Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışmada akım sitometrisi ve izole perfüze edilmiş farelerin beyin koroid pleksusları üzerinde iki farklı geçit stratejisi kullanılmaktadır; Bu protokol, bu beyin yapısını dolduran ana bağışıklık hücresi alt kümelerini tanımlar.

Özet

Beyin artık izole bir şekilde işleyen bir organ olarak kabul edilmiyor; Biriken kanıtlar, periferik bağışıklık sistemindeki değişikliklerin dolaylı olarak beyin fonksiyonlarını şekillendirebileceğini göstermektedir. Beyin ve sistemik dolaşım arasındaki arayüzde, kan-beyin omurilik sıvısı bariyerini oluşturan koroid pleksuslar (SP), periferi-beyin iletişiminin kilit bir yeri olarak vurgulanmıştır. SP, beyin omurilik sıvısını, nörotrofik faktörleri ve beyin homeostazını şekillendirebilen sinyal moleküllerini üretir. SP aynı zamanda aktif bir immünolojik niştir. Fizyolojik koşullar altında esas olarak mikroglia tarafından doldurulan beyin parankiminin aksine, SP bağışıklık hücrelerinin heterojenliği, diğer periferik organlarda bulunan çeşitliliği özetler. SP immün hücre çeşitliliği ve aktivitesi yaşlanma, stres ve hastalık ile değişir ve SP epitelinin aktivitesini modüle eder, böylece dolaylı olarak beyin fonksiyonunu şekillendirir. Bu protokolün amacı, murin SP'yi izole etmek ve onları dolduran ana bağışıklık alt kümelerinin yaklaşık% 90'ını tanımlamaktır. Bu yöntem, SP bağışıklık hücrelerini karakterize etmek ve periferi-beyin iletişimini düzenlemedeki işlevlerini anlamak için bir araçtır. Önerilen protokol, SP bağışıklık hücrelerinin sağlıkta ve çeşitli hastalık koşullarında beyin fonksiyonlarını dolaylı olarak nasıl modüle ettiğini deşifre etmeye yardımcı olabilir.

Giriş

19. yüzyılın sonlarında Paul Erhlich tarafından kan-beyin bariyerinin keşfedilmesinden bu yana, beynin diğer organlardan ve kan dolaşımından neredeyse ayrı olduğu düşünülmektedir. Yine de, bu son on yılda, beyin fonksiyonlarının bağırsak mikrobiyotası ve sistemik bağışıklık hücreleri ve sinyalleri gibi çeşitli biyolojik faktörler tarafından şekillendirildiği kavramının ortaya çıkışına tanık olunmuştur1,2,3,4. Buna paralel olarak, meninksler ve koroid pleksuslar (SP) gibi diğer beyin sınırları, inert bariyer dokularından ziyade aktif immün-beyin çapraz konuşmasının arayüzleri olarak tanımlanmıştır5,6,7,8.

SP, beyin ve çevresini ayıran sınırlardan biri olan kan-beyin omurilik sıvısı bariyerini oluşturur. Beynin dört ventrikülünün her birinde, yani üçüncü, dördüncü ve her iki lateral ventrikülde bulunurlar ve hipokampusun subventriküler bölgesi ve subgranüler bölgesi gibi nörogenezde yer alan alanlara bitişiktirler3. Yapısal olarak, SP, sıkı ve yapışkan kavşaklarla birbirine bağlanan tek katmanlı bir epitel hücresi tarafından çevrelenmiş bir federe kan kılcal damarları ağından oluşur9,10. SP epitelinin başlıca fizyolojik rolleri, beyni atık metabolitlerden ve protein agregalarından temizleyen beyin omurilik sıvısının üretimini ve hormonlar ve nörotrofik faktörler de dahil olmak üzere çeşitli sinyal moleküllerinin üretimini ve kontrollü kandan beyne geçişini içerir11,12,13. SP'den salgılanan moleküller beynin aktivitesini şekillendirir, yani nörogenezi ve mikroglial fonksiyonu modüle ederek14,15,16,17,18,19, bu da SP'yi beyin homeostazı için çok önemli kılar. SP ayrıca çeşitli bağışıklık aktivitelerine katılır; patolojik olmayan koşullar altında beyin parankimindeki ana immün hücre tipi mikroglia iken, SP immün hücre popülasyonlarının çeşitliliği periferik organlardaki kadar geniştir3,7, bu da SP'de çeşitli immün regülasyon ve sinyal kanallarının iş başında olduğunu düşündürmektedir.

