頭痛の前臨床モデルとしてのマウスにおける硬膜刺激および眼窩周囲フォンフレイ試験

要約

片頭痛の最も顕著な症状は重度の頭部痛であり、これは髄膜を神経支配する感覚ニューロンによって媒介されるという仮説が立てられている。ここでは、顔面過敏症をアウトプットとして、低侵襲で硬膜に物質を局所的に塗布する方法を提示する。

要約

硬膜、くも膜、およびピアマットからなる頭蓋髄膜は、主に神経系の構造的機能を果たすと考えられている。 例えば、それらは頭蓋骨から脳を保護し、皮質の血管およびニューロン供給を固定/組織化する。しかし、髄膜はまた、片頭痛の間に経験される痛みが局所的な無菌炎症およびそれに続く局所侵害受容性求心性の活性化に起因する片頭痛などの神経系障害にも関与している。髄膜の層のうち、硬膜は片頭痛の病態生理学において特に興味深い。それは高度に血管化され、局所的な侵害受容性ニューロンを保有し、免疫細胞などの多様な常在細胞の本拠地である。局所髄膜微小環境の微妙な変化は、硬膜血管周囲侵害受容器の活性化および感作をもたらし、したがって片頭痛の痛みをもたらし得る。研究は、硬膜求心性心理がin vivo電気生理学、イメージング技術、または行動モデルのいずれかを使用して活性化/感作される方法に対処しようとしてきましたが、これらは一般的に非常に侵襲的な手術を必要とします。このプロトコルは、マウスの硬膜上に化合物を比較的非侵襲的に適用するための方法と、硬膜刺激後の眼窩周囲フォンフライ試験を用いて頭痛様触覚感受性を測定するための適切な方法を提示する。この方法は、硬膜および頭蓋骨の完全性を維持し、融合していない矢状縫合糸およびラムドイド縫合糸の接合部に0.65mmの改変カニューレを介して物質を注入することによって、侵襲的技術による交絡効果を低減する。この前臨床モデルにより、研究者は、頭蓋骨および髄膜に傷害のない状態を維持しながら、侵害受容器の活性化、免疫細胞の活性化、血管の変化、および疼痛行動などの片頭痛の病理学的進行における広範囲の硬膜刺激およびそれらの役割を調査することを可能にする。

概要

片頭痛の痛みは、世界中の主要な公衆衛生上の問題のままです。世界保健機関(WHO)は、^{地球人口の}15%弱を苦しめ、社会にかなりの社会経済的負担を引き起こしている、世界で6番目に流行している病気としてランク付けしています^2,3。治療の選択肢とその有効性は最適ではなく、症候性の軽減を提供するだけであり、片頭痛の発生の根底にある病態生理学的事象を有意に変化させない^4,5。治療の成功の欠如は、片頭痛が病理があまり理解されていない多因子性障害であり、限られた数の治療標的につながる可能性が高い。片頭痛はまた、特に片頭痛の診断が、オーラ、頭痛、光恐怖症、およびアロディニアなどの片頭痛の特徴に関する経験を説明する患者との口頭でのコミュニケーションに基づいて行われることを考えると、動物モデルで完全に捕捉することも困難である。それにもかかわらず、片頭痛治療における最近の進歩は、現在、前臨床モデルによって十分に検証された多くの神経学的状態の治療を上回っていることに注意することが重要です。例えば、カルシトニン遺伝子関連ペプチドまたはその受容体を標的とするモノクローナル抗体および小分子は、片頭痛患者の生活の質を改善するのに非常に成功しており、片頭痛の臨床管理を潜在的に変革することができる。この障害の理解は進歩してきましたが、まだ解明されていないことがたくさんあります。

