腹腔内細菌感染のマウスモデルにおける脾小胞の単離

要約

原形質膜から放出された微小胞は、細胞エフェクターとして機能します。脾臓微小胞(SMV)は、病態生理学的状態の代理マーカーです。ラットやマウスでは、SMVの含有量と特性が老化や炎症を特徴づけ、細胞保護治療によって変化するため、前臨床研究のための貴重でありながら豊富なモニタリングツールとなっています。

要約

微小胞(MV)は、活性化細胞の原形質膜から放出されるサブミクロンの断片であり、炎症誘発性および凝固促進性の細胞エフェクターとして機能します。ラットでは、脾臓MV(SMV)が病態生理学的状態の代理マーカーです。これまでの in vitro 研究では、主要な歯周病原体である ポルフィロモナス・ジンジバリス (P. gingivalis)が内皮の排出とアポトーシスを可能にし、リポ多糖(LPS)が脾細胞由来の微小胞(SMV)の排出を促進することが実証されました。 In vivo 研究では、SMV シェディングの薬理学的制御の実現可能性が示されました。本プロトコルは、 P. gingivalis 急性マウス感染モデルから脾臓SMVを単離するための標準化された手順を確立します。P. gingivalis 感染は、腹腔内注射(5 x 10⁷ 細菌の3回注射/週)により、若いC57BL/6マウスに誘導されました。2週間後、脾臓を採取し、体重を量り、脾細胞を数えました。SMVは、タンパク質、RNA、およびプロトロンビナーゼアッセイによって単離および定量されました。細胞生存率は、ヨウ化プロピジウムまたはトリパンブルー排除色素のいずれかによって評価されました。脾細胞抽出後、脾細胞培養の24時間後にフローサイトメトリーにより好中球数を得た。 P. gingivalisを注射したマウスでは、脾臓重量が2.5倍、脾細胞数が2.3倍、好中球数が40倍増加しました。 P. gingivalisを注射したマウス由来の脾細胞の細胞生存率は75%〜96%の範囲であり、非曝露対照と比較して有意差なく、培養の24時間後に50%減少した。しかし、注射したマウスの脾細胞は、プロトロンビナーゼアッセイやタンパク質測定により、より多くのMVを排出します。このデータは、凝固促進剤SMVが、腹腔内P.ジンジバリス 感染に対する初期の脾臓反応を評価するための信頼できるツールであることを示しています。

概要

微小胞(MV)は、マイクロ粒子またはエクトソームとも呼ばれ、さまざまな細胞刺激に応答して体液および細胞外空間に放出される直径0.1〜1.0μmの原形質膜断片です。最初に同定されたのは、凝固促進剤リン脂質、主にホスファチジルセリン(PSer)を露出させる血小板ダストとして同定されたMVは、血液凝固複合体^1,2の集合のための追加の表面を構成する。凝固促進エフェクターとしての循環MVの重要な役割は、PSer曝露と出血の機能不全につながるまれな遺伝性疾患であるスコット症候群²の患者で実証されています(補足図1)。MVは、糖尿病、慢性腎臓病、子癇前症、高血圧などの心血管障害に関連する慢性疾患における血栓性リスクの循環バイオマーカーとして広く研究されてきました^3,4。それらは現在、心筋¹のような体液や臓器組織における真の細胞エフェクターとして認識されています。活性タンパク質、脂質、miRNAを運ぶため、止血、炎症、血管血管新生、血管増殖や組織^{リモデリングなどの}血管応答を遠隔操作で調節します5。

臨床研究では、リスク要因に関するMVの予後値を調べますが、患者の体液または組織から分離されたMVは、そのエフェクター特性の ex vivo 評価を可能にします⁶。MVの生合成およびクロストーク能力を支配するメカニズムの解読は、一般に細胞培養モデルで達成され、MVによって曝露された、またはMV内にカプセル化された活性分子とその下流シグナル伝達を同定します。標的細胞とのMV相互作用は、膜タンパク質/タンパク質結合、適切なカウンターリガンドが利用可能な場合、および/または脂質融合に依存します⁷。

生理学的条件下では、血漿中を循環するMVは、系統クラスター分化マーカー(CD)^8,9によって識別されるように、主に血管細胞に由来する。しかし、病理学では、特に癌¹⁰および移植片拒絶反応^11,12において、MVは損傷した組織から排出され、有害な凝固促進剤および炎症誘発性の特徴を有する。これらは体循環で検出されるため、保護療法または若返り療法、および可能な薬理学的標的をモニタリングするための有用なプローブになります¹³。MVは、健康および疾患における血管および組織細胞の恒常性を反映する動的貯蔵プールとして循環するため、それらの遠隔作用のより深い理解は、小動物^14,15のIV注射または経鼻注入後のin vivoでも調査する必要がある。実際、MVは、誇張された炎症と血栓症¹⁶を結合する複雑な経路の主要な貢献者と見なされてきました。

歯周炎は、歯を支える組織^17,18に影響を及ぼし、血栓症のリスクと関連している感染性起源の炎症性疾患です。歯肉の出血、歯槽骨の破壊、歯の可動性が特徴で、最終的には歯の喪失につながる可能性があります。歯周炎は世界中で非常に蔓延しており、人口の50%以上が罹患しており、11%が重症型¹⁹を示しています。歯周炎は、歯肉縁下バイオフィルムの細菌性細菌叢症によって引き起こされ、組織破壊を引き起こす炎症反応の悪化を維持します²⁰。過去10年間で、歯周炎は心血管障害、糖尿病、関節リウマチなどの全身性疾患と関連づけられてきました。考えられる説明は、離れた場所での歯周病原体の作用、および/またはインターロイキン(IL-1、IL-6)やTNF-αなどの炎症誘発性サイトカインによって媒介される全身性炎症の増加です^21,22。

歯周炎の発症と発症に関連する病原体の中で、ポルフィロモナス・ジンジバリス(P. gingivalis)²³は、リポ多糖(LPS)²⁴がToll様受容体(TLR)を介した炎症反応²⁵を誘導し、初期感染部位での好中球と多形核白血球(PMN)の動員²⁶など、いくつかの病原性因子を採取する最も重篤な病変に見られます。P. gingivalis由来のLPSは、TLR-4またはTLR-2を活性化し、免疫検出と細菌の生存回避を促進する²⁷。血管レベルでは、LPSによるTLR2の活性化は免疫血栓症に関連しています。P. gingivalisがTLR-2シグナル伝達を促すユニークな能力は、TLR-4依存性の認識が著しく損なわれている一方で、持続的な低悪性度の感染に有利に働きます^28,29。

低悪性度の病原体に対するMV応答を慢性的かつ持続的に研究するためのin vivo手順は乏しいです。組織性MV抽出の方法論的アプローチは、文献ではあまり説明されておらず、一般に、固形腫瘍、肝臓脂肪症、アテローム血栓性プラーク、または移植片11,29,30などの病理組織からのMVの収穫に関係しています。一方、脾臓は血流中の細菌やウイルスを感知します。また、免疫応答に関与する赤血球、血小板、リンパ球、単球、好塩基球、好酸球も保存します。赤色果肉からの好中球のような顆粒球も活性酸素種(ROS)とプロテアーゼを生成し、病原体を破壊し、感染の拡大を防ぎます^31,32。驚くべきことに、そして私たちの知る限りでは、脾臓MVは病原体による組織損傷の文脈では調査されていません。生理病理学におけるtissular MVの変動を研究することは、世界的に満たされていないニーズがあります。

私たちの研究室のin vitroデータによると、LPSはラット脾細胞からの凝固促進剤MVの排出を誘導し、それが培養冠状動脈内皮細胞の老化を促し、連続して炎症誘発性および炎症性凝固促進剤の内皮表現型¹¹を促すことが示されました。脾臓MVの薬理学的制御の実現可能性は、最適化されたオメガ3製剤で動物を治療した後、さらに実証されました。中年および高齢ラットの経口強制経口投与は、脾細胞からの凝固促進剤MVの排出と冠状動脈内皮に対するそれらの老化性の有害な特性の両方に対して保護的であることがわかった³³。

血液と比較して、脾臓は一人の個人の白血球の重要な供給源であるという利点があります。さらに、脾臓-心軸が^{最近提案されており3,34}、脾臓は、薬理学的制御に有益な関心のある感染関連の心血管リスクの一因となる可能性があります。SMVの特性または放出の評価は、病原体誘発性または炎症性反応を理解する上で重要です。興味深いことに、それは治療された動物やさまざまな生理病理学的モデル(年齢、高血圧、糖尿病)で達成することができます。実際、中年ラットと高齢ラット³³を比較することにより、単純な24時間脾細胞培養後に脾臓MVの特性と放出の違いを証明できる。