Endotel ve epitel hücreleri arasındaki boşluk, CP stroma, esas olarak, inflamatuar sinyallere yanıt olarak pro-inflamatuar sitokinleri ve antijen sunumuyla ilişkili molekülleri eksprese eden sınırla ilişkili makrofajlar (BAM) ile doldurulur3. Makrofajların bir başka alt tipi olan Kolmer epipleksus hücreleri, CP epitelinin apikal yüzeyinde bulunur20. CP stroma ayrıca dendritik hücreler, B hücreleri, mast hücreleri, bazofiller, nötrofiller, doğuştan gelen lenfoid hücreler ve çoğunlukla merkezi sinir sistemi antijenlerini tanıyabilen efektör hafıza T hücreleri olan T hücreleri için bir niştir7,21,22,23,24. Ek olarak, SP'deki bağışıklık hücresi popülasyonlarının bileşimi ve aktivitesi, sistemik veya beyin pertürbasyonu üzerine, örneğin yaşlanma sırasında10,14,15,21,25, mikrobiyota pertürbasyonu7, stres26 ve hastalık27,28 sırasında değişir. Özellikle, bu değişikliklerin dolaylı olarak beyin fonksiyonunu şekillendirdiği öne sürülmüştür, yani CP CD4 + T hücrelerinin Th2 inflamasyonuna doğru kayması beyin yaşlanmasında meydana gelir ve yaşlanma ile ilişkili bilişsel gerilemeyi şekillendirebilecek SP'den bağışıklık sinyalini tetikler14,15,21,25,29 . Bu nedenle, SP immün hücrelerinin özelliklerini aydınlatmak, SP epitel fizyolojisi ve sekresyonu üzerindeki düzenleyici işlevlerini daha iyi anlamak ve böylece sağlıklı ve hastalık koşulları altında beyin fonksiyonu üzerindeki dolaylı etkilerini deşifre etmek için çok önemli olacaktır.

SP, sadece birkaç bağışıklık hücresi içeren küçük yapılardır. İzolasyonları, perfüzyonun ön adımından sonra mikrodiseksiyon gerektirir; aksi takdirde kan dolaşımındaki bağışıklık hücreleri büyük kirleticiler oluşturur. Bu protokol, akım sitometrisi kullanarak SP'nin miyeloid ve T hücre alt kümelerini karakterize etmeyi amaçlamaktadır. Bu yöntem, enflamatuar olmayan koşullar altında fare SP'sini oluşturan immün hücre popülasyonlarının yaklaşık% 90'ını, immün CP heterojenliğini diseke etmek için diğer yöntemleri kullanan yakın zamanda yayınlanan çalışmalara uygun olarak tanımlar7,10,28. Bu protokol, SP immün hücre bölmesindeki değişiklikleri hastalık ve diğer deneysel paradigmalarla in vivo olarak karakterize etmek için uygulanabilir.

Protokol

Tüm prosedürler, laboratuvar hayvanlarının taşınmasına ilişkin Avrupa Komisyonu yönergeleri, 86/609/EEC sayılı direktif ile aynı fikirdedir. 59 No'lu etik kurullar, CETEA/CEEA No. 089 tarafından, dap210067 ve APAFIS #32382-2021070917055505 v1 numarası altında onaylanmıştır.

1. Malzemelerin hazırlanması

  1. Tüm antikorları (Malzeme Tablosu) ışığa maruz kalmaktan korunarak 4 °C'de saklayın.
  2. DAPI stok çözeltisi (1 mg / mL): Tozu PBS -/- (Malzeme Tablosu), aliquot içinde yeniden askıya alın ve -20 ° C'de saklayın.
  3. DAPI çalışma çözeltisi (0,1 mg/mL): DAPI stok çözeltisini PBS-/- ile 1:10 oranında seyreltin.
  4. Manyetikle aktive edilmiş hücre ayıklama (MACS) tamponu: PBS-/- içinde 2 mM etilen diamin tetraasetik asit (EDTA) ve% 0.5 sığır serum albümini (BSA) (Malzeme Tablosu) hazırlayın.
  5. Kollajenaz IV stok çözeltisi (20 U / μL): Tozu PBS +/+ (Malzeme Tablosu), alikot içinde yeniden askıya alın ve -20 ° C'de saklayın.
    NOT: Kollajenaz IV, MgCl2'nin tamamen aktif olmasını gerektirir; Kollajenaz IV solüsyonunu dondurup çözmeyin.
  6. Anestezik-analjezik çözelti: 1 mL PBS-/- içinde 150 μL ketamin (150 mg/kg), 25 μl ksilazin (5 mg/kg) ve 330 μl buprecare (0.1 mg/kg) karışımı.
    NOT: Anestezik-analjezik solüsyonu zamansız olarak hazırlayın ve bir günden fazla tutmayın.
  7. Heparin çözeltisi (100 U/mL): Tozu PBS-/- içinde yeniden askıya alın.
  8. PBS-/- ile doldurulmuş bir dekanter Erlenmeyer'e bir tüp bağlayan infüzyon giriş sistemini hazırlayın. İnfüzyon tüpünün ekstremitesine 23 G'lik bir iğne bağlayın. İnfüzyon girişini açın ve PBS'nin tüpte kabarcık kalmayana kadar çalışmasına izin verin.
  9. Bir ışıkla donatılmış dürbün büyüteç hazırlayın.