前臨床動物モデルおよびヒト研究に基づいて、片頭痛は、三叉神経および上部子宮頸部背根神経節を介して信号を送る髄膜内の侵害受容性線維の異常な活性化によって開始されることが広く受け入れられている⁶、⁷、^8、9、10。この理論にもかかわらず、多くの研究は依然として片頭痛の根底にある寄与メカニズムを理解するために薬物の全身投与を使用しています。薬物の全身投与は我々の理解を実質的に強化したが、これらの知見は、標的組織内の局所作用が片頭痛において役割を果たすかどうかを直接評価するものではない。逆に、いくつかの研究は硬膜を刺激するアプローチを取っています。しかし、これらの実験では、侵襲的開頭術によるカニューレ移植と回復時間の延長が必要です^11,12。これらの制限のために、我々は、開頭術の欠如が手術後の回復を排除し、覚醒した動物における即時検査を可能にする硬膜を局所的に刺激するための低侵襲アプローチを開発しました^12,13,14。これらの注射は、軽いイソフルラン麻酔下で行われ、マウスの矢状縫合糸およびラムドイド縫合糸の接合部で投与される。

げっ歯類における侵害受容性行動応答を評価するために、いくつかのアプローチが開発されている¹⁵。皮膚異痛症は片頭痛患者の約80%で報告されており^16,17、げっ歯類に使用するための潜在的な翻訳エンドポイントを表しています。前臨床モデルでは、げっ歯類の足底領域へのフォン・フレイフィラメントの適用が、前臨床片頭痛モデルにおける疼痛挙動を評価するために用いられてきた。このアプローチの主な制限は、頭蓋領域をテストしないことです。顔面グリマススコアリングは、疼痛刺激の誘発後の表情を分析することによって、げっ歯類の疼痛行動を捉えるために使用されている^18,19。しかし、その限界には、急性刺激に対する応答の捕捉のみが含まれ、慢性口腔顔面疼痛状態は含まれない。顔面グルーミングおよび飼育の減少もまた、片頭痛の前臨床モデルにおける行動応答の出力と考えられている^20,21。前者の限界には、疼痛反応を通常の日常的なグルーミングおよびかゆみなどの他の感覚と区別することの難しさが含まれる。後者の場合、飼育行動は通常、げっ歯類を新しい環境に導入した後すぐに減少する。これらの行動エンドポイントのそれぞれは、疼痛状態に寄与する様々なメカニズムの理解において価値があるが、片頭痛などの疼痛障害の前臨床モデルが、頭蓋過敏症応答を特異的に捕捉するエンドポイントを含むことが決定的に必要である。硬膜刺激後の眼窩周囲皮膚の触覚過敏症を評価することは、感覚症状が本質的に主に頭蓋骨である片頭痛に寄与するメカニズムについてのより良い洞察を提供する方法である。ここで、片頭痛の前臨床モデルとしてマウス硬膜上に物質を投与する方法について説明する。硬膜適用に続いて、我々はまた、Dixonアップダウン法で適用された較正されたフォンフレイフィラメントを使用して眼窩周囲触覚過敏症を試験するための詳細な方法を提示する。

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プロトコル

すべての手続きは、テキサス大学ダラス校の機関動物ケアおよび使用委員会の事前承認を得て実施されました。ICR(CD-1)(30-35g)およびC57/BL6(25-30g)マウスを6~8週齢で本試験に使用した。

