntiva al di fuori dello studio per un periodo che spesso si estende per 2-6 mesi. Per gli atleti, questo spesso non è possibile, in quanto il vastus lateralis è di solito allenato durante gli esercizi tipici (ad esempio, squat, salti), o è generalmente utilizzato per lo sport (ad esempio, corsa, ciclismo). Queste esperienze di allenamento separate lontano dall'obiettivo dello studio possono causare adattamenti muscolari che alterano la meccanica muscolare, l'architettura e la fisiologia in modo tale che sia difficile o impossibile conoscere il vero effetto del protocollo sperimentale dello studio sulle proprietà muscolari. Per questi tipi di studi, sarebbe l'ideale per selezionare un muscolo bersaglio che spesso non è al centro dei reggimenti di formazione. Il musculus tibialis anteriore (TA) è un muscolo bersaglio ideale che soddisfa i requisiti di cui sopra. Inoltre, gli interventi di formazione possono essere mirati verso l'ATA utilizzando approcci controllabili, come ad esempio con l'uso di un dinamometro. Non c'è quasi nessun materiale di allenamento relativo a una biopsia muscolare TA. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo modificato per raccogliere biopsie muscolari relativamente intatte dall'TA.

Protocollo

NOTA: Di seguito, delineamo un protocollo per raccogliere le fibre meccanicamente non danneggiate dal TA di volontari che sono stati arruolati in uno studio in corso separato. Questo protocollo è simile a quello descritto da Shanely et al.³, che hanno descritto la tecnica modificata bergstrom in vastus lateralis. Le informazioni qui presentate sono state perfezionate dal nostro gruppo di ricerca, ma potrebbero non essere ideali per tutti i gruppi di laboratorio o le configurazioni organizzative. Diamo solo linee guida, e suggerisce fortemente che i laboratori nuovi alla raccolta di biopsia consultano gruppi di laboratorio esperti prima di tentare qualsiasi sperimentazione umana.

Tutti gli studi condotti in questo documento sono stati approvati dal Comitato Etico della Facoltà di Scienze dello Sport presso l'Università Ruhr Bochum. I partecipanti hanno dato il consenso informato scritto gratuito prima di partecipare allo studio.

1. Preparazione sperimentale

1. Valutare i criteri di esclusione durante l'assunzione della storia medica dettagliata del partecipante durante la consultazione dei partecipanti (vedi sotto).
   1. Escludere i partecipanti se hanno subito una lesione al muscolo bersaglio durante le 6 settimane che precondo alla biopsia. Assicurarsi che i partecipanti siano generalmente sani, consapevoli di nessun muscolo o disturbi della coagulazione, e non sono attualmente su farmaci che causano l'assottigliamento del sangue (ad esempio, aspirina).
      NOTA: Qui, abbiamo selezionato i partecipanti che erano moderatamente attivi e abbiamo ordinato loro di astenersi da esercizi intensivi o non abituati alle gambe almeno 3 giorni prima della biopsia. Tuttavia, per altre questioni di ricerca, questi criteri possono cambiare.
2. Aderendo alla sterilizzazione e alle tecniche asettiche, come regolato dal diritto tedesco e dalla pratica comune e supervisionato dal medico di squadra^22,23. Questa procedura può spesso essere condotta come una procedura "letto" o in una suite chirurgica ambulatoriale. Consultare l'organismo di regolamentazione locale per una guida.
3. Comporre il team di biopsia. Suggeriamo che il team di biopsia includa 4 persone. Un medico (o un individuo addestrato nella raccolta di biopsia), un assistente medico che lavora con il medico, un assistente che monitora e interagisce con il partecipante e un assistente che gestisce la biopsia muscolare subito dopo l'estrazione. Con questi numeri, la cura rapida del paziente può essere somministrata se si verifica un'emergenza medica durante la procedura. Se a proprio agio con la procedura, il team potrebbe essere composto solo da due persone: il medico e l'assistente medico, che insieme si occuperebbe contemporaneamente della cura del paziente e dell'elaborazione dei tessuti.
4. Fare in modo che il partecipante incontri il responsabile/medico del progetto per esaminare, discutere e firmare il modulo di consenso dell'utente. Prendere una storia medica dettagliata (allergie, lesioni o interventi chirurgici all'arto inferiore e TA) ed escludere il partecipante se soddisfano uno qualsiasi dei criteri di esclusione. Discutere accuratamente il recupero e l'igiene dell'incisione.
   1. Spiegare al partecipante che saranno doloranti ma in grado di andare in giro subito dopo la procedura; camminare giù per pendii o scale è spesso scomodo per le prime 48 ore, con l'attività completa di solito tornare dopo 72 ore. Infine, spiegare che, per limitare l'infezione e le abrasioni meccaniche, il sito di incisione deve rimanere bendato per almeno 1 settimana e mantenuto pulito.

