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요약

원형질막에서 흘러나온 미세소포는 세포 효과기 역할을 합니다. 비장 미세소포체(SMV)는 병태생리학적 상태의 대리 마커입니다. 쥐와 생쥐에서 SMV 함량 및 특성은 노화 또는 염증을 특징짓고 세포 보호 처리에 의해 변경되어 전임상 연구를 위한 중요하면서도 풍부한 모니터링 도구가 됩니다.

초록

미세소포(Microvesicle, MV)는 활성화된 세포의 원형질막에서 방출되는 서브미크론 단편으로, 전염증성 및 프로응고성 세포 효과기 역할을 합니다. 쥐의 경우, 비장 MV(SMV)는 병태생리학적 상태의 대리 마커입니다. 이전의 시험관 내 연구에서는 주요 치주 병원균인 포르피로모나스 진 지발리스(P. gingivalis)가 내피 탈락 및 세포사멸을 가능하게 하는 반면, 지질다당류(LPS)는 비장 세포 유래 미세소포체(SMV)의 탈락을 촉진하는 것으로 나타났습니다. 생체 내 연구는 SMV 흘림의 약리학적 제어의 타당성을 보여주었습니다. 본 프로토콜은 P. gingivalis 급성 쥐 감염 모델에서 비장 SMV를 분리하기 위한 표준화된 절차를 수립합니다. P. gingivalis 감염은 어린 C57BL/6 마우스에서 복강내 주사(주당 5 x 107 박테리아 3회 주사)에 의해 유발되었습니다. 2주 후, 비장을 채취하여 무게를 측정하고 비장 세포를 계수했습니다. SMV는 단백질, RNA 및 프로트롬비나제 분석에 의해 분리되고 정량화되었습니다. 세포 생존율은 프로피듐 요오드화물 또는 트리판 블루 배제 염료로 평가되었습니다. 비장세포 추출 후, 비장세포 배양 24시간 후 유세포분석으로 호중구 수를 얻었습니다. P. gingivalis를 주입한 마우스에서는 비장 무게가 2.5배 증가하고 비장 세포 수가 2.3배 증가한 것이 관찰되었으며, 호중구 수는 40배 증가했습니다. P. gingivalis를 주입한 마우스의 비장세포의 세포 생존율은 75%-96% 범위였으며 노출되지 않은 대조군과 비교하여 배양 24시간 후 50% 감소했습니다. 그러나 주입된 마우스의 비장세포는 프로트롬비나제 분석 또는 단백질 측정에 의해 더 많은 양의 MV를 방출합니다. 이 데이터는 procoagulant SMV가 복강내 P. gingivalis 감염에 대한 조기 비장 반응을 평가하는 신뢰할 수 있는 도구임을 보여줍니다.

서문

미세입자(microparticles) 또는 엑토솜(ectosome)이라고도 하는 미세소포(Microvesicles, MV)는 다양한 세포 자극에 반응하여 체액과 세포외 공간에서 방출되는 직경이 0.1-1.0μm인 원형질막 조각입니다. 처음에는 주로 포스파티딜세린(PSer)인 응고성 인지질에 노출되는 혈소판 분진으로 확인된 MV는 혈액 응고 복합체의 조립을 위한 추가 표면을 구성합니다 1,2. procoagulant effector로서 순환 MV의 주요 역할은 기능 장애 PSer 노출 및 출혈을 유발하는 희귀 유전 질환인 Scott syndrome2 환자에서 입증되었습니다(보충 그림 1). MV는 당뇨병, 만성 신장 질환, 자간전증, 고혈압과 같은 심혈관 질환과 관련된 만성 질환에서 혈전 위험의 순환 바이오마커로 광범위하게 연구되어 왔다 3,4. 그들은 현재 심근과 같은 유체 또는 장기 조직에서 진정한 세포 효과기로 인식되고 있습니다1. 이들은 활성 단백질, 지질, miRNA를 운반하기 때문에 지혈, 염증, 혈관 혈관 신생, 혈관 성장 또는 조직 리모델링과 같은 혈관 반응을 원격으로 조절합니다5.