1. 硬膜注入器

1. マウス注入器/注入器を作成するには、調整可能な非金属溶融シリカプラスチックキャップで片側注射用の市販の内部カニューレと注入器を変更し、内径(I.D.)が0.18mm、外径(O.D.)が0.35mmの28Gガイドカニューレに挿入/下に挿入/延長します(図1A)。
2. ノギスまたはその他の測定装置を使用して、注入器の溶融シリカプラスチックキャップを0.6mmの長さに調整します。注入器の先端からシリカプラスチックキャップの端まで測定する。
   1. プラスチックキャップを調整するときは、注入器を曲げたり鈍らせたりしないように注意してください。
   2. 以前に硬膜注射に使用されていない他のマウス系統については、長さを0.6mmに設定し、インクまたは染料でパイロット注射を行い、染料が硬膜にのみあり、脳または頭蓋骨にはないことが観察されるまで注入器の長さを調整することによって、最適な注入器の長さを決定する。
3. 調整された注入器の長端(または0.6mmと測定されなかった端)をプラスチックチューブ(ポンプチューブ、2ストップ、内径0.19mm、長さ406mm)に取り付けます。
   1. チューブを最小の長さの 8 インチに切断して、5 μL の容量を保持するのに十分なラインがあることを確認します。
   2. チューブが注入器の金属部分とプラスチックストッパーの上部を覆っていることを確認してください。これにより、ラインに気泡が溜まるのを防ぐことができます。
4. チューブのもう一方の端を10 μLのガラス製マイクロシリンジ(気密、接合針、10 mm突起付きで21 G)に取り付け、シリンジの金属部分にしっかりとシールを貼ってください(図1A)。
5. ラインが接続されたら、シリンジに5 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、合成間質液(SIF)、または気泡の形成を防ぐために選択した他のビヒクルをバックフィルします。
   1. ラインに気泡が観測された場合は、気泡が消えるまで車両でラインを溢れさせます。
      注:シリンジをラインに取り付ける前に車両を充填し、接続後に液体をラインに押し込むと役立つ場合があります。
6. ラインに5 μLのビヒクルがバックフィルされ、効率的に作業した後、5 μLの薬物/溶液をハミルトンシリンジにロードします(この技術を学習または実践する場合は、インクまたは染料を薬物/溶液の代替として使用できます)。
   1. 硬膜に投与されたすべてのビヒクル溶液がpH 7.4に維持され、オスモル濃度が310まで測定されていることを確認します。これは、硬膜内の酸感知イオンチャネルおよび他の浸透圧感受性チャネルの潜在的な活性化を減少させる。
7. 脳への漏出を引き起こさなかったマウスで試験された最大体積は約10μLである。この体積の注射後の行動効果は試験されていない。このため、硬膜上に5μLの溶液のみを投与する。
   注:これらの観察は、6〜8週齢のCD1 / ICRマウスのマウス系統/年齢/体重に基づいています。

2.硬膜注射

1. シリンジが準備され、薬物が装填されたら、マウスを腹部に平らに置き、ノーズコーンを介して酸素流量0.5〜1L /分の短い3%イソフルラン下で麻酔する。
   1. マウスがピンチ反射を表示しなくなったら、麻酔を調整し、1.5%イソフルランで維持します。
2. 麻酔をかけたら、滅菌眼軟膏を目に塗り、動物の頭を剃り、ポビドンヨードとエタノールで皮膚を消毒します。これに続いて、注射を成功させるのに役立つ位置に着きます。
3. 片手で動物の頭を固定し、もう片方の手で注入器を持ちます。
4. マウスの頭蓋骨上の矢状縫合糸と羊根状縫合糸の接合部を注意深く調べて見つけます(図1B、C)。
   1. 皮膚を通してこの目立たない接合部を見つけるには、頭蓋骨の地形学的特徴を使用し、注入器との接合部の一般的な位置を静かにプローブする。
   2. 頭蓋骨に沿って注入器を再配置し、正確な位置を感じて、接合部の位置を確認します。
5. 縫合糸が位置し、注入器が所定の位置に収まったら、注入器が皮膚を貫通し、プラスチックストッパーまで接合部に落ちるまで、非常にゆっくりと静かに前後に揺れます。
   メモ: インフューザーの 0.6 mm 先端全体を必ず接合部に挿入してください。
6. 精度を検証するには、インクまたは染料を注射液として使用し、マウスを安楽死させて首を切ってください。
   1. 頭蓋骨キャップを取り外して、硬膜内の色素を視覚化します(図1C)。
      注:染料は頭蓋骨の脳や外側に観察しないでください。同様に、いずれの実験においても、マウスは、注射の精度を検証し、硬膜の完全性が損傷を受けていないことを確認するために、死後にチェックされるべきである。
7. 注射後、マウスを麻酔から取り出し、意識を取り戻すのを待ってからケージに戻るか、試験室に入れて目的のアッセイを開始します。
   メモ: 行動実験を行う前に、マウスが麻酔から回復するまで最低 30 分間待ってください。