2. Visualizza il Tibialis anteriore con gli ultrasuoni in modalità B

1. Istruisci il partecipante a sdraiarsi in una comoda posizione supina e rilassare il più possibile i muscoli delle gambe. Utilizzare un dispositivo su cui su come fare (vedi sotto) o fare in modo che l'assistente tena la caviglia in una posizione leggermente dorsiflessa per imitare ciò che verrà fatto durante la biopsia.
   NOTA: È importante che il partecipante abbia un TA rilassato in modo che si replica le caratteristiche muscolari durante la procedura. Durante l'esame, chiedere al partecipante di contrarre e rilassare il muscolo in modo che i cambiamenti nell'architettura muscolare possono essere notati.
2. Utilizzare una sonda ad ultrasuoni per visualizzare i compartimenti superficiali e profondi dell'TA, per esaminare l'architettura muscolare e decidere sulla profondità di inserimento e sull'angolo di attacco dell'ago (Figura 2A-B). Indicare punti di riferimento sulla pelle.
   1. Dare particolare attenzione alla selezione di un'area di destinazione che evita le vene principali, arterie, o nervi.
   2. Valutare la sezione trasversale del muscolo, con l'obiettivo di identificare l'aponeurosi centrale all'interno della pancia muscolare TA (circa 1/3 della gamba, distale al ginocchio e 2 cm lateral della cresta tibiale)(Figura 2B). Registrare la posizione e la profondità dell'agruurosi centrale (di solito 1,5-3 cm) in modo da poter fare attenzione a non guidare l'ago di raccolta (Bergstrràm) oltre questo punto.
   3. Posizionare la sonda ad ultrasuoni nell'orientamento prossimale-distale sulla posizione di destinazione e visualizzare la pennazione del fascicle e lo spessore muscolare (Figura 2A). Utilizzare queste informazioni per aiutare a guidare con successo (ciecamente) l'ago di raccolta nella pancia muscolare. Salvare le immagini del sito di destinazione in entrambi i piani per riferimento futuro durante la procedura chirurgica.
3. Con queste informazioni, creare un piano per il movimento dell'ago verso l'area di destinazione.
   1. Pianificare l'incisione di 1-3 cm distale dall'area della biopsia bersaglio. Dopo che l'ago è passato nel muscolo, ruotare l'ago ad un angolo del 45% rispetto alla pelle lungo il lungo asse dell'arto, e quindi guidato proximally verso l'area della biopsia. Questa strategia limita la possibilità di guidare l'ago nell'aponeurosi centrale, se l'ago viene spinto troppo forte. Inoltre, l'ago può essere azionato distally o proximally, a seconda della mano dell'operatore dell'ago.