임상연구에서 MV의 위험인자에 대한 예후값을 조사하는 한편, 환자의 체액이나 조직에서 분리된 MV는 MV의 효과기 특성을 체외(ex vivo )로 평가할 수 있다6. MV 생물 발생 및 누화 능력을 제어하는 메커니즘의 해독은 일반적으로 MV에 의해 노출되거나 MV 내에 캡슐화된 활성 분자와 그 다운스트림 신호 전달을 식별하기 위해 세포 배양 모델에서 수행됩니다. 타겟 세포와의 MV 상호 작용은 적절한 카운터 리간드를 사용할 수 있는 경우 막 단백질/단백질 결합 및/또는 지질 융합7에 따라 달라집니다.

생리학적 조건에서 혈장을 순환하는 MV는 대부분 혈관 세포에서 비롯되며, 이는 계통 클러스터 분화 마커(lineage cluster differentiation markers, CD)8,9에 의해 확인됩니다. 그러나 병리학, 특히 암10 및 이식 거부 반응11,12에서 MV는 손상된 조직에서 떨어져 나와 유해한 procoagulant 및 proinflammatory features를 가지고 있습니다. 이들은 전신 순환계에서 감지되어 보호 요법 또는 회춘 요법을 모니터링하는 데 유용한 프로브가 되며 가능한 약리학적 표적이 될 수 있습니다13. MV는 건강과 질병에서 혈관 및 조직 세포의 항상성을 반영하는 동적 저장 풀로 순환하기 때문에 소동물에서 IV 주사 또는 비강 점안 후 생체 내에서 원격 작용에 대한 더 나은 이해를 조사해야 합니다14,15. 실제로, MV는 과장된 염증과 혈전증을 연결하는 복잡한 경로의 주요 원인으로 간주되어 왔다16.

치주염은 치아 지지 조직에 영향을 미치는 감염성 염증성 질환이며, 17,18 혈전 위험과 관련이 있습니다. 치은 출혈, 치조골 파괴, 치아 이동성을 특징으로 하며 궁극적으로 치아 손실로 이어질 수 있습니다. 치주염은 전 세계적으로 매우 널리 퍼져 있으며 인구의 50% 이상에 영향을 미치며 11%는 심각한 형태19를 나타냅니다. 치주염은 치은하 생물막의 세균성 불균형에 의해 유발되며, 이는 조직 파괴를 유발하는 악화된 염증 반응을 지속합니다20. 지난 10년 동안 치주염은 심혈관 질환, 당뇨병, 류마티스 관절염과 같은 전신 질환과 관련이 있었습니다. 가능한 설명은 원거리에서 치주 병원체의 작용 및/또는 인터루킨(IL-1, IL-6) 및 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인에 의해 매개되는 전신 염증 증가입니다21,22.

치주염 발병 및 발병과 관련된 병원체 중 Porphyromonas gingivalis(P. gingivalis)23는 Toll-like-receptor(TLR) 매개 염증 반응을 유도하는 lipopolysaccharide(LPS)24 및 초기 감염 부위에서 호중구 및 다형성 핵 백혈구(PMN)의 동원을 포함하여 여러 독성 인자를 수확하는 가장 심각한 병변에서 발견됩니다26. P. gingivalis의 LPS는 TLR-4 또는 TLR-2를 활성화하여 면역 검출 및 박테리아 생존 회피를 촉진합니다27. 혈관 수준에서 LPS에 의한 TLR2의 활성화는 면역혈전증과 관련이 있습니다. TLR-4에 의존하는 인식이 현저히 손상된 상태에서 TLR-2 신호를 유발하는 P. gingivalis의 독특한 능력은 지속적인 저등급 감염을 선호합니다28,29.

저등급 병원체, 만성 및 지속적인 감염에 대한 MV 반응을 연구하기 위한 생체 내 절차는 부족합니다. 티스큘러 MV 추출에 대한 방법론적 접근은 문헌에 잘 기술되어 있지 않으며 일반적으로 비장이 혈류에서 박테리아와 바이러스를 감지하는 동안 고형 종양, 간 지방증, 무정맥 혈전성 플라크 또는 이식편과 같은 병리학적 조직에서 MV를 수확하는 것과 관련이 있습니다 11,29,30. 또한 면역 반응에 관여하는 적혈구, 혈소판, 림프구, 단핵구, 호염기구 및 호산구를 저장합니다. 적색 펄프의 호중구와 같은 과립구는 병원체를 파괴하고 감염 확산을 방지하는 활성산소종(ROS)과 프로테아제를 생성하기도 합니다31,32. 놀랍게도, 그리고 우리가 아는 한, 비장 MV는 병원체에 의한 조직 모욕의 맥락에서 조사되지 않았습니다. 생리병리학에서 tissular MVs의 다양성을 연구해야 하는 전 세계적인 미충족 요구가 있습니다.