2. C57BL/6 farelerin muhafazası

  1. CP miyeloid veya T hücrelerinin analizi için, her biri için dört fare kullanın ve dört CP'yi bir araya getirin (her lateral ventrikülden iki, üçüncü ventrikül ve dördüncü ventrikül CP; toplamda sekiz fare için). SP'nin havuzlanmaması, düşük bollukları nedeniyle SP'deki nadir immün popülasyonları tespit edememe riskini taşır.
  2. Herhangi bir deneyden önce farelerin en az 7 gün iklimlendirmesine izin verin. Fareleri patojensiz koşullar altında sabit sıcaklık ve nemde, 12/12 saat veya 14/10 saat açık / karanlık döngüsünde, su ve standart pelet gıda ad libitum ile tutun.

3. PBS perfüzyonu ve beyin diseksiyonu

  1. Her fareyi ağırlıklandırın ve intraperitoneal olarak 10 μL / g anestezik-analjezik karışım çözeltisi (adım 1.6) enjekte edin.
  2. Etkili analjezi için yaklaşık 30 dakika bekleyin (farenin rakamlarını sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin).
  3. Anestezi uygulanan fareyi sırt üstü yassı, diseksiyon desteğinin üzerine yerleştirin ve avuç içlerini diseksiyon desteğine bantlayın.
  4. Hayvanın derisini forseps ile sıkıştırarak ve makas kullanarak, kalbi açığa çıkarmak için karnı, diyaframı ve toraksı açın.
    NOT: Toraks açıldığında, beyin anoksik hale gelir. Perfüzyonun sonraki adımlarında kesin ve hızlı bir şekilde ilerlenmelidir.
  5. 20 μL 100 U/mL heparin solüsyonunu doğrudan sol ventriküle enjekte edin.
  6. İnce makasla, kanın vücuttan dışarı akmasına izin vermek için sağ atriyumda en az 3 mm'lik bir kesi yapın.
  7. Hemen sonra, infüzyon tüpünün ekstremitesine yerleştirilen 23 G iğneyi sol ventrikülün ucundan yerleştirin.
  8. İnfüzyon sistemini maksimumda açın ve tam perfüzyon için bekleyin: 23 G'lik bir iğne kullanarak, yaklaşık 6 mL / dak'lık bir akış hızında, perfüzyon 3 dakikada tamamlanır.
    NOT: Karaciğer gibi organların eşit renk değişikliği, perfüzyon etkinliğini kanıtlar.
  9. İnfüzyon sistemini kapatın ve iğneyi kalp ventrikülünden çıkarın.
  10. Bandı farenin avuçlarından çıkarın. Fareyi ventral konuma getirin.
  11. Hayvanın derisini forseps ile sıkıştırmak ve makas kullanmak, başın üst kısmının derisini gözlerden kulaklara kadar çıkarın.
  12. Makas yardımıyla, kafatasını önce gözler arasında, sonra da her bir gözden maseter kaslarının hemen üstündeki omuriliğe yanal olarak kesin. Bunun için makas ekstremitesini kullanın ve beyne makasla zarar vermemek için yavaşça ilerleyin.
  13. Kafatasını forseps ile gözler arasındaki ekstremiteden sıkıştırarak açın.
  14. Omuriliği kesmek ve beyni forsepslerle çıkarmak için makas kullanın, iki noktasını beynin yan tarafına yerleştirerek eğin ve buz gibi soğuk PBS + / + ile dolu bir Petri kabına yerleştirin. CP daha sonra derhal toplanır.
    NOT: Perfüzyon etkinliğini doğrulamak için beynin renk değişikliğini kontrol edin.

