RNA-RNAと長鎖ノンコーディングRNAとの直接相互作用に関与するRNAの同定

要約

使いやすいRNAプルダウンプロトコールは、長いノンコーディングRNAとの直接RNA/RNA相互作用に関与するRNAを同定するために設計されています。このプロトコルは、RNA/RNA相互作用のみを架橋するための固定剤としてソラレンを使用し、RNAシーケンシングと組み合わせると、長いノンコーディングRNAの全直接RNAインタラクトームを提供します。

要約

今日、生理学および病態生理学における長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)による役割の増大により、分子パートナー、DNA、タンパク質、および/またはRNAを同定することにより、それらのインタラクトームを特徴付けることが重要になっています。後者は、タンパク質が関与するネットワークを通じてlncRNAと相互作用することができますが、RNA/RNAの直接的な相互作用にも関与することができます。そこで、RNA/RNA相互作用のみを架橋する分子であるpsoralenを用いて、lncRNAと直接的なRNA/RNA相互作用に関与するRNAを同定できる、使いやすいRNAプルダウン法を開発しました。lncRNA二次構造のバイオインフォマティクスモデリングにより、内部塩基対形成の可能性が低い領域に対して強い親和性を持ついくつかの特異的アンチセンスDNAオリゴヌクレオチドプローブを選択することができました。設計された特定のプローブは、lncRNAの長さ全体にわたってアクセス可能な領域を標的としていたため、RNA相互作用ゾーンはlncRNAの配列で描写することができました。ハイスループットRNAシーケンシングと組み合わせることで、このプロトコルは、目的のlncRNAの直接RNAインタラクトーム全体の研究に使用できます。

概要

長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)は、長さが200ヌクレオチドを超えるノンタンパク質コード転写産物です。その数は増え続けており、人間では58,000人を超えています。さらに、生理学および病態生理学におけるそれらの重要な役割は、それらがそれらの調節機能を実装することを可能にするそれらの分子パートナーを特徴付けることを不可欠にします。実際、lncRNAの機能を理解するための1つのアプローチは、各lncRNAの相互作用する分子パートナーの検出です。

lncRNAの分子標的は、DNA、タンパク質、RNAのいずれかであり、それらを同定するために様々な技術が開発されてきました。この点で、lncRNAと相互作用するタンパク質の同定は、目的のタンパク質に対する抗体を使用してlncRNAを特異的にプルダウンするさまざまなRNA-免疫沈降(RIP)手順を含む、さまざまなプロトコルの目的です(^{レビュー1}用)。Capture Hybridization Analysis of RNA Targets²(CHART)やChromatin Isolation by RNA Purification³(ChIRP)などの他の手法では、関連するタンパク質複合体とともにlncRNAをプルダウンすることができます。これらの後者の技術では、lncRNAが餌として使用されます。CHARTとChIRPは、lncRNAの占有率を示すゲノムマップを同定する強力な技術でもあります^2,3。さらに、これらのRNAプルダウン法により、lncRNAのRNAパートナーを同定することが可能になる。lncRNAによって標的とされるRNAの捕捉を可能にする手順が記載されている。アンチセンスDNAビオチン化オリゴヌクレオチドプローブは、lncRNA二次構造のバイオインフォマティクスモデリングによって決定される内部塩基対形成の可能性が低い領域に対して設計されています⁴。しかし、この手順では、RNAパートナーがタンパク質ネットワークを介して間接的に相互作用するか、またはRNA/RNAとlncRNAとの直接的な相互作用を介して直接相互作用するかを区別するものではありません。ソラレン誘導体との架橋は、塩基対^形成5によって媒介される直接RNA/RNA相互作用を選択するための選択方法であることが示されています。ソラレン誘導体は、実際に二本鎖DNAまたはRNAにインターカレートし、UV光(365nm^)を照射した後にピリミジンを共有結合させることができます6。ビオチン化オリゴヌクレオチドプローブを用いたRNAプルダウンとソラレンとの架橋を結合させることは、RNA/RNAとlncRNAとの直接的な相互作用に関与するRNAを同定するためにここで提案されている使いやすい手順です。さらに、この手順により、lncRNAの長さに沿って設計された異なるオリゴヌクレオチドプローブを使用する場合、lncRNAの配列中のRNA相互作用ゾーンを描写することができます。