生理病理学的条件による脾臓MVのエフェクター特性の変化、およびラットにおけるそれらの薬理学的制御の実現可能性に関する上記の証拠を考えると、マウス脾臓MVの単離について、標準化されたプロトコルが本明細書に記載される。この手順は、最終的には人工マウスでSMVを介した効果をサポートする in vivo メカニズムの詳細な調査により適しています。この手順は 、P. gingivalis による局所腹腔内感染を使用してC57BL / 6マウスで確立され、脾臓MV(SMV)エフェクター特性に対する病原体の遠隔作用の証拠を確立しました。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

プロトコル

すべての実験プロトコルは、地元の倫理委員会(APAFIS#28745-2020121815051557)と、所属大学とINSERMの動物管理の関連ガイドラインによって承認され、それに従っていました。実験には、生後6-8週齢の雄のYoung C57BL/6マウスを使用しました。マウスは、痛みとストレスを評価するために定期的に検査され、その体重は毎日監視されました。特に明記されていない限り、すべての抽出バッファーおよび溶液は無菌で室温でなければなりません。

1.動物の調理

1. マウスに P. gingivalis (PG) の腹腔内注射を 6 回、2 日間 2 週間投与します (5 x 10⁷ 細菌の 3 回の注射/週、補足ファイル 1)。
2. 100 mg / kgのケタミンと10 mg / kgのキシラジンの組み合わせを使用してマウスに麻酔をかけます。.
3. 麻酔をかけたマウスを犠牲にし、開腹術後に脾臓を採取します。
   注: P. gingivalis の感染の特定の条件と脾臓採取のための動物の犠牲は、 補足ファイル1の「動物実験」セクションに詳述されています。プロトコルのステップの概略図を 図1に示します。

2. 脾細胞の抽出

1. メスを使用して、抗生物質(ストレプトマイシン(100 U / mL)/ペニシリン(100 U / mL)、ファンジゾン(250 mg / mL)、L-グルタミン(2 mM))を含むRPMIを3 mLで満たしたペトリ皿で脾臓組織を~1 mmスライスに刻み、10%ウシ胎児血清(FBS)( 材料の表を参照)を補充します。
2. スライスを、事前に50mLのポリスチレンチューブに取り付けたふるい( 材料の表を参照)に移します。
3. 注射器のプランジャーを乳棒として使用して、ふるいの上の組織を粉砕します。
4. ふるいをRPMI培地(3 mL)ですすいでください。
5. 細胞懸濁液溶出液を450 x g で室温で5分間遠心分離し、逆流に注意して上清を廃棄します。

3. 浸透圧ショック による 赤血球の除去

1. 1 mLのACKバッファー( 材料表を参照)を加え、よく混合し、室温で3分間インキュベートし、手の回転で穏やかに振とうします。
2. 9 mLのRPMIを加えて希釈し、吸引と逆流を使用してよく混合します。
3. 450 x g で室温で5分間遠心分離します。
4. 吸引と逆流によって上清を捨て、ペレットを5mLのRPMI培地に再懸濁します。.
5. 穏やかに混合し(吸引/逆流)、最終的にはピペッティングまたはふるいを使用して脂質の破片を取り除きます。

4. 単離した脾細胞濃度の調整

1. 900 μL の RPMI を含む 1.5 mL マイクロチューブに充填します。
2. マイクロピペットを使用して、細胞懸濁液100μLを取り、900μLのRPMI培地を含む1.5mLマイクロチューブに加えて、よく混合します。
3. 希釈した細胞10 μLをマイクロチューブに移し、トリパンブルー排除色素10 μLを加えてよく混合します。
4. 10 μLの溶液(ステップ3.3)を自動セルカウンターの計数スライド( 材料表を参照)に入れ、セルカウントを決定します。
   注意: デバイスソフトウェアは、合計セル数と生細胞数およびパーセンテージの2つの値を提供します。
5. 生細胞の濃度を3または5 x 10⁶ 細胞/mL(V_max = 20 mL、最大総容量は100 x 10⁶ 細胞/mL)に調整します。
6. RPMIを含む75mLフラスコに細胞を播種します。
7. フラスコを加湿インキュベーター内で垂直に37°Cで24時間インキュベートします。
   注意:トリパンブルーは変異原性および発がん性物質^35,36です。ボンネットの外でも、カウント中は手袋を着用してください。すぐにチップと液体を容器に捨て、ベンチの表面を洗います。
   注:採取した細胞が50 x 10⁶未満の場合は、25mLの培養フラスコを使用してください。セル番号は、個人間であまり変わらないはずです。このステップでは、生細胞の割合は一般に80%よりも優れています。