4. Koroid Pleksusun beyinden diseksiyonu

  1. Beyin sırt tarafını Petri kabında yukarı ve dürbün büyüteçlerinin hedeflerinin altına yerleştirin.
  2. Beyni yerinde tutmak için forseps yardımıyla, başka bir forsepsin iki ucunu yarımküreler arasındaki orta çizgiden aşağıya yerleştirin.
  3. Kallozum ve hipokampus ile korteksi septumdan uzaklaştırmak, lateral ventrikülü ve üçüncü ventrikülün bir kısmını açığa çıkarmak için forsepsleri kullanın.
  4. Lateral SP'yi, her iki ucunda parlayan lateral ventrikülü kaplayan uzun bir örtü olarak tanımlayın. Yanal SP'yi yakalamak için ince bir forsepsin iki ucunu kullanın. hipokampusun arka kıvrımı tarafından gizlenebilecek üçgen arka kısmı toplamaya dikkat edin.
  5. Korpus kallozum ve kontralateral yarımkürenin hipokampüsü ile korteksi septumdan uzağa çekerek üçüncü ventrikülün tamamını ve karşı lateral ventrikülü açığa çıkarın.
  6. İnce forsepslerle, granüler yüzey yönüne sahip kısa bir yapı olarak tanımlanabilen üçüncü CP'yi toplayın.
  7. Diğer lateral SP'yi toplayın.
  8. Forsepsin iki ucunu beyincik ve orta beyin arasına yerleştirin. Dördüncü ventrikülü ortaya çıkarmak için beyinciği pons ve medulladan ayırın.
  9. Dördüncü SP'yi, dördüncü ventrikülü lateral sağ uçtan sol uca serebellum ve medulla arasında hizalayan granüler bir yüzey yönüne sahip uzun küresel bir yapı olarak tanımlayın. Dördüncü CP'yi ince forsepslerle toplayın.
    NOT: Forsepslerin silan bazlı kaplaması, forsepslerde CP'nin yapışmasını önleyebilir.
  10. Diğer yedi farenin her biri için 3.1-4.9 arasındaki adımları yineleyin. Bu arada, toplanan CP geçici olarak buz üzerine yerleştirilmiş bir tüp içinde tutulabilir.