3. 眼窩周囲フォン・フレイ

1. 約16〜20匹のマウスのコホートで研究を開始する。
2. 馴化の前日に1回、各マウスを少なくとも5分間取り扱います。
3. 取り扱いから約24時間後に、マウスを試験室条件およびフォンフライ試験装置に慣れさせる(図2A)。
   注:アクリル試験装置は、約3 in x 3.5 in x 5インチ(W x H x D)の蓋付きの個々のコンパートメントで構成され、0.25 in 19 G角形亜鉛メッキスチールメッシュワイヤを介して接続されたアルミニウムスタンドによって支えられています。
   1. マウスを、無臭でポリエチレンやパラフィンワックスを含まない水平に配置された4オンスの白い紙コップの中に置きます。
      注:これらのタイプのカップは、摂取するとマウスの胃腸の不調を軽減するため、好ましい(図2B)。
4. 動物がそれぞれの部屋にいる間、動物を落ち着かせ、動物への不必要なストレスを避けるために、各マウスの個々の部屋に通常の固形飼料のペレットを置きます。フォン・フレイの動作テストの前に3日間これを行います。
   1. マウスがチャンバーにいるたびに、食物にアクセスできることを確認してください。
   2. 各動物に番号を付け、テストラック内の同じスペースに割り当てます。試験期間中の毎日同じカップにマウスを入れて、各動物がその試験環境に順応することを確認します。
      注:マウスはカップをかじり、その後カップを破壊します。このような場合は、カップを交換し、対応するマウス番号でラベルを付けます。
5. 最初の3日間の馴化に続いて、マウスを個々の部屋に入れる。
   1. フォン・フライ試験の前に動物を試験室およびチャンバーに少なくとも1時間順応させて、マウスが落ち着き、その後試験が容易になるようにする。
6. 試験日に部屋に順応した後、カップに入れたままマウスを1匹ずつそれぞれのチャンバーから取り出します。
   1. マウスが前足と後足の両方にあるようにカップを水平位置に保ち、体重を均等に分散させます。
      注:体重分布が等しくないと、動物の反応が変化し、動物の反応を妨げることさえあります。
7. マウスを入れたカップを、吸収パッドのテストラックの下のテーブルの上に置きます。
8. 眼窩周囲フォンフレイ試験では、0.07gフォンフレイフィラメントを顔の中心と目の間に直接置きます。
9. フィラメントに十分な圧力をかけて、フォン・フレイの毛を「C」字型に曲げます。
   1. 少なくとも3秒以上5秒以内に、またはマウスが頭を引っ込めて足でフィラメントをスワイプするまで、領域との接触を維持します。
      注:試験中にフィラメントが滑ったり、フィラメントの先端が動物に触れたりした場合、反応はカウントされません。これらの応答は、異なるメカノレセプターによって活性化されるブラシに応答している可能性があり、したがって正確な結果を反映していない可能性がある。
   2. フォン・フレイ・フィラメントをディクソンの「アップダウン」法^22,23に従って塗布^する。
      1. 最初に、0.07gの重量を有するフォン・フライフィラメントを塗布する。この研究で可能な最低フィラメントと最も高い試験フィラメントは、それぞれ0.008gおよび0.6gの重量を有するフィラメントである。
      2. このアッセイを実行するために、重量0.008g、0.02g、0.04g、0.07g、0.16g、0.4g、および0.6gのフィラメントを使用する。
      3. この方法では、動物がフィラメントに応答しない場合、次に高いグラム重量のフィラメントを適用する。
      4. マウスがフィラメントに応答する場合は、そのマウスがそのフィラメントに応答すると考えてください。この場合、次に低いグラム重量のフィラメントを塗布する。
      5. 動物が初期応答の4回後に試験されるまで、または動物がアッセイで試験されたフィラメントに応答しないと判断されるまで、このパターンを繰り返す。
         メモ: 腕や手首にこれ以上の圧力をかけないでください。スケールは、フィラメントの適用を練習するために使用され得る。