5. 脾細胞微小胞の単離

1. 24時間後、フラスコの内容物を50mLのポリプロピレンまたはポリスチレンチューブに注ぎます。
2. 450 x g で室温で15分間遠心分離し、細胞と破片を除去します。
3. 遠心分離後、100 μLの第1上清(SN1)を保持して、最終的に初期MV濃度を測定し、単離収率を計算します。SN1 ボリュームに注意してください。
4. SN1を450 x g で室温で15分間遠心分離します。
5. ペレットを廃棄し、450 x g で室温で15分間再度遠心分離します。SN2を迅速に引き出して回収します(ボリュームに注意してください)。
6. SN2を底部が円錐形の1.8mLマイクロチューブに移します。最終的に初期MV濃度を測定するためにSN2を100μL保持し、破片が多すぎると最終的にSN1のMV測定が損なわれた場合の単離収率を計算します。
7. ペレット(細胞)に5mLのRPMI培地を加え、脾細胞をカウントします。
   注:細胞懸濁液は、0.1%パラホルムアルデヒド(最終濃度)³⁷のフローサイトメトリー特性評価のために固定することもできる。
8. SN2を14,000 x g で4°Cで1時間遠心分離し、最後に空のローターを4°Cで運転してローターを事前に冷蔵します。 この手順により、SN3 が生成されます。
9. SN3を各マイクロチューブから直ちに取り出し、1本の滅菌済み50 mLチューブ(ボンネットの下)を反転させます。SN3 ボリュームに注意してください。
10. ボンネットの下のピペットを使用してSN3を穏やかに混合します。サスペンションに最終的な測定のためのアリコートを保管してください。
    注:溶液は現在MVが枯渇していますが、可溶性メディエーターとエキソソームが含まれています。
11. スパイク付きラックで各マイクロチューブ(閉じた状態)をこすり落とし、ペレット中のMVの再懸濁を機械的に促進します。
12. Ca²⁺ およびMg²⁺ を含まないハンク平衡生理食塩水(HBSS)を200μLを最初のマイクロチューブに加えます( 材料の表を参照)。
13. 1 mL マイクロピペットを使用して、穏やかな吸引/逆流サイクル (~10 回) により、最初のチューブの MV ペレットを再懸濁します。泡立ちは懸濁液中の小胞や他の部分の酸化を促進するため、泡立ちを避けるように細心の注意を払ってください。
14. 再懸濁したMVの最初の200μLを回収し、ペレットの上の2番目のチューブに注ぎます。上記のように穏やかに混ぜてから、3本目のチューブに再度注ぎ、穏やかに混ぜます。懸濁液はチューブからチューブへとますます濁ります。3本目のチューブを閉じます。
15. 上記のように、次の3つのマイクロチューブの収集を開始します(手順4.14)。
16. 再懸濁したすべてのMVを1つ(または2つ)のコレクターマイクロチューブ(底部が円錐形の2 mL)に集めます。このステップの収率を最終的に計算するために、50 μLを保管してください。サスペンションのボリュームに注意してください。
17. コレクターチューブを14,000 x g で4°Cで1時間遠心分離します。 この手順により、SN4 が生成されます。
18. すぐにSN4を廃棄します(上清収集チューブに注ぎます)。SN4のアリコートを保持して精製ステップの収率を計算し、ペレットを500 μLのHBBS(Ca²⁺ およびMg²⁺なし)に穏やかに再懸濁します。再懸濁したペレットの50μLのアリコートを保持して、精製収率を計算し、その容量を記録します。
19. 再懸濁したペレットは、無菌条件下での機能アッセイの場合は4°Cで最大1ヶ月間、構造アッセイの場合は-20°Cで保存してください。
20. 上清および/またはペレット懸濁液中のMVの濃度を測定することにより、各ステップまたは全手順の精製収率(下記の注を参照)を計算します。
    注:精製収率(%):([MV1]×SN1容量)/([MV4]×最終懸濁液容量)×100。
    この収量は、培養フラスコから単離された脾細胞の数に合理化し、ステップ4.4でカウントする必要があります。本実験の精製収率は、111 x 10⁶ 細胞と60 mLの上清から~70%です。
    1. SMVが枯渇し、主にエキソソーム(SN2およびSN4)を含む上清に残っているSMVを測定することにより、手順によって引き起こされるSMVの損失を評価します。
    2. TRPSまたはプロトロンビナーゼアッセイ³⁸ によりMV濃度を測定し、高い感度と特異性を実現します。
       注意:遠心分離後、上清を逆さまに急速に注ぐことにより、MVを回収します。U字型のマイクロチューブを待ったり使用したりすると、マイクロチューブの壁にMVの損失が生じます。マイクロピペットを使用して上清を捨てないでください。代わりにペレットを吸引することができます。遠心分離機が停止した後、プロセスを遅らせないでください。過速度遠心分離は、エキソソームによるMVペレットの汚染につながります。
       注:遠心分離の速度と持続時間は、エキソソームによる汚染を最小限に抑えたMV濃縮に最適化されています。このプロトコルは、脾臓単球/マクロファージMVを研究するために信頼性がありません、なぜならこれらの細胞は食細胞を取り込み、彼ら自身のMVを迅速に再捕捉することができるからです³⁹。このプロトコールは、細胞の生存能力による細胞の損失のため、一時停止して後で再開することはできません。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