5. Akış sitometrisi analizi için numunelerin hazırlanması

  1. Tüm disseke CP'yi içeren tüpü 750 μL PBS+/++ ile doldurun.
    NOT: Disseke SP'nin tüp içinde ince forseps ile birikmesi, küçük bir PBS +/++ hacmi getirir. CP dokusunun olası bir kaybını önlemek için mevcut hacmi 750 μL'ye kadar çıkarın ve taze 750 μL PBS + / + ile değiştirin.
  2. 400 U/mL nihai konsantrasyon için 15 μL 20 U/μL Kollajenaz IV stok çözeltisi ekleyin (bkz. adım 1.5).
    NOT: DNAse I (150 μg / mL) aşırı hücre kümelenmesini önleyebilir.
  3. CP'yi Kollajenaz IV ile 37 °C'de hafif ajitasyon (300 RPM) altında 45 dakika boyunca inkübe edin.
  4. CP ayrışmasını tamamlamak için yaklaşık 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipet çekin.
  5. Kollajenaz IV aktivitesini durdurmak için CP tüpünü MACS tamponuyla 1,5 mL'ye kadar doldurun (tarif adım 1.4'e bakın).
    NOT: Kollajenaz IV aktivitesi düşük sıcaklıkta durdurulur ve serum albümini tarafından inhibe edilir.
  6. Hücreleri 500 x g'da, 5 dakika boyunca, 4 ° C'de santrifüj edin. Süpernatantı atın ve hücreleri 1,5 mL MACS tamponu ile yıkayın.
  7. Hücreleri 500 x g'de 5 dakika boyunca, 4 ° C'de santrifüj edin. Süpernatantı atın ve hücreleri 220 μL MACS tamponunda yeniden askıya alın.
  8. 10 μL'lik bir alikotu lekesiz kontrol olarak kullanılacak hücre süspansiyonundan ayırın (bir sonraki adım 5.18).
  9. DAPI-mono-boyalı kontrol olarak kullanılacak hücre süspansiyonundan 10 μL'lik bir aliquot'u ayırın (bir sonraki adım 5.12).
  10. Spesifik olmayan Fc aracılı etkileşimleri engellemek için kalan 200 μL'yi anti-fare CD16/CD32 bloke edici antikor (1:100) ile 4 °C'de 20 dakika boyunca önceden inkübe edin.
  11. Hücreleri iki adet 100 μL tüpe bölün (biri miyeloid hücre analizi, diğeri T hücreleri analizi için) (sonraki adım 5.14).
  12. DAPI-mono-boyalı kontrol için numuneyi 10 μL hücre ile alın (adım 5.9) ve MACS tamponu ile 100 μL'ye kadar doldurun (sonraki adım 5.14).
  13. Antikor mono-boyalı (adım 5.14.4) ve tamamen lekeli kontroller (adım 5.14.5) için 100 μL MACS içeren on bir yeni tüp hazırlayın ve her birine bir damla kompanzasyon boncuğu ekleyin.
    NOT: Kompanzasyon kontrolleri, floresan algılama lazerinin voltajının ayarlanmasına izin verecek ve diğer kanallardaki floresan boyanın potansiyel spesifik olmayan sinyal algılamasını değerlendirecektir.
  14. Numunelerin antikor inkübasyonu:
    1. Miyeloid örnek: 0,1 mg/mL DAPI (1:100) ekleyin (bkz. adım 1.3), FITC fare karşıtı CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 fare karşıtı CD11b (1:100), APC fare karşıtı CX3CR1 (1:100), BV711 fare karşıtı Ly6C (1:100), PE fare karşıtı F4/80 (1:100) ve APC-Cy7 fare karşıtı IA-IE (1:100) ekleyin.
    2. T hücreleri örneği: 0,1 mg/mL DAPI (1:100), FITC fare karşıtı CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 fare karşıtı CD11b (1:100), APC fare karşıtı TCRβ (1:100), PE fare karşıtı CD8a (1:100) ve APC-Cy7 fare karşıtı CD4 (1:50) ekleyin.
    3. DAPI-mono-boyalı kontrol (adım 5.12'den itibaren): 0.1 mg/mL DAPI (1:100) ekleyin.
    4. Antikor mono-boyalı kompanzasyon boncukları: Miyeloid ve T hücreleri örnekleri için daha önce kullanılan dokuz antikorun her birini (aynı seyreltme), ayrı ayrı (her tüp için bir tane) boncukları içeren dokuz tüpe ekleyin.
      NOT: Tek lekeli kompanzasyon kontrolleri, kompanzasyon adımı sırasında kullanılan floresan işaretleyicilerin her biri için pozitif floresan piklerinin belirlenmesine izin verecektir. Analizör bunları lekesiz kontrol CP hücrelerinde gözlenen negatif sinyalle karşılaştıracaktır.
    5. Antikor tüm boyalı kompanzasyon boncukları: Miyeloid boyama için kullanılan tüm antikorları bir tüpe ve T hücrelerinin boyanması için kullanılanları bir başkasına ekleyin.
      NOT: Tamamen lekeli kompanzasyon kontrolleri, her floresan lazer algılamanın voltajının ayarlanmasına izin verecek ve diğer kanallardaki floresan boyanın potansiyel spesifik olmayan sinyal algılamasını değerlendirecektir.
    6. Buzda 30-45 dakika kuluçkaya yatıştırın, ışığa maruz kalmaktan koruyun.
  15. 1,5 mL'ye kadar olan tüm tüpleri MACS tamponuyla doldurun. Hücreleri ve kompanzasyon boncuklarını 500 x g'da, 5 dakika boyunca, 4 ° C'de santrifüj edin.
  16. Süpernatantı atın ve hücreleri yıkayın ve boncukları 1,5 mL MACS tamponunda toplayın.
  17. Hücreleri ve kompanzasyon boncuklarını 500 x g'da, 5 dakika boyunca, 4 ° C'de santrifüj edin. Süper natantı atın.
  18. Hücreleri yeniden askıya alın ve boncukları 500 μL MACS tamponunda telafi edin. MACS tamponuyla 500 μL'ye kadar lekesiz kontrolü (adım 5,8) doldurun.
  19. Her tüpü CP hücreleri ile 70 μm'lik bir süzgeçten (lekesiz CP, DAPI mono-boyalı kontrol ve miyeloid ve T hücre örnekleri) filtreleyin.

6. Akış sitometrisi

NOT: Bu protokolde kullanılan akış sitometresi aşağıdaki 5 lazerle donatılmıştır: 355 nm UV lazer, 405 nm Menekşe lazer, 488 nm Mavi lazer, 561 nm Sarı-Yeşil lazer ve 637 nm Kırmızı lazer.