본 실험실의 시험관 내 데이터에 따르면 LPS는 쥐의 비장세포에서 응고제 MV의 배출을 유도하며, 이는 다시 배양된 관상동맥 내피 세포의 노화와 연속적인 전염증성 및 전염증성 내피 내피 표현형11의 노화를 촉진합니다. 비장 MV의 약리학적 조절의 타당성은 최적화된 오메가-3 포뮬러로 동물을 치료한 후 추가로 입증되었습니다. 중년 및 고령 쥐의 구강 위는 비장 세포에서 procoagulant MVs의 흘림과 관상 동맥 내피 쪽으로 prosenous 유해 재산을 모두 보호하는 것으로 밝혀졌다33.

혈액과 비교했을 때, 비장은 한 개인에게 백혈구의 중요한 공급원이라는 이점을 제공합니다. 또한, 비장-심장 축(splenic-cardiac axis)이 최근 제안되었는데, 3,34, 비장은 약리학적 조절에 유익한 관심의 감염 관련 심혈관 위험에 기여할 수 있습니다. SMV 특성 또는 방출에 대한 평가는 병원체 유발 또는 염증 반응을 이해하는 데 중요합니다. 흥미롭게도, 그것은 치료 된 동물과 다른 생리 병리학 적 모델 (나이, 고혈압, 당뇨병)에서 달성 될 수 있습니다. 실제로, 중년층과 고령의 쥐를 비교함으로써33, 비장 MV의 특성과 방출의 차이는 간단한 24시간 비장세포 배양에 따라 입증될 수 있다.

생리병리학적 상태에 따른 비장 MV의 효과기 특성의 변화 및 랫트에서 이들의 약리학적 제어의 타당성에 대한 상기의 증거를 감안하여, 쥐 비장 MV의 분리를 위한 표준화된 프로토콜이 본원에 기술되어 있다. 이 절차는 궁극적으로 조작된 마우스에서 SMV 매개 효과를 지원하는 생체 내 메커니즘에 대한 심층 조사에 더 적합할 것입니다. 이 절차는 P. gingivalis 에 의한 국소 복강 내 감염을 사용하여 C57BL/6 마우스에서 비장 MV(SMV) 효과기 특성에 대한 병원체의 원격 작용에 대한 증거를 확립하기 위해 확립되었습니다.

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프로토콜

모든 실험 프로토콜은 지역 윤리 위원회(APAFIS#28745-2020121815051557)와 모교 및 INSERM의 동물 관리의 관련 지침에 의해 승인되고 따랐습니다. 생후 6-8주령의 수컷 Young C57BL/6 마우스를 실험에 사용했습니다. 통증과 스트레스를 평가하기 위해 생쥐를 정기적으로 검사하고 체중을 매일 모니터링했습니다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 추출 완충액과 용액은 멸균 상태여야 하며 실온에 있어야 합니다.

1. 동물 준비

  1. 2주 동안 2일마다 P. gingivalis (PG)를 복강내 6회 주사합니다(주당 5 x 107 박테리아 3회 주사, 보충 파일 1).
  2. 100mg/kg의 케타민과 10mg/kg의 자일라진을 조합하여 마우스를 마취합니다.
  3. 마취된 마우스를 희생하고 개복술 후 비장을 수확합니다.
    참고: P. gingivalis 의 감염에 대한 구체적인 조건과 비장 채취를 위한 동물의 희생은 보충 파일 1의 "동물 실험" 섹션에 자세히 설명되어 있습니다. 프로토콜 단계의 개략도는 그림 1에 나와 있습니다.