3. Procedura di biopsia

1. Istruire il partecipante a posare supina sul tavolo operatorio e rilassare i muscoli delle gambe. Assicurarsi che la linea di vista del partecipante al sito di biopsia sia bloccata da una tenda.
   1. Rimuovere la tensione passiva dalla pancia muscolare inserendo l'arto del partecipante in un dispositivo che fissa la caviglia in una posizione leggermente dorsiflexed (0-5 gradi da neutro; (Figura 3). Chiedere al paziente se possono ancora rilassare il loro muscolo, come troppa dorsiflexion può potenzialmente rendere difficile rilassarsi.
      NOTA: Abbiamo scoperto che la raccolta di biopsie da un piede dorsiflexed, non più di 5 gradi di neutro (cioè la suola del piede perpendicolare al gambo) produce biopsie più coerenti e più grandi rispetto agli angoli della caviglia più plantari. Il dispositivo che mantiene la caviglia dorsiflexed è un dispositivo su cui su come fare. Tuttavia, un numero qualsiasi di dispositivi (economici) può essere fabbricato che ancora producono il risultato desiderato.
2. Rasare, pulire e disinfettare l'area di incisione selezionata, secondo le pratiche standard²⁴.
   NOTA: L'area "pulita" del partecipante è di circa 20 cm prossimale-distale e 10 cm mediale-laterale del sito di incisione proposto. Tuttavia, consultare sempre le normative nazionali e/o dell'istituzione (se presenti) su questo argomento. Il protocollo di disinfezione include lo scrubbing della pelle pulita e poi la disinfezione quattro volte con l'uso liberale di spray di disinfezione di grado medico. Se il partecipante lascia la tabella per qualsiasi motivo, il protocollo di disinfezione deve essere riavviato.
3. Somministrare un'iniezione suprafascial di 1,5 cc di 2% Xylocitina con epinefrina presso il sito di biopsia, che funziona come anestetico locale e vasoconstrictor. Attendere il tempo di influenza assegnato di 20-30 min.
   NOTA: Questi farmaci sono miotossici e quindi non devono mai essere iniettati nel muscolo, solo il tessuto sottocutaneo. Come reazione alla vasoconstriction, l'area del sito di iniezione può diventare bianca (su toni della pelle più chiari) o grigia (toni della pelle più scuri).
4. Confermare l'effetto farmaco con piazzole della pelle e pokes delicati con un bisturi sterile.
5. Nel sito di biopsia precedentemente marcato, fare un'incisione prossimale-distale di 1 cm con un bisturi sterile che taglia la pelle e la fascia, esponendo la pancia muscolare. Fare attenzione a tagliare completamente la fascia perché l'ago è smussato e non passerà attraverso la fascia.
6. Spingere l'ago della biopsia 0,5-1,0 cm nel muscolo con un orientamento perpendicolare alla pelle (Figura 2C, 2E).
   NOTA: L'operatore sentirà un cambiamento nella tensione necessaria per guidare l'ago attraverso i diversi tipi di tessuto. Il tessuto adiposo è facile, la fascia è la più dura e il muscolo è in mezzo (ma può essere variabile, in base al partecipante).
7. Orientare l'ago in una posizione di 45 gradi di angolo verso la pelle, lungo l'asse lungo della gamba (Figura 2D, 2F). Spingere l'ago di altro 1-2 cm nel muscolo fino a quando la punta dell'ago è nella posizione di destinazione all'interno del muscolo.
   NOTA: Il medico deve utilizzare le immagini ecografiche salvate per tenere conto della variazione individuale delle dimensioni muscolari. Poiché l'incisione è abbastanza grande da inserire l'ago, il medico guida l'ago alla cieca attraverso la pelle. C'è una "sensazione" che l'operatore di biopsia guadagna con l'esperienza. Un principiante deve imparare l'abilità da un operatore di biopsia addestrato (maggiori informazioni su questo nella discussione).
8. Fissare la siringa e il tubo da 100 mL all'ago della biopsia (Figura 1G). Applicare l'aspirazione sull'ago bergrbrio tirando lo stantuffo della siringa di circa 15-20 mL per produrre una pressione negativa nell'ago e succhiare il tessuto muscolare nella finestra dell'ago. Quindi, accise il muscolo con una rapida spinta del trocar sopra la finestra dell'ago.
   NOTA: Prima e durante l'aspirazione, a volte è utile posizionare una leggera pressione sulla pelle immediatamente sopra la finestra dell'ago per aiutare a spingere il muscolo nell'ago.
9. Rimuovere delicatamente l'ago dalla gamba, ruotando lentamente. Ci dovrebbe essere solo resistenza alla luce durante l'estrazione dell'ago. Se c'è più resistenza, questo può indicare un taglio parziale della biopsia. Ciò si verifica, restituire la necessità alla posizione di destinazione e ritentare la raccolta dei tessuti.
10. Spingere il tessuto a estato verso la finestra dell'ago utilizzando il ramrod interno.
11. Rimuovere con attenzione il campione dall'ago.
    NOTA: Immergere l'ago nella soluzione di raccolta (vedi sezione di preparazione della fibra) spesso allontana la biopsia dall'ago. Inoltre, la siringa può essere utilizzata per guidare l'aria attraverso l'ago e spingere fuori il campione. Queste tecniche rimuovono la necessità di toccare fisicamente la biopsia con una pinzetta e riducono la possibilità di danni. Se strumenti, mani (guantate o meno) o soluzioni non sterili entrano in contatto con l'ago, l'ago non può essere utilizzato ulteriormente durante la procedura. Pertanto, se è necessaria una seconda biopsia immediata, è necessario utilizzare un nuovo ago sterile. Questo spesso si verifica, quindi è una buona pratica per mantenere diversi aghi sterili in riserva.
12. Identificare il tessuto come muscolo e non adiposo o tessuto connettivo. Tessuto muscolare è facilmente identificabile da altri tessuti a causa del suo colore rosso profondo (Figura 4A). A volte, il tessuto raccolto non è muscolo, ma grasso o tessuto connettivo.
    1. Se viene raccolta una quantità adeguata di tessuto muscolare, continuare il protocollo. Se non c'è abbastanza muscoli, provare di nuovo la biopsia.
    2. Se è necessaria una seconda biopsia, monitorare attentamente il partecipante, poiché una seconda spinta ad ago occasionalmente rende il partecipante più scomodo del primo.
13. Lavare immediatamente i campioni muscolari in una soluzione di raccolta e prepararsi per esperimenti su singole fibre (vedere la gestione e lo stoccaggio della biopsia muscolare).
    1. Avere un assistente esperto controllare la qualità del campione (vedi sotto) e valutare la necessità di eseguire una seconda biopsia. Un assistente separato prende la biopsia per l'elaborazione, mentre il resto del team continua con il partecipante.
14. Chiudere il sito di incisione.
    1. Chiudere la ferita da incisione con nastro leucoro sterile. Utilizzare uno o più pezzi per unire i bordi del sito di incisione ponendoli perpendicolarmente al lungo asse dell'incisione, e quindi posare ulteriori strisce in un modello a forma di stella per proteggersi dal caricamento multidirezionale.
       NOTA: una corretta gestione di questo passaggio ridurrà le cicatrici. Suturare la ferita può essere fatto, ma non è necessario. Altre opzioni includono colla ferita.
    2. Posizionare la medicazione sterile della ferita (ad esempio, Leucomed T plus) sul sito di incisione per proteggersi dalle infezioni.
    3. Avvolgere la gamba con bende elastiche coesive (ad esempio, Unihaft) per limitare il sanguinamento iniziale e proteggere contro l'impatto meccanico esterno.
    4. Avvolgere la gamba con bende di compressione acrilastica per evitare sanguinamento e proteggere le bende più profonde da diventare sciolti o distrutti.

