微小解剖マウス脈絡叢からの免疫細胞の単離と特性評価

要約

この研究は、単離された灌流マウスの脳脈絡叢に対するフローサイトメトリーおよび2つの異なるゲーティング戦略を使用する。このプロトコルは、この脳構造に移入する主要な免疫細胞サブセットを識別します。

要約

脳はもはや孤立して機能する器官とは見なされていません。蓄積された証拠は、末梢免疫系の変化が間接的に脳機能を形作ることができることを示唆している。脳と全身循環の界面では、血液-脳脊髄液関門を構成する脈絡叢(CP)が末梢間通信の重要な部位として強調されている。CPは、脳脊髄液、神経栄養因子、および脳恒常性を形成することができるシグナル伝達分子を産生する。CPはまた、活性免疫学的ニッチである。生理学的条件下で主にミクログリアによって移入される脳実質とは対照的に、CP免疫細胞の不均一性は、他の末梢器官に見られる多様性を反復する。CP免疫細胞の多様性および活性は、加齢、ストレス、および疾患に伴って変化し、CP上皮の活性を調節し、それによって脳機能を間接的に形成する。このプロトコルの目標は、マウスCPを単離し、それらに生息する主要な免疫サブセットの約90%を同定することである。この方法は、CP免疫細胞を特徴付け、末梢と脳のコミュニケーションを調整する際のそれらの機能を理解するためのツールです。提案されたプロトコルは、CP免疫細胞が健康および様々な疾患状態にわたって脳機能を間接的にどのように調節するかを解読するのに役立つかもしれない。

概要

19^世紀後半にPaul Erhlichによって血液脳関門が発見されて以来、脳は他の臓器や血流から事実上分離されていると考えられてきました。しかし、この過去10年間に、脳機能は腸内微生物叢や全身性免疫細胞、シグナルなどのさまざまな生物学的要因によって形成されるという概念が出現しました^1,2,3,4。並行して、髄膜や脈絡叢(CP)などの他の脳境界は、不活性バリア組織ではなく、能動的免疫と脳のクロストークのインターフェースとして同定されている^5,6,7,8。

CPは血液脳脊髄液関門を構成し、脳と末梢を隔てる境界の1つである。それらは、脳の4つの心室のそれぞれ、すなわち、第3、第4、および両方の側脳室に位置し、海馬の脳室下帯および顆粒下帯などの神経新生に関与する領域に隣接している³。構造的には、CPは、上皮細胞の単層によって囲まれた有糞性毛細血管のネットワークで構成され、それらは緊密に連結され、接合部を接着する^9,10。CP上皮の主な生理学的役割には、老廃代謝産物およびタンパク質凝集体から脳を洗い流す脳脊髄液の産生、ならびにホルモンおよび神経栄養因子を含む様々なシグナル伝達分子の産生および制御された血液から脳への通過が含まれる^11,12,13。CPから分泌された分子は、神経新生およびミクログリア機能を調節することによって、脳の活動を形作り^14、15、¹⁶、¹⁷、¹⁸、^19、CPを脳の恒常性維持に決定的にする。CPはまた、様々な免疫活動に従事する;非病理学的条件下での脳実質における主な免疫細胞型はミクログリアであるのに対し、CP免疫細胞集団の多様性は末梢器官と同様に広範であり^3,7、CPでは免疫調節およびシグナル伝達の様々なチャネルが働いていることが示唆される。

内皮細胞と上皮細胞の間の空間であるCP間質は、主に境界関連マクロファージ(BAM)によって移入され、炎症シグナルに応答して抗原提示に関連する前炎症性サイトカインおよび分子を発現する³。マクロファージの別のサブタイプであるコルマーエピプレクサス細胞は、CP上皮²⁰の頂端表面に存在する。CP間質はまた、樹状細胞、B細胞、肥満細胞、好塩基球、好中球、先天性リンパ球細胞、および主にエフェクターメモリーT細胞であるT細胞のためのニッチであり、中枢神経系抗原を認識することができる⁷、^21、22、^23、24。さらに、CPにおける免疫細胞集団の組成および活性は、全身または脳の摂動、例えば加齢時^10、14、¹⁵、^21、25、微生物叢摂動⁷、ストレス26、および疾患^27、28の間に変化する。特に、これらの変化は間接的に脳機能を形作ることが示唆された、すなわち、CP CD4⁺ T細胞のTh2炎症へのシフトが脳の老化で起こり、加齢に伴う認知機能低下を形作る可能性のあるCPからの免疫シグナル伝達を誘発する14,15,21,25,29.したがって、CP免疫細胞の特性を明らかにすることは、CP上皮の生理学および分泌に対するそれらの調節機能をよりよく理解し、それによって健康および疾患条件下での脳機能に対するそれらの間接的な影響を解読するために極めて重要である。