  1. Analizler, cihaz kalitesi ve tutarlı hedef floresan yoğunlukları arasında tutarlılık sağlamak için sitometre kurulumunu, izleme (CST) arayüzünü ve CST kontrol boncuklarını kullanarak sitometre üzerinde günlük kalite kontrol kontrollerini gerçekleştirin.
  2. Akış sitometrisi deneyini ayarlamak için, iki değişkenli grafikler ve histogramlarla yeni bir deney oluşturun. Edinimi izlemek için her renk için bir ileri dağılım alanı (FSC-A) ve yan dağılım alanı (SSC-A) grafiklerinin yanı sıra histogram grafiklerinin de dahil edildiğinden emin olun.
  3. Lekesiz kontrol CP hücrelerinde FSC-A ve SSC-A parametreleri için PMT voltajını ayarlayarak hücre morfolojisini tanımlayın.
  4. Her floresan işaretleyicinin voltajlarını, lekesiz kontrol CP hücreleri üzerindeki florokromların negatif piklerini ve tüm antikorlarla boyanmış kompanzasyon boncuklarını kullanarak florokromların pozitif piklerini ayarlayarak ve dedektör sinyallerinin ölçek dışı olmamasını ve diğer kanallarda çok güçlü bir şekilde çapraz algılanmamasını sağlayarak tanımlayın.
  5. Tek renkli ücret denetimlerinin her birini çözümlemek için bir ücret matrisi oluşturun. Uygun FSC-A/SSC-A popülasyonlarına geçiş yaptıktan sonra, histogram grafiklerinde tek lekeli kontrolleri kontrol edin ve telafi kontrollerini kaydedin. Tüm tek lekeli örnekleri kaydettikten sonra, kompanzasyon matrisini hesaplayın.
  6. Hem miyeloid hem de T hücre popülasyonları için tespit edilen tüm olayları kaydedin.

7. CP miyeloid hücre geçidi

  1. FSC-A ve SSC-A ve hücreler için geçit (boyuta göre) seçeneğini belirleyin.
  2. FSC-A ve ileri dağılım yüksekliği (FSC-H) ile tek hücreler için bir alt kapı oluşturun.
  3. DAPI+ hücrelerini dışlamak için DAPI ve FSC-A ile canlı hücreler için bir alt kapı oluşturun.
  4. CD45 ve FSC-A ile CD45+ bağışıklık hücreleri için bir alt kapı oluşturun.
  5. CD45+ hücrelerinden bir alt kapı oluşturun ve CD11b ile F4/80 arasındaki farkı seçin, aşağıdaki iki grubu tanımlayın: CD11b+ F4/80+ ve CD11b+ F4/80- popülasyonları (sonraki adım 7.8).
  6. CD11b+ F4/80+ hücreleri için bir alt kapı oluşturun ve CX3CR1 ve IA-IE'yi seçin. CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE+ BAM ve CX3CR1+ IA-IE- makrofajları olarak adlandırılan CX3CR1+ IA-IE+ BAM'ı tanımlayın.
  7. CD11b+ F4/80+ CX3CR1+ IA-IE- makrofajları için bir alt kapı oluşturun ve F4/80 ile CD11b'yi seçin. CD11bhigh F4/80intermediate ve CD11b+ F4/80high popülasyonlarını tanımlayın ve bunlar daha sonra CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- Kolmer'in epipleksus makrofajları ve CD11b+ F4/80high CX3 olarak adlandırılır CR1+ IA-IE- BAM, sırasıyla.
    NOT: CD11bhigh F4/80intermediate CX3CR1+ IA-IE- ve CD11b+ F4/80high CX3CR1+ IA-IE- hücreleri, F4/80intermediate-F4/80high ve CD11bhigh-CD11b+ seviyeleri arasında biraz karışık görünüyordu.
  8. CD11b + F4/80- popülasyonundan (adım 7.5), Ly6C ve IA-IE için kapı. Hem IA-IE+ Ly6C- popülasyonunu hem de esas olarak monositlere/nötrofillere karşılık gelen IA-IE+ Ly6C+ hücrelerini seçin.
    NOT: IA-IE- Ly6C + hücrelerinin yüksek varlığı, muhtemelen enflamatuar bir durum olmadan hayvanların perfüzyon etkinliğindeki sorunları yansıtır; bollukları düşük olmalıdır.
  9. CD11b+ F4/80- IA-IE+ Ly6C- popülasyonu için bir alt kapı oluşturun ve CD11b ve CX3CR1'i seçin, CD11bhigh CX3CR1low ve CD11b+ CX3CR1- popülasyonlarını tanımlayın.

8. CP T hücreleri geçidi

  1. FSC-A ve SSC-A ve hücreler için geçit (boyuta göre) seçeneğini belirleyin.
  2. FSC-A ve ileri dağılım yüksekliği (FSC-H) ile tek hücreler için bir alt kapı oluşturun.
  3. DAPI+ hücrelerini dışlamak için DAPI ve FSC-A ile canlı hücreler için bir alt kapı oluşturun.
  4. CD45 ve FSC-A ile CD45+ bağışıklık hücreleri için bir alt kapı oluşturun.
  5. CD45+ hücrelerinden bir alt kapı oluşturun ve TCRβ ile CD11b'yi seçin. CD11b+ miyeloid hücreleri hariç tutun ve TCRβ+ CD11b- T hücreleri popülasyonunu seçin.
  6. TCRβ+ CD11b- popülasyonu için bir alt kapı oluşturun ve CD4 ile CD8a'yı seçin. Hem CD8- CD4+ T hücrelerini hem de CD8+ CD4-T hücrelerini tanımlayın.