2. 비장 세포의 추출

  1. 메스를 사용하여 항생제(스트렙토마이신(100 U/mL)/페니실린(100 U/mL), 곰팡이존(250 mg/mL), L-글루타민(2 mM))을 함유한 RPMI 3mL로 이미 채워진 페트리 접시에 비장 조직을 ~1mm 조각으로 다지고 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충됩니다( 재료 표 참조).
  2. 슬라이스를 체( 재료 표 참조)로 옮기고, 체는 미리 50mL 폴리스티렌 튜브에 부착되어 있습니다.
  3. 주사기의 플런저를 절굿공이 같은 사용하여 체의 조직을 부수십시오.
  4. RPMI 배지(3mL)로 체를 헹굽니다.
  5. 세포 현탁액을 원심분리하고, 실온에서 5분 동안 450 x g 에서 용출하고, 역류에 의해 주의하여 상등액을 폐기합니다.

3. 삼투압 충격을 통한 적혈구 제거

  1. ACK 버퍼 1mL( 재료 표 참조)를 추가하고, 잘 섞고, 실온에서 3분 동안 배양한 다음 손으로 회전하여 부드럽게 흔듭니다.
  2. RPMI 9mL를 첨가하여 희석하고 흡인과 역류를 이용하여 잘 혼합합니다.
  3. 실온에서 450 x g 에서 5분 동안 원심분리기.
  4. 흡인 및 역류에 의해 상등액을 버리고 펠릿을 5mL의 RPMI 배지에 재현탁합니다.
  5. 부드럽게 혼합하고(흡인/역류) 최종적으로 피펫팅 또는 체를 사용하여 지질 찌꺼기를 제거합니다.

4. 고립된 비장세포 농도의 조정

  1. 900μL의 RPMI가 들어 있는 1.5mL 마이크로튜브를 채웁니다.
  2. 마이크로피펫을 사용하여 100μL의 세포 현탁액을 취하고 900μL의 RPMI 배지가 들어 있는 1.5mL 마이크로튜브에 넣고 잘 혼합합니다.
  3. 희석된 세포 10μL를 마이크로튜브에 옮기고, 트리판 블루 배제 염료 10μL를 첨가한 후 잘 혼합합니다.
  4. 용액 10μL를 배치하고(단계 3.3) 자동 세포 계수기( Table of Materials(재료표 참조)의 계수 슬라이드에 넣습니다.
    알림: 장치 소프트웨어는 총 세포 수와 살아있는 세포 수 및 백분율의 두 가지 값을 제공합니다.
  5. 살아있는 세포의 농도를 3 또는 5 x 106 cells/mL(Vmax = 20 mL, 최대 총 용량은 100 x 106 cells/mL)로 조정합니다.
  6. RPMI가 들어있는 75mL 플라스크에 세포를 파종합니다.
  7. 플라스크를 37°C의 가습 인큐베이터에서 24시간 동안 수직으로 배양합니다.
    주의: 트리판 블루는 돌연변이 유발 및 발암성 물질입니다35,36. 후드 밖에서도 계산하는 동안 장갑을 착용하십시오. 즉시 팁과 액체를 용기에 버리고 벤치 표면을 세척하십시오.
    참고: 수집된 세포가 50 x 106 미만인 경우 25mL 배양 플라스크를 사용합니다. 셀 번호는 개인마다 크게 달라서는 안 됩니다. 이 단계에서 살아있는 세포의 비율은 일반적으로 80%보다 우수합니다.

5. 비장세포 미세소포의 분리

  1. 24시간 후 플라스크 내용물을 50mL 폴리프로필렌 또는 폴리스티렌 튜브에 붓습니다.
  2. 실온에서 450 x g 의 원심분리기를 15분 동안 사용하여 세포와 파편을 제거합니다.
  3. 원심분리 후 100μL의 1차 상층액(SN1)을 유지하여 초기 MV 농도를 최종적으로 측정하고 분리 수율을 계산합니다. SN1 볼륨을 확인합니다.
  4. SN1을 실온에서 450 x g 에서 15분 동안 원심분리합니다.
  5. 펠릿과 원심분리기를 다시 버리고 실온에서 15분 동안 450 x g 에서 원심분리기를 사용합니다. SN2를 신속하게 인출하고 수집합니다(볼륨 참고).
  6. SN2를 바닥이 원뿔 모양인 1.8mL 마이크로튜브로 옮깁니다. 너무 많은 파편이 결국 SN1의 MV 측정을 손상시킬 경우 분리 수율을 계산하기 위해 초기 MV 농도의 최종 측정을 위해 100μL의 SN2를 유지하십시오.
  7. 펠릿(세포)에 RPMI 배지 5mL를 추가하고 비장 세포를 계수합니다.
    참고: 세포 현탁액은 0.1% 파라포름알데히드(최종 농도)37의 유세포 분석 특성화를 위해 고정할 수도 있습니다.
  8. 14,000 x g 에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리기 SN2를 가열한 후 4°C에서 빈 로터를 가동하여 로터를 미리 냉장합니다. 이 단계에서는 SN3를 생성합니다.
  9. 단일 멸균 50mL 튜브(후드 아래)를 뒤집어 각 마이크로튜브에서 SN3를 즉시 빼냅니다. SN3 볼륨을 확인합니다.
  10. 후드 아래의 피펫을 사용하여 SN3를 부드럽게 혼합합니다. 현탁액의 최종 측정을 위해 부분 표본을 보관하십시오.
    참고: 이 용액에는 이제 MV가 고갈되었지만 용해성 매개체와 엑소좀이 포함되어 있습니다.
  11. 스파이크 랙에서 각 마이크로튜브(닫힘)를 긁어 펠릿 내 MV의 재현탁을 기계적으로 선호합니다.
  12. 첫 번째 마이크로튜브에 Ca2+ 및 Mg2+ (HBSS)가 없는 Hank's balanced saline 용액 200μL를 추가합니다( 재료 표 참조).
  13. 1mL 마이크로피펫을 사용하여 부드러운 흡인/역류 주기(~10회)로 첫 번째 튜브의 MV 펠릿을 재현탁합니다. 거품이 생기지 않도록 세심한 주의를 기울이면 현탁액의 소포 및 기타 부분의 산화가 촉진됩니다.
  14. 재현탁된 MV의 첫 번째 200μL를 수확하고 펠릿 위의 두 번째 튜브에 붓습니다. 위와 같이 부드럽게 섞은 다음 세 번째 튜브에 다시 붓고 부드럽게 섞습니다. 서스펜션은 튜브에서 튜브로 점점 더 혼탁해집니다. 세 번째 튜브를 닫습니다.
  15. 위와 같이 다음 3개의 마이크로튜브 수집을 시작합니다(단계 4.14).
  16. 재현탁된 모든 MV를 단일(또는 2개) 수집기 마이크로튜브(바닥이 원뿔 모양인 2mL)에 수집합니다. 이 단계의 최종 수율 계산을 위해 50μL를 유지하십시오. 서스펜션 볼륨에 유의하십시오.
  17. 수집기 튜브를 14,000 x g 에서 4°C에서 1시간 동안 원심분리합니다. 이 단계에서는 SN4를 생성합니다.
  18. 즉시 SN4를 폐기합니다(상층액 수집 튜브 위에 붓습니다). 정제 단계의 수율을 계산하기 위해 SN4의 부분 표본을 유지하고 펠릿을 500μL의 HBBS(Ca2+ 및 Mg2+ 제외)에 부드럽게 재현탁합니다. 재현탁된 펠릿의 분취량을 50μL로 유지하여 정제 수율을 계산하고 부피를 기록합니다.
  19. 현탁액 펠릿을 4°C에서 최대 1개월 동안 보관하여 멸균 조건에서 기능 분석을 위해 또는 -20°C에서 구조 분석을 위해 보관합니다.
  20. 상층액 및/또는 펠릿 현탁액의 MV 농도를 측정하여 각 단계 또는 전체 절차의 정제 수율(아래 참고 참조)을 계산합니다.
    알림: 정화 수율(%): ([MV1] x SN1 부피) / ([MV4] x 최종 서스펜션 부피) x 100.
    이 수율은 배양 플라스크에서 분리된 비장 세포의 수로 합리화되고 4.4단계에서 계산되어야 합니다. 본 실험의 정제 수율은 111 x 106 세포 및 60mL의 상등액에서 시작하여 ~70%입니다.
    1. 상층액에 남아 있는 SMV가 고갈되어 주로 엑소좀(SN2 및 SN4)을 함유하고 있는 SMV를 측정하여 시술로 인한 SMV의 손실을 평가합니다.
    2. 높은 민감도와 특이성을 위해 TRPS 또는 프로트롬비나제 분석38 로 MV 농도를 측정합니다.
      주의 : 상층액을 빠르게 거꾸로 부어 원심 분리 후 MV를 수확합니다. U자형 마이크로튜브를 기다리거나 사용하면 마이크로튜브 벽에서 MV 손실이 발생합니다. 상층액을 버리기 위해 마이크로피펫을 사용하지 마십시오. 펠릿은 대신 흡입할 수 있습니다. 원심분리기가 중지된 후 프로세스를 지연시키지 마십시오. 과속 원심분리는 엑소좀에 의해 MV 펠릿을 오염시킬 수 있습니다.
      참고: 원심분리 속도와 지속 시간은 엑소좀에 의한 오염을 최소화하면서 MV 농축에 최적화되어 있습니다. 이 프로토콜은 비장 단핵구/대식세포 MV를 연구하는 데 신뢰할 수 없는데, 그 이유는 이러한 세포가 식세포를 형성하고 자신의 MV를 빠르게 재포착할 수 있기 때문입니다39. 프로토콜은 셀 생존력으로 인한 셀 손실 때문에 나중에 일시 중지하고 다시 시작할 수 없습니다.

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결과

제공된 데이터는 두 가지 주요 동물 상태, 즉 치료되지 않은 어린 C57BL/6 마우스와 그 새끼를 대조군에게 2일마다 2주일 동안 6번의 복강내(IP) PG 주사를 맞았습니다. 그들은 또한 2주 후 비장 반응에 대한 복강내 PG 주사의 원격 작용을 보여줍니다. 비장세포 미세소포는 프로트롬비나제 효소 분석법 또는 분광광도법으로 단백질 및 RNA 농도를 측정하여 정량화하였고, 호중구?...

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토론

본 연구는 비장이 생쥐에서 제한된 양의 혈액과 같은 다른 공급원에 비해 생리병리학적 관련성이 있는 MV의 중요하고 신뢰할 수 있는 공급원임을 확인합니다. 예방 조치를 취하면 이 방법을 쉽게 설정할 수 있으며 값비싼 장비가 필요하지 않습니다. 생체 내 평가 이외의 다른 방법이 없기 때문에 현재 모델은 MV 흘림에 대한 친약물의 영향을 연구하는 데 유용한 방?...

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공개

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 말

저자는 비장의 복합 유세포 분석 분석에 대한 전문가의 도움과 형성을 제공해 준 Service commun de cytométrie en flux(Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg)의 Claudine Ebel과 쥐 비장 세포 라벨링에 대한 초기 교육을 제공한 Ali El Habhab에게 빚을 지고 있습니다. 데니즈 카라교즈는 땅을 파고 출판물을 모으는 일을 도왔습니다. 이 연구는 두 개의 ANR 보조금 COCERP(N°A17R417B), ENDOPAROMP(N°ANR-17-CE17-0024-01)의 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2 mL tubes type EppendorfDutscher54816Conical bottom stériel microtubes
Allegra 64 R CentrifugeBeckman Coulter
Automatic cell counterBiorad
Bovine serum albuminEuromedex04-100-812-EPrepared, filtered with 0.22 µm sieve and stored at 4 °C under sterile conditions by using the following formulas: 2 mM EDTA, 0,5% BSA and sterile PBS
CD11 (Mac-1)e-Biosciences45-00112-80Conjugated to eFluor 450; λmax excitation 405 nm λmax emission 445 nm
CD16/32BD Biosciences553142unconjugated
EDTACalbiochemCalbiochemS 6381-92-6
Falcon tubeCell star22726150 mL
Fetal Bovine serumDutscherS1810-500Batch number = S14028S1810
Fortessa AriaBD Biosciencesfor cell sorting
Fortessa flow cytometerBecton-Dickinson.
FungizonePAN biotechP06-01050
HBSSGibco14175-053Without phenol red, without Ca+2 and Mg+2
ICAM-1abcamab171123
LYG-6 (Gr-1)BD Biosciences566218Conjugated to BUV395; λmax excitation 348 nm, λmax emission 395 nm
Lysis buffer erythrocytes (ACK)SigmaPrepared, filtered with 0.22 µm sieve and stored at 4°C under sterile conditions by using the following formulas: NH4Cl, 0.15 M (molarity), 53.491 (mw) 4 g
KHCO3 1 mM (molarity) 100.115 (mw), 50 mg
EDTA  0.1 mM (molarity), 292.24 (mw), 14.6 g
pH: 7.2–7.4
NanoDrop 1000 spectrophotometerThermoscientific
PBSLonza17-516FWithout Ca+2  and Mg+2
Plastic petri dish100 mm
Polystyren tubeFalcon352070
q-Nano GoldiZON science
RPMI 1640 culture medium: 2 g/L glucosePAN biotechp04-18047Supplemented withsupplemented with Streptomycin (100 U/mL) /Penicillin (100 U/mL), Fungizone (250 mg/mL), L-glutamine (2 mM) and FBS 10%.
Scalpels
Sieve NylonFalcon USA352360100 µm
Streptomycin/PenicillinPAN biotechP06-07100
Syringe2 mL
Trypan BlueBiorad1450013
VCAM1abcamab215380