プロトコル

1. プローブ設計

1. 専用の無料ウェブサーバーソフトウェア(RNAstructureソフトウェア⁷ またはVienna RNA web suite⁸)を使用して、lncRNAの二次構造を生成します。内部塩基対形成の可能性が低い領域を選択し、このlncRNAの異なる領域に対して25塩基長のアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを設計します。
2. 無料のアカデミックソフトウェアであるAmplifX(https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr)で設計されたすべてのオリゴヌクレオチドをチェックして、これらのプローブに関するさまざまな情報を取得し、最適なパラメーターを持つものを選択してください。
   注意: 次のように、ソフトウェアの最適なパラメータを確認してください。GCの割合:40〜60%、3 '安定性、複雑さ、自己端ダイマー:「良好」。融解温度_(Tm)は、親和性が室温で行われるため、重要ではありません。
3. アライメント検索ツール(Blastなど)を使用して、選択したアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブが、選択した細胞で発現する他のRNAのヌクレオチド配列を認識しないことを確認します。
   1. 25塩基長の非特異的DNAオリゴヌクレオチドプローブを設計します。このプローブが、目的のlncRNAや目的のゲノム内の他のRNA配列に対して親和性を示さないことを確認してください。
4. すべてのプローブは、3'末端にビオチン修飾を添加し、トリエチレングリセロールスペーサー(TEG)を添加してご注文ください。このスペーサーは、立体障害を避けるためにオリゴビオチン間距離を長くします。
   注:最適な結果を得てプルダウンの結果の特異性を評価するには、同じ領域に少なくとも2つの異なるアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブを設計し、それらの効率を実験的に比較します。

2. クロスリンク

1. 細胞(例えば、この実験で使用したGH4C1細胞)を78.5 cm² 細胞培養皿で合流するまで増殖させます。細胞培養培地を取り除いた後、Ca²⁺ およびMg²⁺ (PBS⁺)を豊富に含む5 mLの冷リン酸緩衝生理食塩水で細胞層をすすぎ、PBS⁺ で0.1 mg/mLの濃度で調製した3 mLのソラレン由来分子(4′Aminomethyltrioxsalen hydrochloride)溶液を加えます。
2. 培養プレートを哺乳類細胞培養インキュベーターに30分間入れ、37°C、5%CO₂で保存します。30分後、蓋を取り外し、365 nmのUVチューブから2.5 cm離れた氷の上に培養皿をUV架橋剤で10分間置きます。皿を繊細に攪拌し、さらに10分間紫外線を浴び直します。
3. 培地を吸引して廃棄し、PBS⁺ を1mL加えて細胞スクレーパーで細胞を採取し、マイクロチューブに移します。4°C、400 x g で5分間遠心分離します。上清をできるだけ取り除き、ペレットを-80°Cでストックします。

3. 細胞溶解

1. 100 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、pH 7.0、1 mM EDTA、0.5% SDS、5 μL/mL RNase阻害剤を添加して、プロテイナーゼKバッファーを調製します。
2. このバッファーに細胞ペレットを再懸濁します(1 x 10⁷ 細胞あたり約200 μL)。プロテイナーゼKを最終濃度0.1 μg/μLまで添加し、50°Cで45分間インキュベートします。 その後、95°Cで10分間インキュベートし、プロテイナーゼKを不活性化します。

4.超音波処理

1. このライセート100 μL(5.10⁶ 細胞に相当)を2本のマイクロチューブに分配し、200 μLのハイブリダイゼーションバッファー(700 mM NaCl、70 mM Tris-HCl、pH 7.0、1 mM EDTA、1.25% SDS、5 μL/mL RNase阻害剤溶液、および15%ホルムアミド)を各チューブに加えます。
2. 超音波処理器の4°C水浴にチューブを置き、30秒オフで区切られた2つのシリーズ30秒パルス(高強度)で超音波処理を開始します。
3. インプットコントロールサンプルとして使用するために20μLのサンプルを採取し、-80°Cで保存します。
   注:この超音波処理手順は、2,000ヌクレオチド⁹の範囲のRNA断片を得るために、GH4C1細胞株に対して以前に最適化されていました。他の細胞株については、超音波処理手順を最適化する必要があります。この手法が非常に長いノンコーディングRNAのRNAパートナーを研究するために行われるとき、超音波処理ステップはlncRNAの適切な回収を得るために不可欠であることが証明されています。したがって、この場合、lncRNAの長さに沿って最大4,000ヌクレオチドごとに結合部位が配置される複数のプローブを設計する必要があります。lncRNAの全長を回復させるには、いくつかの特異的プローブのプールを使用します。しかし、RNA-RNA結合に関与するlncRNAの領域を同定することが目的であれば、特定のプローブを別々に使用する必要があります。さらに、より小さなlncRNAのRNAパートナーを研究する場合は、超音波処理ステップが必要かどうかを判断するために実験を実施する必要があります。