Sonuçlar

Burada sunulan akış sitometrisi analizleri, miyeloid ve T hücrelerinin ana alt kümelerini (sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 2) ve fare başına göreceli toplam sayılarını yüksek oranda tekrarlanabilir bir şekilde (Şekil 3) başarıyla ortaya koymuştur.

Miyeloid hücrelerin akış sitometrisi analizi, SP'nin, CP'deki CD45 + bağışıklık hücrelerinin neredeyse% 80'ini temsil eden CD...

Tartışmalar

Beyin homeostazı ve hastalığına immünolojik katkıları anlamayı amaçlayan çalışmalar, esas olarak beyin parankimi içinde bulunan hücrelere odaklanmış, SP gibi beyin sınırlarını ihmal etmiş, ancak yine de beyin fonksiyonuna çok önemli katkılarda bulunmuştur2,3. SP'deki bağışıklık hücresi popülasyonlarının analizi, SP'nin küçük boyutu, düşük sayıda yerleşik bağışıklık hücresi ve bu dokuya karmaşık erişim nedeniyle z...

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Institut Pasteur Animalerie Centrale'ye ve CB-UTechS tesis üyelerine yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Institut Pasteur tarafından finansal olarak desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-mouse CD16/CD32BD Biosciences553142Flow cytometry antibody
Albumin, bovineMP Biomedicals160069Blocking reagent
APC anti-mouse CX3CR1BioLegend149008Flow cytometry antibody
APC anti-mouse TCRbBioLegend109212Flow cytometry antibody
APC-Cy7 anti-mouse CD4BioLegend100414Flow cytometry antibody
APC-Cy7 anti-mouse IA-IEBioLegend107628Flow cytometry antibody
BD FACSymphony A5 Cell AnalyzerBD BiosciencesFlow cytometry analyzer
BV711 anti-mouse Ly6CBioLegend128037Flow cytometry antibody
Collagenase IVGibco17104-019Enzyme to dissociate CP tissue
DAPIThermo Scientific62248Live/dead marker
EDTAIon chelator
fine scissorsFST14058-11Dissection tool
FITC anti-mouse CD45BioLegend103108Flow cytometry antibody
Flow controller infusion insetCareFusionRG-3-CBlood perfusion inset
FlowJo softwareBD BiosciencesAnalysis software
forcepsFST11018-12Dissection tool
HeparinSigma-AldrichH3149-10KUAnticoagulant
ImalgeneBoehringer IngelheimKetamine, anesthesic
OneComp eBeadsInvitrogen01-1111-42Control beads to realize compensation
PBS-/-Gibco14190-094Buffer
PBS+/+Gibco14040-091Buffer
PE anti-mouse CD8aBioLegend100708Flow cytometry antibody
PE anti-mouse F4/80BioLegend123110Flow cytometry antibody
PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11bBioLegend101256Flow cytometry antibody
RompunBayerXylazine, anesthesic
thin forcepsDumoxel Biology11242-40Dissection tool
VetergesicCevaBuprenorphin, analgesic