참고문헌

  1. Loyer, X., et al. Intra-cardiac release of extracellular vesicles shapes inflammation following myocardial infarction. Circulation Research. 123 (1), 100-106 (2018).
  2. Aupeix, K., Toti, F., Satta, N., Bischoff, P., Freyssinet, J. M. Oyxsterols induce membrane procoagulant activity in monocytic THP-1 cells. Biochemical Journal. 314 (3), 1027-1033 (1996).
  3. Emami, S., et al. Antibiotic resistance pattern and distribution of pslA gene among biofilm producing Pseudomonas aeruginosa isolated from waste water of a burn center. Jundishapur Journal of Microbiology. 8 (11), 23669(2015).
  4. Burger, D., et al. Microparticles: biomarkers and beyond. Clinical Science. 124 (7), 423-441 (2013).
  5. Braeckmans, K., et al. Sizing nanomatter in biological fluids by fluorescence single particle tracking. Nano Letters. 10 (11), 4435-4442 (2010).
  6. Chironi, G. N., et al. Endothelial microparticles in diseases. Cell and Tissue Research. 335 (1), 143-151 (2009).
  7. Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
  8. Chen, T. S., et al. Mesenchymal stem cell secretes microparticles enriched in pre-microRNAs. Nucleic Acids Research. 38 (1), 215-224 (2010).
  9. Pirro, M., et al. Microparticles derived from endothelial progenitor cells in patients at different cardiovascular risk. Atherosclerosis. 197 (2), 757-767 (2008).
  10. Zahra, S., Anderson, J. A., Stirling, D., Ludlam, C. A. Microparticles, malignancy and thrombosis. British Journal of Haematology. 152 (6), 688-700 (2011).
  11. Amoura, L., et al. Assessment of plasma microvesicles to monitor pancreatic islet graft dysfunction: Beta cell- and leukocyte-derived microvesicles as specific features in a pilot longitudinal study. American Journal of Transplantation. 20 (1), 40-51 (2020).
  12. De Rop, C., et al. Evaluation of tissue factor bearing microparticles as biomarkers in allogeneic stem-cell transplantation. Transplantation. 92 (3), 351-358 (2011).
  13. de Abreu, R. C., et al. Native and bioengineered extracellular vesicles for cardiovascular therapeutics. Nature Reviews Cardiology. 17 (11), 685-697 (2020).
  14. Beitler, J. R., et al. Advancing precision medicine for acute respiratory distress syndrome. The Lancet Respiratory Medicine. 10 (1), 107-120 (2022).
  15. Porro, C., et al. Proinflammatory effect of cystic fibrosis sputum microparticles in the murine lung. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 721-728 (2013).
  16. Boisrame-Helms, J., et al. Lipid emulsions differentially affect LPS-induced acute monocytes inflammation: in vitro effects on membrane remodeling and cell viability. Lipids. 49 (11), 1091-1099 (2014).
  17. Kinane, D. F., Stathopoulou, P. G., Papapanou, P. N. Authors' reply: Predictive diagnostic tests in periodontal diseases. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), (2017).
  18. Kinane, D. F., Stathopoulou, P. G., Papapanou, P. N. Periodontal diseases. Nature Reviews Disease Primers. 3 (1), 1-14 (2017).
  19. Kassebaum, D. K., Tedesco, L. A. The 21(st)-century dental curriculum: a framework for understanding current models. Journal of Dental Education. 81 (8), 13-21 (2017).
  20. Hajishengallis, G., Chavakis, T., Hajishengallis, E., Lambris, J. D. Neutrophil homeostasis and inflammation: novel paradigms from studying periodontitis. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 539-548 (2015).
  21. Suh, J. S., et al. Periodontitis-induced systemic inflammation exacerbates atherosclerosis partly via endothelial-mesenchymal transition in mice. International Journal of Oral Science. 11 (3), 21(2019).