CPは、少数の免疫細胞のみを含む小さな構造である。それらの単離は、灌流の予備段階の後に微小解剖を必要とする。血流中の免疫細胞は、さもなければ主要な汚染物質を構成するであろう。このプロトコルは、フローサイトメトリーを用いてCPの骨髄系およびT細胞サブセットを特徴付けることを目的としている。この方法は、免疫CPの不均一性を解剖するために他の方法を用いて最近発表された研究に従って、非炎症条件下でマウスCPを構成する免疫細胞集団の約90%を同定する⁷、^10、28。このプロトコルは、インビボでの疾患および他の実験パラダイムを伴うCP免疫細胞区画の変化を特徴付けるために適用することができる。

プロトコル

すべての手順は、実験動物の取り扱いに関する欧州委員会のガイドライン、指令86/609/EECと一致しました。これらは、倫理委員会第59号、CETEA/CEEA第089号、番号dap210067およびAPAFIS #32382-2021070917055505 v1で承認されました。

1. 材料の準備

1. すべての抗体(材料表)を4°Cで保管し、光曝露から保護した。
2. DAPIストック溶液(1mg/mL):粉末をPBS^−/− (材料表)に再懸濁し、アリコートし、−20°Cで保存する。
3. DAPI作業溶液(0.1mg/mL):DAPIストック溶液をPBS-^/- で1:10の比率で希釈する。
4. 磁気活性化細胞選別(MACS)緩衝液:2mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)および0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)(原料表)をPBS^−/−で調製する。
5. コラゲナーゼIVストック溶液(20U/μL):粉末をPBS^+/+ (材料表)に再懸濁し、アリコートし、-20°Cで保存する。
   注:コラゲナーゼIVは、_MgCl2 が完全に活性であることを必要とする。コラゲナーゼIV溶液を凍結融解しないでください。
6. 麻酔鎮痛液:150 μLのケタミン(150 mg / kg)、25 μlのキシラジン(5 mg / kg)、および330 μlのブプレケア(0.1 mg / kg)を1 mLのPBS^{に混合する-/-}。
   注:麻酔薬 - 鎮痛液を直ちに準備し、1日以上保管しないでください。
7. ヘパリン溶液(100U/mL):粉末をPBS-^/-に再懸濁する。
8. PBSで満たされたデカンタ三角にチューブを接続する注入注入システムを準備する-^/-。23G針を輸液チューブの四肢に接続します。輸液インセットを開き、チューブに気泡がなくなるまでPBSを作動させます。
9. ライトを装備した双眼ルーペを用意します。

2. C57BL/6マウスの飼育

1. CP骨髄系またはT細胞の分析のために、それぞれについて4匹のマウスを使用し、4つのCPをプールする(各側脳室から2匹、第3心室および第4心室CP;合計8匹のマウスについて)。CPをプールしないと、CP中の希少な免疫集団の検出に失敗するリスクが伴う。
2. マウスを実験の前に少なくとも7日間順応させてください。マウスを病原体のない条件下で一定の温度と湿度で、12/12時間または14/10時間の明暗サイクルで、水と標準的なペレット食品を 自由摂取させて保管してください。