Referanslar

  1. Morais, L. H., Schreiber, H. L., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  2. Deczkowska, A., Schwartz, M. Targeting neuro-immune communication in neurodegeneration: Challenges and opportunities. Journal of Experimental Medicine. 215 (11), 2702-2704 (2018).
  3. Croese, T., Castellani, G., Schwartz, M. Immune cell compartmentalization for brain surveillance and protection. Nature Immunology. 22 (9), 1083-1092 (2021).
  4. Erny, D., et al. Host microbiota constantly control maturation and function of microglia in the CNS. Nature Neuroscience. 18 (7), 965-977 (2015).
  5. Mrdjen, D., et al. High-dimensional single-cell mapping of central nervous system immune cells reveals distinct myeloid subsets in health, aging, and disease. Immunity. 48 (2), 380-395 (2018).
  6. Korin, B., et al. single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  7. van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  8. Ajami, B., et al. Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models. Nature Neuroscience. 21 (4), 541-551 (2018).
  9. Wolburg, H., Paulus, W. Choroid plexus: Biology and pathology. Acta Neuropathologica. 119 (1), 75-88 (2010).
  10. Dani, N., et al. A cellular and spatial map of the choroid plexus across brain ventricles and ages. Cell. 184 (11), 3056-3074 (2021).
  11. Falcão, A. M., Marques, F., Novais, A., Sousa, N., Palha, J. A., Sousa, J. C. The path from the choroid plexus to the subventricular zone: Go with the flow. Frontiers in Cellular Neuroscience. 6, (2012).
  12. Shipley, F. B., et al. Tracking calcium dynamics and immune surveillance at the choroid plexus blood-cerebrospinal fluid interface. Neuron. 108 (4), 623-639 (2020).
  13. Mazucanti, C. H., et al. Release of insulin produced by the choroids plexis is regulated by serotonergic signaling. JCI Insight. 4 (23), (2019).
  14. Baruch, K., et al. Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function. Science. 346 (6205), 89-93 (2014).
  15. Deczkowska, A., et al. Mef2C restrains microglial inflammatory response and is lost in brain ageing in an IFN-I-dependent manner. Nature Communications. 8 (1), (2017).
  16. Silva-Vargas, V., Maldonado-Soto, A. R., Mizrak, D., Codega, P., Doetsch, F. Age-dependent niche signals from the choroid plexus regulate adult neural stem cells. Cell Stem Cell. 19 (5), 643-652 (2016).
  17. Iliff, J. J., et al. Impairment of glymphatic pathway function promotes tau pathology after traumatic brain injury. Journal of Neuroscience. 34 (49), 16180-16193 (2014).
  18. Redzic, Z. B., Preston, J. E., Duncan, J. A., Chodobski, A., Szmydynger-Chodobska, J. The choroid plexus-cerebrospinal fluid system: From development to aging. Current Topics in Developmental Biology. 71, 1-52 (2005).
  19. da Mesquita, S., et al. Functional aspects of meningeal lymphatics in ageing and Alzheimer's disease. Nature. 560 (7717), 185-191 (2018).
  20. Schwarze, E. -. W. The origin of (Kolmer's) epiplexus cells. Histochemistry. 44 (1), 103-104 (1975).
  21. Baruch, K., et al. CNS-specific immunity at the choroid plexus shifts toward destructive Th2 inflammation in brain aging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (6), 2264-2269 (2013).
  22. Kunis, G., et al. IFN-γ-dependent activation of the brain's choroid plexus for CNS immune surveillance and repair. Brain. 136 (11), 3427-3440 (2013).
  23. Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: From origin to neuropsychiatric disease. Nature Reviews Neuroscience. 15 (5), 300-312 (2014).
  24. Goldmann, T., et al. fate and dynamics of macrophages at central nervous system interfaces. Nature Immunology. 17 (7), 797-805 (2016).
  25. Fung, I. T. H., et al. Activation of group 2 innate lymphoid cells alleviates aging-associated cognitive decline. Journal of Experimental Medicine. 217 (4), (2020).
  26. Kertser, A., et al. Corticosteroid signaling at the brain-immune interface impedes coping with severe psychological stress. Science Advances. 5, 4111 (2019).
  27. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  28. Yang, A. C., et al. Dysregulation of brain and choroid plexus cell types in severe COVID-19. Nature. 595 (7868), 565-571 (2021).
  29. Baruch, K., et al. PD-1 immune checkpoint blockade reduces pathology and improves memory in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Medicine. 22 (2), 135-137 (2016).
  30. Baruch, K., et al. Breaking immune tolerance by targeting Foxp3+ regulatory T cells mitigates Alzheimer's disease pathology. Nature Communications. 6, 7967 (2015).
  31. Rodríguez-Rodríguez, N., Flores-Mendoza, G., Apostolidis, S. A., Rosetti, F., Tsokos, G. C., Crispín, J. C. TCR-α/β CD4 − CD8 − double negative T cells arise from CD8 + T cells. Journal of Leukocyte Biology. 108 (3), 851-857 (2020).
  32. Schafflick, D., et al. Single-cell profiling of CNS border compartment leukocytes reveals that B cells and their progenitors reside in non-diseased meninges. Nature Neuroscience. 24 (9), 1225-1234 (2021).
  33. Quintana, E., et al. DNGR-1+ dendritic cells are located in meningeal membrane and choroid plexus of the noninjured brain. GLIA. 63 (12), 2231-2248 (2015).
  34. Kabashima, K., et al. Biomarkers for evaluation of mast cell and basophil activation. Immunological Reviews. 282 (1), 114-120 (2018).
  35. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  36. Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. Microglia: Immune and non-immune functions. Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır