Identification d’ARN engagés dans une interaction directe ARN-ARN avec un ARN long non codant

Résumé

Un protocole de pull-down d’ARN facile à utiliser est conçu pour l’identification des ARN engagés dans une interaction directe ARN/ARN avec un ARN non codant long. Le protocole utilise le psoralène comme fixateur pour réticuler uniquement les interactions ARN/ARN et fournit l’intégralité de l’interactome direct de l’ARN d’un long ARN non codant lorsqu’il est couplé au séquençage de l’ARN.

Résumé

Le rôle croissant attribué aujourd’hui aux ARN longs non codants (ARNlnc) dans la physiologie et la physiopathologie rend crucial la caractérisation de leur interactome en identifiant leurs partenaires moléculaires, ADN, protéines et/ou ARN. Ces derniers peuvent interagir avec l’ARNlnc par le biais de réseaux impliquant des protéines, mais ils peuvent également être engagés dans des interactions directes ARN/ARN. Nous avons donc développé une procédure d’extraction d’ARN facile à utiliser qui permet d’identifier les ARN engagés dans une interaction directe ARN/ARN avec un ARNlnc à l’aide du psoralène, une molécule qui réticulait uniquement les interactions ARN/ARN. La modélisation bioinformatique de la structure secondaire de l’ARNlnc a permis de sélectionner plusieurs sondes oligonucléotidiques d’ADN antisens spécifiques avec une forte affinité pour les régions présentant une faible probabilité d’appariement de bases internes. Étant donné que les sondes spécifiques qui ont été conçues ciblaient des régions accessibles sur toute la longueur de l’ARNlnc, les zones d’interaction de l’ARN ont pu être délimitées dans la séquence de l’ARNlnc. Lorsqu’il est couplé à un séquençage d’ARN à haut débit, ce protocole peut être utilisé pour l’ensemble des études directes d’interactome d’ARN d’un ARNlnc d’intérêt.

Introduction

Les ARN longs non codants (ARNlnc) sont des transcrits non codant pour des protéines de plus de 200 nucléotides. Leur nombre ne cesse d’augmenter, plus de 58 000 chez l’homme. De plus, leur rôle crucial en physiologie et en physiopathologie rend essentiel la caractérisation de leurs partenaires moléculaires qui leur permettent de mettre en œuvre leurs fonctions régulatrices. En fait, une approche pour comprendre les fonctions des ARNlnc est la détection des partenaires moléculaires en interaction de chaque ARNlnc.

Les cibles moléculaires des ARNlnc peuvent être de l’ADN, des protéines ou des ARN, et diverses techniques ont été développées pour les identifier. À cet égard, l’identification des protéines interagissant avec les ARNlnc est l’objectif de divers protocoles, y compris différentes procédures d’immunoprécipitation d’ARN (RIP) dans lesquelles un anticorps contre la protéine d’intérêt est utilisé pour extraire spécifiquement les ARNlnc (pour une revue¹). D’autres techniques telles que l’analyse par hybridation capture des cibles d’ARN² (CHART) ou l’isolement de la chromatine par purification d’ARN³ (ChIRP) permettent d’extraire les ARNlnc avec les complexes protéiques associés. Dans ces dernières techniques, l’ARNlnc est utilisé comme appât. CHART et ChIRP sont également des techniques puissantes pour identifier les cartes génomiques montrant l’occupation de lncRNA ^2,3. De plus, ces méthodes d’extraction d’ARN permettent d’identifier les partenaires ARN d’un ARNlnc. Une procédure qui permet la capture d’ARN ciblés par un ARNlnc a été décrite. Les sondes oligonucléotidiques biotinylées de l’ADN antisens sont conçues contre des régions de faible probabilité d’appariement interne des bases, telles que déterminées par la modélisation bioinformatique de la structure secondaire de lncRNA⁴. Cependant, cette procédure ne fait pas de distinction entre les partenaires de l’ARN qui interagissent indirectement via un réseau protéique ou directement via des interactions directes ARN/ARN avec l’ARNlnc. Il a été démontré que la réticulation avec des dérivés du psoralène est la méthode de choix pour sélectionner les interactions directes ARN/ARN médiées par l’appariement des bases⁵. Les dérivés du psoralène sont en effet capables de s’intercaler dans l’ADN ou l’ARN double brin et de lier de manière covalente les pyrimidines après irradiation à la lumière UV (365 nm)⁶. Le couplage de l’extraction de l’ARN à l’aide de sondes oligonucléotidiques biotinylées avec la réticulation avec le psoralène est une procédure facile à utiliser proposée ici pour l’identification des ARN engagés dans des interactions directes ARN/ARN avec un ARNlnc. De plus, cette procédure peut permettre de délimiter les zones d’interaction ARN dans la séquence de l’ARNlnc si différentes sondes oligonucléotidiques conçues sur toute la longueur de l’ARNlnc sont utilisées.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Conception de la sonde

1. Générez la structure secondaire de l’ARNlnc à l’aide d’un logiciel de serveur web gratuit spécialisé : RNAstructure software⁷ ou Vienna RNA web suite⁸. Sélectionnez les régions qui présentent une faible probabilité d’appariement interne des bases et concevez des sondes oligonucléotidiques antisens de 25 bases de long pour différentes régions de cet ARNlnc.
2. Vérifiez tous les oligonucléotides conçus avec le logiciel académique gratuit, AmplifX (https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr), afin d’obtenir différentes informations sur ces sondes et de choisir celles avec les meilleurs paramètres.
   REMARQUE : Vérifiez les paramètres optimaux sur le logiciel comme suit. Pourcentage de GC : entre 40 et 60 %, stabilité 3', complexité, dimère d’auto-fin : « bon ». La température de fusion (T_M) n’a pas d’importance car l’affinité est réalisée à température ambiante.
3. À l’aide d’un outil de recherche d’alignement (c.-à-d. Blast, etc.), assurez-vous que les sondes oligonucléotidiques antisens sélectionnées ne reconnaissent pas les séquences nucléotidiques d’un autre ARN exprimé dans les cellules de votre choix.
   1. Concevoir une sonde oligonucléotidique d’ADN non spécifique de 25 bases de long. Assurez-vous que cette sonde ne montre pas d’affinité pour l’ARNlnc d’intérêt ni pour aucune autre séquence d’ARN dans le génome d’intérêt.
4. Commandez toutes les sondes avec une modification de la biotine ajoutée à leur extrémité 3' avec un espaceur de triéthylèneglycérol (TEG). Cette entretoise augmente la distance oligo-biotine afin d’éviter les entraves stériques.
   REMARQUE : Pour obtenir un résultat optimal et évaluer la spécificité des résultats du pull-down, concevez au moins deux sondes oligonucléotidiques antisens différentes dans la même région, puis comparez leur efficacité expérimentalement.

2. Réticulation

1. Cultivez des cellules (par exemple, des cellules GH4C1 utilisées dans cette expérience) jusqu’à la confluence dans des boîtes de culture cellulaire^{de 78,5 cm 2} . Après avoir retiré le milieu de culture cellulaire, rincez la couche cellulaire avec 5 ml de solution saline froide tamponnée au phosphate enrichie de Ca²⁺ et de Mg²⁺ (^PBS+) et ajoutez 3 ml de solution de molécule dérivée du psoralène (chlorhydrate de 4′Aminomethyltrioxsalen) préparée dans du PBS⁺ à une concentration de 0,1 mg/mL.
2. Placez la plaque de culture pendant 30 min dans un incubateur de culture de cellules de mammifères à 37 °C avec 5 % de CO₂. Après 30 min, retirez le couvercle, placez les plats de culture sur de la glace à 2,5 cm des tubes UV 365 nm dans un réticulant UV pendant 10 min. Agitez délicatement la vaisselle et rétablissez l’exposition aux UV pendant une période supplémentaire de 10 min.
3. Jeter le milieu par aspiration, ajouter 1 mL de PBS⁺ pour prélever les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférer dans un microtube. Centrifugeuse à 4 °C, 400 x g pendant 5 min. Retirez autant de surnageant que possible et stockez les granulés à -80 °C.

3. Lyse cellulaire

1. Préparez le tampon Proteinase K en ajoutant 100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, un pH de 7,0, 1 mM d’EDTA, 0,5 % de SDS et 5 μL/mL d’inhibiteur de RNase.
2. Remettre les pastilles de cellules en suspension dans ce tampon (environ 200 μL par 1 x 10⁷ cellules). Ajouter la protéinase K à une concentration finale de 0,1 μg/μL et incuber pendant 45 min à 50 °C. Incuber ensuite 10 min à 95 °C, pour inactiver la protéinase K.

4. Sonication

1. Répartir 100 μL de ce lysat (correspondant à 5,10⁶ cellules) dans deux micro-tubes et ajouter 200 μL de tampon d’hybridation (700 mM de NaCl, 70 mM de Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM d’EDTA, 1,25 % de SDS, 5 μL/mL de solution d’inhibiteur de RNase et 15 % de formamide) dans chaque tube.
2. Placez les tubes dans le bain-marie à 4 °C d’un sonicateur et démarrez la sonication avec 2 séries d’impulsions de 30 s (haute intensité) séparées par 30 s de désactivation.
3. Prélever 20 μL d’échantillons pour servir d’échantillons de contrôle d’entrée et les stocker à -80 °C.
   REMARQUE : Cette procédure de sonication a été précédemment optimisée pour la lignée cellulaire GH4C1 afin d’obtenir des fragments d’ARN variant dans 2 000 nucléotides⁹. Pour d’autres lignées cellulaires, la procédure de sonication doit être optimisée. Lorsque cette technique est réalisée pour étudier les partenaires d’ARN d’un ARN non codant très long, l’étape de sonication s’avère indispensable pour obtenir une récupération adéquate de l’ARNlnc. Dans ce cas, il est donc nécessaire de concevoir plusieurs sondes avec un site de liaison situé tous les 4 000 nucléotides maximum sur la longueur de l’ARNlnc. Pour récupérer toute la longueur de l’ARNlnc, utilisez un pool de plusieurs sondes spécifiques. Cependant, si l’objectif est d’identifier les régions de l’ARNlnc impliquées dans la liaison ARN-ARN, les sondes spécifiques doivent être utilisées séparément. De plus, si l’on étudie les partenaires d’ARN d’un ARNlnc plus petit, des expériences doivent être effectuées pour déterminer si l’étape de sonication est nécessaire.

5. Tirage de l’ARN

1. Jour 1 - Etape d’hybridation
   1. Ajouter 150 pmol (1,5 μL d’une solution mère de 100 μM) d’une sonde biotinylée spécifique ou non spécifique dans chaque tube d’échantillon. Incuber pendant 4 h sous agitation sur un rotateur de tube à température ambiante (RT) (environ 30 tr/min).
   2. Prélever le volume nécessaire de billes magnétiques (c’est-à-dire 40 μL de billes par 150 pmol de réaction d’hybridation des sondes). Utilisez un support magnétique pour séparer les perles des supports commerciaux. Jetez le surnageant et lavez les billes avec 900 μL de tampon d’hybridation. Une fois cela fait, remettre en suspension les billes magnétiques dans le même volume du tampon d’hybridation.
   3. Ajouter des billes magnétiques dans chaque tube d’échantillon (40 μL de billes par 150 pmol de réaction d’hybridation des sondes). Incuber une nuit sous agitation sur un rotateur tubulaire à RT (environ 30 tr/min).
2. Jour 2 - Étape d’isolement de l’ARN
   1. Séparez les billes du lysat cellulaire à l’aide d’un support magnétique (2-3 min). Jeter le surnageant et laver les billes avec 900 μL de tampon de lavage (0,5 % SDS, 2x SSC) avec 5 min d’incubation sous agitation sur le rotateur à RT. Répétez ce lavage 5 fois.
   2. Après avoir retiré le dernier lavage, ajoutez 95 μL de tampon Proteinase K sur les billes. Décongelez les échantillons d’entrée et ajoutez 75 μL de tampon de protéinase K. Ajouter 5 μL de protéinase K à une concentration finale de 1 μg/μL dans tous les tubes (échantillons et échantillons d’entrée). Incuber à 45 °C pendant 45 min puis à 95 °C pendant 10 min.
   3. Conservez l’échantillon sur de la glace. Utilisez un support magnétique pour séparer les billes des ARN présents dans le surnageant. Purifiez les ARN avec un kit de purification d’ARN qui comprend une étape de digestion de la DNase. Conservez les ARN purifiés à -80 °C.
      REMARQUE : L’ARN élué peut être soumis à une RT-qPCR ou à un séquençage d’ARN à haut débit pour détecter des transcrits enrichis. Pour l’analyse du séquençage de l’ARN, les lectures peuvent ensuite être alignées sur le génome d’intérêt à l’aide de logiciels libres, tels que STAR¹⁰ ou HISAT2¹¹, et la quantification peut être effectuée à l’aide de FeatureCounts¹² ou HTSeq^{count 13}.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

L’élucidation de l’interactome de lncRNA, c’est-à-dire les composants cellulaires qui interagissent avec les ARNlnc, les protéines, l’ARN et l’ADN, est d’une importance clé pour comprendre les fonctions des ARNlnc. Diverses techniques ont été développées pour caractériser l’interactome de lncRNA, notamment RIP, CHART, ChIRP et RNA pull-down. Bien que ce dernier se soit avéré puissant pour identifier les cibles d’ARN des ARNlnc, ces procédures n’indiquent pas...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

De nombreux ARNlnc remplissent leur fonction par appariement de bases complémentaires aux ARNm. Il est donc important de développer des procédures qui permettent de caractériser l’interactome ARN direct des ARNlnc. Par conséquent, une procédure a été mise au point qui combine l’utilisation du psoralène comme réactif de réticulation avec la technique d’extraction de l’ARN.

Dans le protocole de pull-down de l’ARN décrit, la conception et la...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4′-Aminomethyltrioxsalen hydrochloride	Sigma	A4330	Crosslinker reagent
Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	Sonicator
Biotynilated probes	IDT		Oligonucleotide probes
CFX96 Real Time System	BioRad	4351107	qPCR apparatus
DNA Olignucleotides	IDT		Primers for qPCR
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	Magnetic streptavidin beads
Formamide	Thermo-Fisher	15515-026	Formamide
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725124	qPCR reagent
Proteinase K	Sigma	P2308	Proteinase K
RNA to DNA	Thermo-Fisher	4387405	Reverse transcription kit
RNA XS purification kit	Macherey-Nagel	740902	RNA purificationkit
RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	RNAse inhibitor
Tube Rotator	Stuart	SB2	Eppendorf tube rotator
UV Stratalinker 1800	Stratagene	#400072	UV crosslinker