4. ベースライン引き出ししきい値のテスト

1. 実験に含める前に、マウスが0.5〜0.6gの間のベースライン離脱閾値に達していることを確認してください。
   1. マウスは、ステップ 3.9.2.2 で説明したシリーズでテストされたフィラメント (0.07 g、0.16 g、0.4 g、および 0.6 g) に応答しない場合、ベースラインに到達します。
2. ベースライン離脱閾値を確立する際にマウスを毎日試験する。
   1. 試験により、動物は試験条件とフォンフライフィラメントの圧力に順応することができます。
   2. テストの3日目以降もマウスが依然として非常に過敏である場合は、再度テストする前に1〜2日待ってみてください。
      注:試験日数が長すぎると、動物が眼窩周囲領域のフィラメントの重量に適応できず、目標とする離脱閾値に達しない可能性があります。
3. 試験マウスを約7日間観察してから、どの動物が実験の包含基準を満たしていないかを決定する。
   注:マウスの約70%が目標ベースラインレベルに達する。
   1. 硬膜刺激の前に、ベースラインデータを分析して、0.5〜0.6グラム以上のベースライン値に達していないマウスを除外する。
   2. 除外後、残りの各マウスをテストグループにランダムに割り当てます。これを実現するには、カップから引き出すか、スプレッドシートにスクリプトを書いて、数字をグループにランダム化します。

5. フォン・フライ結果の解析

1. 一連の応答が得られたら、以前に公開された方法²⁴に従って、デルタ、k値、50%閾値、および離脱閾値をグラム単位で決定する。
2. この式WT = 10(x*^F+B)を使用して離脱しきい値を計算します。ここで、WT = 離脱しきい値、F = シャプラン法で計算された足の離脱しきい値、B = 対数(曲げ力)の線形回帰 = x*フィラメント数 + B
3. データを50%の離脱しきい値または平均引き出ししきい値(グラム単位)としてプロットします。

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結果

この注射方法は、マウスの硬膜に刺激を投与し、その後の行動試験が行われるようにするために使用される。このモデルで測定された最も一般的な行動出力は、von Frey^12,13,14を介して評価された皮膚顔面過敏症である。ここでは、片頭痛病理に対する潜在的な性別特異的寄与を評価するためにこのモデルをどのように使用?...

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ディスカッション

硬膜における局所侵害受容系における不適応変化は、組織損傷の欠如にもかかわらず、片頭痛発作の頭痛期への主要な寄与と考えられている^25,26。ここでの研究は、硬膜の低侵襲刺激が顔面触覚過敏症を誘発し得る方法を提示する。頭蓋や組織に損傷を与えることなく硬膜侵害受容器の活性化に関与するメカニズムや事象を解明することは、前臨床...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
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Absorbent Underpads	Fisherbrand	14-206-65	https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-absorbent-underpads-8/p-306048
C313I/SPC Internal 28 G cannula	P1 Technologies (formerly Plastics One)	8IC313ISPCXC	I.D. 18 mm, O.D. 35 mm
Gastight Model 1701 SN Syringes	Hamilton	80008	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/80008
Ismatec Pump Tubing, 0.19 mm	Cole-Palmer	EW-96460-10	https://www.coleparmer.com/i/ismatec-pump-tubing-2-stop-tygon-s3-e-lab-0-19-mm-id-12-pk/9646010
Stand with chicken wire	Custom		The galvanized steel chicken wire dimensions are 0.25 in. x 19-gauge
Testing Rack with individual  Chambers	Custom		Each chamber should have a division between each mouse and lids to contain the mouse. The chambers should also be large enough to hold a 4 oz. paper cup.
von Frey Filaments	Touch test/Stoelting	58011	https://www.stoeltingco.com/touch-test.html