4. Cura post-biopsia

1. Chiedere al partecipante di andare in giro subito dopo la procedura. Ci sarà dolore localizzato. Indicare al partecipante di camminare nel modo più normale possibile.
2. Indicare al partecipante di non rimuovere le bende o lasciare che l'acqua immerga le bende. Devono essere tenuti in servizio per almeno: un giorno per la benda acrilastica, tre giorni per la benda elastica coesa e sette giorni per la medicazione della ferita. Informare il partecipante che possono essere ribandati se necessario.
   1. Adattare la cura post-biopsia di un partecipante alle esigenze dell'individuo. Avere un assistente o un medico qualificato valutare il partecipante e fare un piano di cura post-biopsia appropriato. Per questa procedura, suggeriamo che qualsiasi ulteriore test neuromuscolare in vivo della TA sia separato da almeno una settimana dalla biopsia.

5. Gestione e stoccaggio della biopsia muscolare

1. Dopo l'estrazione dei tessuti, posizionare immediatamente il tessuto in una fiala di 5 mL contenente soluzione di raccolta del rigore (in mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl₂ (2), EGTA (1), compressa inibitore della proteasi (1), pH 7.0) e agitare leggermente per 4-6 min per lavare il sangue.
2. Scambiare la soluzione di rigor per il rigore fresco, agitare leggermente per 4-6 min, quindi conservare a 4 gradi centigradi per 4-6 h per consentire lo scambio di soluzione di stoccaggio proteaie-inibitore e sangue.
3. Soluzione di cambio rigore per il rigore notturno (in mM: Tris (50), KCl (2), NaCl (100), MgCl₂ (2), EGTA (1), compressa inibitore della proteasi (1), 50:50 glicerolo, pH 7.0) e conservare a 4 gradi centigradi per 12-18 h.
4. Scambiare il rigore notturno per il rigore di raccolta 50:50:glicerolo e conservato a -20 gradi centigradi per un massimo di 3 mesi, o un anno in un congelatore di -80 gradi centigradi.
   NOTA: Questo processo permea la membrana in fibra che consente l'aggiunta manuale di calcio all'interno e all'uscita dalla cellula. Questo processo richiede tempo e potrebbe essere diverso tra diversi muscoli e specie.

Risultati

L'impegno di tutto il tempo per un partecipante è stato di circa un'ora (10 min di consultazione, 10 min ultrasuoni, 20 min di preparazione chirurgica e somministrazione anestetica, 10 min di chirurgia e 10 minuti di recupero). Spesso, i partecipanti inconsciamente attivato il loro TA e aveva bisogno di promemoria coerenti per mantenere il muscolo il più rilassato possibile. Quando l'ago della biopsia era all'interno del muscolo, i partecipanti di solito hanno riportato una sensazione di "pressione" unica nella zona in...

Discussione

In questa relazione, abbiamo descritto una tecnica per la biopsia del tessuto muscolare strutturalmente intatto da TA. Abbiamo scoperto che questa procedura produce un contenuto accettabile di fibre muscolari utilizzabili (5-10 preparazioni di fascio di fibre per 50 mg di tessuto raccolto) per test meccanici. Inoltre, avevamo abbastanza tessuto per gli esperimenti meccanici, genetici e proteomici di follow-up.

Ci sono diversi metodi tipicamente utilizzati per la raccolta di biopsie muscolari

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 guage subcutaneous needle with 2 ml glass syringe	B. Braun Melsungen AG Carl-Braun-Straße 1 34212 Melsungen, Hessen Germany	4606027V	Drug administration
5mm Berstöm needle	homemade	N/A	Tissue collection. Similar to other Berstöm needles
Acrylastic	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	269700	elastic compression bandage
Complete protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics, Mannheim, Germany	11836145001	Protease inhibitor tabeletes added to all solutions that hold muscle tissue.
Cutasept	PAUL HARTMANN AG Paul-Hartmann-Straße 12 89522 Heidenheim Germany	9805630	Disenfectant spray for the skin
Leucomed T plus	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	7238201	Transparent wound dressing with wound pad to seal the wound and protect against infection
Leukostrip	Smith and Nephew medical Limitied 101 Hessle road, Hull Great Britain	66002876	wound closure
Surgical disposable scalpels	Aesculap AG Am Aesculap-Platz 78532 Tuttlingen Germany	BA200 series	Incision
Unihaft cohesive elastic bandage	BSN medical GmbH 22771 Hamburg	4589600	cohesive elastic bandage that protects against mechanical impact
Xylocitin 2% with Epinephrin	Milbe GmbH Münchner Straße 15 06796 Brehna Germany	N/A	Controlled substance anesthesia, vasoconstriction