  22. Bugueno, I. M., et al. Porphyromonas gingivalis triggers the shedding of inflammatory endothelial microvesicles that act as autocrine effectors of endothelial dysfunction. Scientific Reports. 10 (1), 1778(2020).
  23. Hajishengallis, G., Lamont, R. J. Breaking bad: manipulation of the host response by Porphyromonas gingivalis. European Journal of Immunology. 44 (2), 328-338 (2014).
  24. Lamont, T., Worthington, H. V., Clarkson, J. E., Beirne, P. V. Routine scale and polish for periodontal health in adults. The Cochrane Database of Systematic Reviews. 12, (2018).
  25. Huck, O., et al. Reduction of articular and systemic inflammation by Kava-241 in a Porphyromonas gingivalis-induced arthritis murine model. Infection and Immunity. 86 (9), 00356(2018).
  26. Sochalska, M., Potempa, J. Manipulation of neutrophils by Porphyromonas gingivalis in the development of periodontitis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 197(2017).
  27. Kocgozlu, L., Elkaim, R., Tenenbaum, H., Werner, S. Variable cell responses to P. gingivalis lipopolysaccharide. Journal of Dental Research. 88 (8), 741-745 (2009).
  28. Slocum, C., et al. Distinct lipid a moieties contribute to pathogen-induced site-specific vascular inflammation. PLOS Pathogens. 10 (7), 1004215(2014).
  29. Thietart, S., Rautou, P. E. Extracellular vesicles as biomarkers in liver diseases: A clinician's point of view. Journal of Hepatology. 73 (6), 1507-1525 (2020).
  30. Witek, R. P., et al. Liver cell-derived microparticles activate hedgehog signaling and alter gene expression in hepatic endothelial cells. Gastroenterology. 136 (1), 320-330 (2009).
  31. Tahir, F., Ahmed, J., Malik, F. Post-splenectomy sepsis: a review of the literature. Cureus. 12 (2), 6898(2020).
  32. Hussain, M., Stover, C. M., Dupont, A. P. gingivalis in periodontal disease and atherosclerosis - scenes of action for antimicrobial peptides and complement. Frontiers in Immunology. 6, 45(2015).
  33. Qureshi, A. W., et al. Ageing enhances the shedding of splenocyte microvesicles with endothelial pro-senescent effect that is prevented by a short-term intake of omega-3 PUFA EPA:DHA 6:1. Biochemical Pharmacology. 173, 113734(2020).
  34. Dunford, A., Keramida, G., Anagnostopoulos, C. D., Michael Peters, A. The cardiosplenic axis: another obscure pathophysiological function of the spleen and its investigation using molecular imaging. Nuclear Medicine Communications. 38 (3), 205-208 (2017).
  35. Ford, R. J., Becker, F. F. The characterization of trypan blue-induced tumors in Wistar rats. The American Journal of Pathology. 106 (3), 326-331 (1982).
  36. Field, F. E., et al. Trypan blue: identification and teratogenic and oncogenic activities of its coloured constituents. Chemico-Biological Interactions. 16 (1), 69-88 (1977).
  37. Covarrubias, R., et al. Optimized protocols for isolation, fixation, and flow cytometric characterization of leukocytes in ischemic hearts. American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 317 (3), 658-666 (2019).
  38. El Habhab, A., et al. Significance of neutrophil microparticles in ischaemia-reperfusion: Proinflammatory effectors of endothelial senescence and vascular dysfunction. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (13), 7266-7281 (2020).
  39. Freyssinet, J. M. Cellular microparticles: what are they bad or good for. The Journal of Thrombosis and Haemostasist. 1 (7), 1655-1662 (2003).

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