5. RNAプルダウン

1. 1日目 - ハイブリダイゼーションステップ
   1. 150 pmol(100 μMストック溶液1.5 μL)のビオチン化特異的または非特異的プローブを各サンプルチューブに加えます。チューブローテーター上で室温(RT)(約30rpm)で攪拌しながら4時間インキュベートします。
   2. 必要な量の磁気ビーズ(すなわち、プローブハイブリダイゼーション反応の150 pmolあたり40 μLのビーズ)を取ります。マグネットサポートを使用して、ビードを商用メディアから分離します。上清を捨て、900 μLのハイブリダイゼーションバッファーでビーズを洗浄します。完了したら、磁気ビーズを同量のハイブリダイゼーションバッファーに再懸濁します。
   3. 各サンプルチューブに磁気ビーズを添加します(プローブハイブリダイゼーション反応150 pmolあたり40 μLのビーズ)。チューブローテーター上でRT(約30 rpm)の撹拌下で一晩インキュベートします。
2. 2日目 - RNA単離ステップ
   1. マグネットサポートを使用して細胞ライセートからビーズを分離します(2〜3分)。上清を捨て、ビーズを900 μLのWash buffer (0.5% SDS, 2x SSC) で洗浄し、RTのローテーター上で5分間のインキュベーションを行い、この洗浄を5回繰り返します。
   2. 最後の洗浄液を取り除いた後、ビーズに95 μLのProteinase Kバッファーを加えます。インプットサンプルを解凍し、75 μLのプロテイナーゼKバッファーを加えます。5 μL のプロテイナーゼ K を、すべてのチューブ (サンプルおよびインプットサンプル) の最終濃度 1 μg/μL まで添加します。45°Cで45分間インキュベートし、次に95°Cで10分間インキュベートします。
   3. サンプルを氷の上に保ちます。磁気担体を使用して、上清中に存在するRNAからビーズを分離します。DNase消化ステップを含むRNA精製キットでRNAを精製します。精製したRNAは-80°Cで保存してください。
      注:溶出されたRNAは、RT-qPCRまたはハイスループットRNAシーケンシングにかけ、濃縮された転写産物を検出することができます。RNAシーケンシング解析では、STAR¹⁰ やHISAT2¹¹などのフリーソフトウェアを使用してリードを目的のゲノムにアライメントし、FeatureCounts¹² またはHTSeq count¹³を使用して定量化を行うことができます。

結果

lncRNA、タンパク質、RNA、DNAと相互作用する細胞成分であるlncRNAインタラクトームの解明は、lncRNAの機能を理解する上で非常に重要です。lncRNAインタラクトームを特徴付けるために、RIP、CHART、ChIRP、RNAプルダウンなど、さまざまな技術が開発されています。後者はlncRNAのRNA標的を同定するのに強力であることが示されていますが、これらの手順は、RNAパートナーがタ?...

ディスカッション

多数のlncRNAは、mRNAとの相補的な塩基対形成を通じてその機能を果たします。したがって、lncRNAの直接RNAインタラクトームを特徴付けることを可能にする手順を開発することが重要です。そこで、架橋試薬としてのソラレンの使用とRNAプルダウン技術を組み合わせた手順が開発されました。

記載されているRNAプルダウンプロトコルでは、アンチセ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′-Aminomethyltrioxsalen hydrochloride	Sigma	A4330	Crosslinker reagent
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	Sonicator
Biotynilated probes	IDT		Oligonucleotide probes
CFX96 Real Time System	BioRad	4351107	qPCR apparatus
DNA Olignucleotides	IDT		Primers for qPCR
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	Magnetic streptavidin beads
Formamide	Thermo-Fisher	15515-026	Formamide
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725124	qPCR reagent
Proteinase K	Sigma	P2308	Proteinase K
RNA to DNA	Thermo-Fisher	4387405	Reverse transcription kit
RNA XS purification kit	Macherey-Nagel	740902	RNA purificationkit
RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	RNAse inhibitor
Tube Rotator	Stuart	SB2	Eppendorf tube rotator
UV Stratalinker 1800	Stratagene	#400072	UV crosslinker