結果

提供されたデータは、2つの主要な動物条件を使用して、手順全体を完全に表しています:未治療の若いC57BL/6マウスとその同腹仔を、2日ごとに2週間、6回の腹腔内(IP)PG注射にさらしました。また、腹腔内PG注射が2週間後の脾臓反応に及ぼす遠隔作用も示しています。脾細胞の微小胞は、プロトロンビナーゼ酵素アッセイまたは分光光度法によるタンパク質およびRNA濃度...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

ディスカッション

本研究は、脾臓が、マウスの量が限られている血液などの他の供給源と比較して、生理病理学的関連性を持つMVの主要かつ信頼できる供給源であることを確認しています。予防策を講じれば、この方法はセットアップが簡単で、高価な機器は必要ありません。 in vivo 評価以外の方法が利用できないため、現在のモデルは、MV 排出に対するプロドラッグの影響を?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL tubes type Eppendorf	Dutscher	54816	Conical bottom stériel microtubes
Allegra 64 R Centrifuge	Beckman Coulter
Automatic cell counter	Biorad
Bovine serum albumin	Euromedex	04-100-812-E	Prepared, filtered with 0.22 µm sieve and stored at 4 °C under sterile conditions by using the following formulas: 2 mM EDTA, 0,5% BSA and sterile PBS
CD11 (Mac-1)	e-Biosciences	45-00112-80	Conjugated to eFluor 450; λmax excitation 405 nm λmax emission 445 nm
CD16/32	BD Biosciences	553142	unconjugated
EDTA	Calbiochem	Calbiochem	S 6381-92-6
Falcon tube	Cell star	227261	50 mL
Fetal Bovine serum	Dutscher	S1810-500	Batch number = S14028S1810
Fortessa Aria	BD Biosciences		for cell sorting
Fortessa flow cytometer	Becton-Dickinson.
Fungizone	PAN biotech	P06-01050
HBSS	Gibco	14175-053	Without phenol red, without Ca+2 and Mg+2
ICAM-1	abcam	ab171123
LYG-6 (Gr-1)	BD Biosciences	566218	Conjugated to BUV395; λmax excitation 348 nm, λmax emission 395 nm
Lysis buffer erythrocytes (ACK)	Sigma		Prepared, filtered with 0.22 µm sieve and stored at 4°C under sterile conditions by using the following formulas: NH4Cl, 0.15 M (molarity), 53.491 (mw) 4 g KHCO3 1 mM (molarity) 100.115 (mw), 50 mg EDTA  0.1 mM (molarity), 292.24 (mw), 14.6 g pH: 7.2–7.4
NanoDrop 1000 spectrophotometer	Thermoscientific
PBS	Lonza	17-516F	Without Ca+2  and Mg+2
Plastic petri dish			100 mm
Polystyren tube	Falcon	352070
q-Nano Gold	iZON science
RPMI 1640 culture medium: 2 g/L glucose	PAN biotech	p04-18047	Supplemented withsupplemented with Streptomycin (100 U/mL) /Penicillin (100 U/mL), Fungizone (250 mg/mL), L-glutamine (2 mM) and FBS 10%.
Scalpels
Sieve Nylon	Falcon USA	352360	100 µm
Streptomycin/Penicillin	PAN biotech	P06-07100
Syringe			2 mL
Trypan Blue	Biorad	1450013
VCAM1	abcam	ab215380