3. PBS灌流と脳解剖

1. 各マウスに体重を量り、10 μL/gの麻酔薬 - 鎮痛剤混合溶液(ステップ1.6)を腹腔内に注射する。
2. 効率的な鎮痛のために約30分待ちます(マウスの数字をつまんで麻酔の深さを確認してください)。
3. 麻酔をかけられたマウスを背中の解剖支持体に平らに置き、手のひらを解剖支持体にテープで固定します。
4. 動物の皮膚を鉗子でつまみ、はさみを使用して、腹部、横隔膜、胸郭を開いて心臓を露出させます。
   注:胸郭が開くと、脳は無酸素になります。灌流の次のステップを正確かつ迅速に進めなければなりません。
5. 20 μLの100 U/mLヘパリン溶液を左心室に直接注入する。
6. 細かいはさみで、右心房に少なくとも3mmの切開を行い、血液が体から流出できるようにします。
7. 直後に、左心室の先端を通って注入チューブの四肢に置いた23G針を挿入する。
8. 最大で注入システムを開き、完全な灌流を待つ:23G針を使用して、約6mL /分の流速で、灌流は3分で完了する。
   注:肝臓などの臓器の変色さえも、灌流効果を証明しています。
9. 輸液システムを閉じ、心臓心室から針を取り外します。
10. マウスの手のひらからテープを取り外します。マウスを腹側の位置に置きます。
11. 動物の皮膚を鉗子でつまんではさみを使って、頭頂部の皮膚を目から耳まで取り除きます。
12. はさみの助けを借りて、最初に頭蓋骨を目の間に切り、次に各目から咬筋のすぐ上の脊髄まで横方向に切ります。このためには、はさみの四肢を使用し、はさみで脳を傷つけないように静かに進んでください。
13. 頭蓋骨を鉗子で開き、目の間の四肢からつまんでください。
14. はさみを使って脊髄を切断し、鉗子で脳を抽出し、脳の側面に2つの点を置いて傾け、氷冷PBS + ^{/ +}で満たされたペトリ皿に入れます。CPはすぐに収集されます。
    注:灌流効果を検証するために脳の変色を確認してください。

4. 脳からの脈絡叢の解剖

1. 脳背側をペトリ皿の上に置き、両眼ルーペの目標の下に置きます。
2. 脳を所定の位置に維持するための鉗子の助けを借りて、別の鉗子の両端を半球間の正中線を通して挿入します。
3. 鉗子を使用して、脳梁と海馬の皮質を中隔から引き離し、側脳室と第3心室の一部を露出させます。
4. 側方CPを、両端でフレアしている側心室を覆う長いベールとして識別する。細い鉗子の両端を使って横方向のCPをつかみます。海馬の後襞で隠れているかもしれない三角形の後部を集めるように注意してください。
5. 対側半球の脳梁と海馬の皮質を中隔から引き離して、第3心室全体と反対側の外側心室を露出させます。
6. 第3のCPを微細な鉗子で集めると、これは粒状の表面アスペクトを有する短い構造として識別することができる。
7. もう一方の側方CPを採取する。
8. 鉗子の両端を小脳と中脳の間に挿入します。小脳をポンと髄質から切り離して、第4心室を露出させます。
9. 第4のCPを、小脳と髄質の間の側方右端から左端に第4心室を横示す顆粒状表面側面を有する長い球状構造として同定する。細かい鉗子で4番目のCPを集める。
   注:鉗子のシランベースコーティングは、鉗子上のCPの粘着性を防ぐことができます。
10. 他の7匹のマウスのそれぞれについて、手順3.1〜4.9を繰り返します。その間、収集されたCPは、氷の上に置かれたチューブに時間的に保持することができる。

5. フローサイトメトリー分析用サンプルの調製

1. 解剖したすべてのCPを含むチューブを750 μLのPBS^+/+に充填する。
   注:チューブ内の薄い鉗子で解剖されたCPの堆積は、少量のPBS ^{+ / +}をもたらす。CP組織の損失の可能性を避けるために、既存の容量を750 μLに完了させるのではなく、それを除去して新鮮な750 μLのPBS^+/+ に置き換えます。
2. 15 μL の 20 U/μL コラゲナーゼ IV ストック溶液 (ステップ 1.5 を参照) を 400 U/mL の最終濃度で加えます。
   注: DNAse I (150 μg/mL) は、過剰な細胞凝集を防ぐことができます。
3. CPをコラゲナーゼIVと共に37°Cで軽度の撹拌下(300RPM)で45分間インキュベートする。
4. ピペットを10回程度軽く上下させ、CP解離を確定させた。
5. CPチューブを1.5mLにMACSバッファーで満たし(レシピステップ1.4を参照)、コラゲナーゼIV活性を停止します。
   注:コラゲナーゼIV活性は低温で停止し、血清アルブミンによって阻害される。
6. 細胞を500 x gで遠心分離し、4°Cで5分間遠心分離する。 上清を捨て、1.5 mLのMACSバッファーで細胞を洗浄する。
7. 細胞を500 x g で4°Cで5分間遠心分離する。 上清を廃棄し、細胞を220 μLのMACSバッファーに再懸濁する。
8. 細胞懸濁液から10 μLのアリコートを分離し、未染色対照として使用する(次のステップ5.18)。
9. DAPI-モノ染色コントロールとして使用する細胞懸濁液から10 μLのアリコートを分離する(次のステップ5.12)。
10. 残りの200 μLを抗マウスCD16/CD32ブロッキング抗体(1:100)と共に4°Cで20分間プレインキュベートし、非特異的Fc媒介相互作用を遮断した。
11. 細胞を2本の100μLチューブ(1本は骨髄系細胞分析用、もう1本はT細胞分析用)に分割する(次のステップ5.14)。
12. DAPI-モノ染色対照用の細胞10 μLでサンプルを採取し(ステップ5.9)、MACSバッファーで最大100 μLまで充填します(次のステップ5.14)。
13. 抗体モノ染色(ステップ5.14.4)および全染色コントロール(ステップ5.14.5)用の100μLのMACSを含む11本の新しいチューブを準備し、それぞれに1滴の補償ビーズを追加します。
    注:補償制御により、蛍光検出レーザーの電圧を設定し、さらに補償される他のチャネルにおける蛍光色素の潜在的な非特異的シグナル検出を評価できます。
14. サンプルの抗体インキュベーション:
    1. 骨髄系サンプル:0.1mg/mL DAPI(1:100)(ステップ1.3参照)、FITC抗マウスCD45(1:100)、PE-Dazzle 594抗マウスCD11b(1:100)、APC抗マウス_CX3CR1(1:100)、BV711抗マウスLy6C(1:100)、PE抗マウスF4/80(1:100)、およびAPC-Cy7抗マウスIA-IE(1:100)を添加する。
    2. T細胞サンプル:0.1 mg/mL DAPI(1:100)、FITC抗マウスCD45(1:100)、PE-Dazzle 594抗マウスCD11b(1:100)、APC抗マウスTCRβ(1:100)、PE抗マウスCD8a(1:100)、およびAPC-Cy7抗マウスCD4(1:50)を加える。
    3. DAPI モノ染色コントロール (ステップ 5.12 から): 0.1 mg/mL DAPI (1:100) を追加します。
    4. 抗体モノ染色補償ビーズ:骨髄系およびT細胞サンプル(同じ希釈液)に対して予め使用した9つの抗体のそれぞれを、ビーズを含む9つのチューブに別々に(チューブごとに1つずつ)加える。
       注:モノ染色補償コントロールは、補償ステップ中に使用された蛍光マーカーのそれぞれについて蛍光の陽性ピークの決定を可能にする。分析装置は、それらを染色されていない対照CP細胞で観察された陰性シグナルと比較する。
    5. 抗体全染色補償ビーズ:骨髄染色に使用したすべての抗体を1つのチューブに追加し、T細胞染色に使用した抗体を別のチューブに追加します。
       注:すべて染色された補償制御により、各蛍光レーザー検出の電圧を設定し、他のチャネルにおける蛍光色素の潜在的な非特異的シグナル検出を評価できます。
    6. 氷上で30〜45分間インキュベートし、光曝露から保護する。
15. 1.5 mL までのすべてのチューブを MACS バッファーで満たします。細胞および補償ビーズを500 x gで遠心分離し、4°Cで5分間培養する。
16. 上清を捨て、細胞および補償ビーズを1.5mLのMACS緩衝液で洗浄する。
17. 細胞および補償ビーズを500 x gで遠心分離し、4°Cで5分間培養する。 上清を捨てる。
18. 細胞および補償ビーズを500 μLのMACSバッファーに再懸濁する。染色されていないコントロール(ステップ5.8)を最大500 μLまでMACSバッファーで充填します。
19. 各チューブを 70 μm のストレーナー (未染色 CP、DAPI モノ染色コントロール、および骨髄系および T 細胞サンプル) を通して CP 細胞でろ過します。

6. フローサイトメトリー

注:このプロトコルで使用されるフローサイトメーターには、355 nm UVレーザー、405 nmバイオレットレーザー、488 nm青色レーザー、561 nm黄緑色レーザー、637 nm赤色レーザーの5つのレーザーが装備されています。

1. サイトメーターのセットアップ、トラッキング(CST)インターフェース、およびCSTコントロールビーズを使用して、サイトメーターの毎日の品質管理チェックを実行し、分析、機器の品質、および一貫したターゲット蛍光強度間の一貫性を確保します。
2. フローサイトメトリー実験を設定するには、2 変量プロットとヒストグラムを使用して新しい実験を作成します。集録を監視するために、前方散乱領域(FSC-A)プロットと側方散乱領域(SSC-A)プロット、および各色のヒストグラムプロットが含まれていることを確認してください。
3. 染色されていないコントロールCP細胞上のFSC-AおよびSSC-AパラメータのPMT電圧を設定することにより、細胞形態を定義します。
4. 染色されていない対照CP細胞上の蛍光色素の負のピークと、すべての抗体で染色された補償ビーズを使用して蛍光色素の陽性ピークを設定し、検出器シグナルがスケールから外れておらず、他のチャネルで強すぎる交差検出が行われていないことを確認することによって、各蛍光マーカーの電圧を定義します。
5. 報酬マトリックスを作成して、各単色補正コントロールを分析します。適切な FSC-A/SSC-A 集団でゲートした後、ヒストグラムプロットの単一染色コントロールを確認し、補正コントロールを記録します。すべての単一染色サンプルを記録した後、補償マトリックスを計算します。
6. 骨髄系細胞集団とT細胞集団の両方について検出されたすべてのイベントを記録します。

7. CP骨髄系細胞ゲーティング

1. FSC-A 対 SSC-A を選択し、セルのゲートを (サイズに基づいて) 選択します。
2. FSC-A対前方散乱高さ(FSC-H)の単一セルのドーターゲートを作成します。
3. DAPI⁺ 細胞を除外するために、DAPI対FSC-Aで生細胞のドーターゲートを作成します。
4. ^CD45+免疫細胞のドーターゲートをCD45対FSC-Aで作成します。
5. CD45⁺細胞からドーターゲートを作成し、CD11b対F4/80を選択し、CD11b+ F4/80⁺およびCD11b⁺ F4/80^-集団の2つのグループを同定する(次のステップ7.8)。
6. CD11b⁺ F4/80⁺セルのドーター・ゲートを作成し、_CX3CR1とIA-IEを選択します。さらにCD11b⁺ F4/^80high CX3CR1+ IA-IE+ BAMと_CX3CR1+ IA-IE⁺ BAMと_CX3CR1+ IA-IE⁺ マクロファージの両方を特定します。
7. CD11b+ F4/80+ CX3CR1⁺ IA-IE-マクロファージのドーターゲートを作成し、F4/80対CD11bを選択します。CD11bhigh F4/80^中間体とCD11b+ F4/80high集団の両方を特定し、さらにCD11bhigh F4/^{80intermediate} _CX3CR1⁺ IA-IE^- コルマーのエピプレクサスマクロファージおよびCD11b ⁺ F4/^80high _CX3と呼ばれる。 CR1⁺ IA-IE^- BAM をそれぞれ。
   注: CD11bhigh F4/80中間 CX3CR1+ IA-IE- および CD11b+ F4/80high _CX3CR1+ IA-IE- 細胞は、F4/80^中間 F4/80high レベルと CD11bhigh-CD11b⁺ レベルの間で少し混ざり合って現れました。
8. CD11b ⁺ F4/80-集団(ステップ7.5)から、Ly6C対^IA-IEのゲート。主に単球/好中球に対応するIA-IE+ ^Ly6C-集団およびIA-IE-Ly6C⁺細胞の両方を選択します。
   注:IA-IE-Ly6C ⁺細胞の高い存在は、炎症状態のない動物の灌流有効性の問題を反映している可能性が高い。彼らの豊富さは低いはずです。
9. CD11b+ F4/80-IA-IE+ Ly6C^-集団のドーターゲートを作成し、CD11bとCX3CR1を選択し、CD11bhigh CX3CR1lowとCD11b⁺ _CX3CR1^-の両方の集団を特定します。

8. CP T細胞ゲーティング

1. FSC-A 対 SSC-A を選択し、セルのゲートを (サイズに基づいて) 選択します。
2. FSC-A対前方散乱高さ(FSC-H)の単一セルのドーターゲートを作成します。
3. DAPI⁺ 細胞を除外するために、DAPI対FSC-Aで生細胞のドーターゲートを作成します。
4. ^CD45+免疫細胞のドーターゲートをCD45対FSC-Aで作成します。
5. CD45⁺細胞からドーターゲートを作成し、TCRβ対CD11b^{を選択する}。
6. TCRβ⁺ CD11b^-集団のドーターゲートを作成し、CD4対CD8aを選択する。^CD8-CD4+ T細胞およびCD8^{+ CD4-T}細胞の両方^を同定する。

結果

ここで紹介したフローサイトメトリー解析により、骨髄系細胞とT細胞の主要なサブセット(それぞれ図1と図2)と、マウス1匹あたりの相対的な総数が再現性の高い方法で明らかになりました(図3)。

骨髄系細胞のフローサイトメトリー分析では、CPにはCD11b+ _CX3CR1⁺ F4/^80high BAMが...

ディスカッション

脳の恒常性と疾患に対する免疫学的寄与を理解することを目的とした研究は、主に脳実質内に存在する細胞に焦点を当てており、脳機能に重要な寄与者であるCPなどの脳の境界を無視しています^2,3。CPにおける免疫細胞集団の分析は、CPのサイズが小さく、常在免疫細胞の数が少なく、この組織への複雑なアクセスのために困難である。全脳免疫細?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553142	Flow cytometry antibody
Albumin, bovine	MP Biomedicals	160069	Blocking reagent
APC anti-mouse CX3CR1	BioLegend	149008	Flow cytometry antibody
APC anti-mouse TCRb	BioLegend	109212	Flow cytometry antibody
APC-Cy7 anti-mouse CD4	BioLegend	100414	Flow cytometry antibody
APC-Cy7 anti-mouse IA-IE	BioLegend	107628	Flow cytometry antibody
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences		Flow cytometry analyzer
BV711 anti-mouse Ly6C	BioLegend	128037	Flow cytometry antibody
Collagenase IV	Gibco	17104-019	Enzyme to dissociate CP tissue
DAPI	Thermo Scientific	62248	Live/dead marker
EDTA			Ion chelator
fine scissors	FST	14058-11	Dissection tool
FITC anti-mouse CD45	BioLegend	103108	Flow cytometry antibody
Flow controller infusion inset	CareFusion	RG-3-C	Blood perfusion inset
FlowJo software	BD Biosciences		Analysis software
forceps	FST	11018-12	Dissection tool
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Anticoagulant
Imalgene	Boehringer Ingelheim		Ketamine, anesthesic
OneComp eBeads	Invitrogen	01-1111-42	Control beads to realize compensation
PBS-/-	Gibco	14190-094	Buffer
PBS+/+	Gibco	14040-091	Buffer
PE anti-mouse CD8a	BioLegend	100708	Flow cytometry antibody
PE anti-mouse F4/80	BioLegend	123110	Flow cytometry antibody
PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b	BioLegend	101256	Flow cytometry antibody
Rompun	Bayer		Xylazine, anesthesic
thin forceps	Dumoxel Biology	11242-40	Dissection tool
Vetergesic	Ceva		Buprenorphin, analgesic