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要約

この研究では、プロナーゼE消化、過メチル化、および質量分析の組み合わせによる糖タンパク質のグライコミクス分析の方法を提示します。この分析法は、細菌のN型糖鎖を含むあらゆるタイプのN型糖鎖を解析することができます。

要約

タンパク質のグリコシル化は、最も一般的で複雑な翻訳後修飾の1つです。糖鎖の特定の役割、糖鎖の構造とタンパク質の機能への影響との関係を特徴付けるために、多くの技術が開発されてきました。糖鎖解析の一般的な方法は、エキソグリコシダーゼ切断を使用して、ペプチド-N-グリコシダーゼF(PNGase F)を使用して糖タンパク質または糖ペプチドからN結合型糖鎖を遊離させることです。しかし、細菌の糖鎖-タンパク質結合は異なり、細菌の糖タンパク質から糖鎖を遊離させる酵素はありません。さらに、遊離糖鎖は、哺乳類の細胞、細菌、酵母、植物、魚類でも記載されています。本稿では、標的タンパク質に結合していないアスパラギン(Asn)結合型糖鎖および遊離糖鎖を検出することにより、Campylobacter jezuniのN結合型糖鎖化系を特徴づける方法を紹介します。この方法では、C. jejuniの全タンパク質をPronase Eによって消化され、酵素とタンパク質の比率が高く(2:1−3:1)、インキュベーション時間が長くなりました(48−72時間)。得られたAsn型糖鎖と遊離糖鎖を多孔質グラファイトカーボンカートリッジで精製し、パーメチル化し、質量分析法で分析しました。

概要

タンパク質のN-グリコシル化は、真核生物1における最も一般的で複雑な翻訳後修飾の1つです。N型糖鎖は、タンパク質のフォールディングに重要な役割を果たしており、生合成トラフィックにおけるタンパク質の選別にも影響を与えます2。質量分析は、エキソグリコシダーゼ切断によって放出される糖鎖の分析(グライコミクス)に広く使用されています。残りの脱グリコシル化ペプチド(グリコプロテオミクス)は、真核生物3のグリコシル化ペプチドの配列を同定するために一般的に使用されています。Campylobacter jezuniにおけるN結合型糖鎖の同定は、N-グリコシル化が真核生物4,5,6,7,8に限定されないことを示唆した。しかし、細菌については、糖鎖解析のための効果的なエキソグリコシダーゼやオリゴ糖を放出するエンドグリコシダーゼが不足しています。

糖タンパク質のグリコシル化部位と糖鎖構造を特徴付けるために、非特異的なタンパク質分解を使用してほとんどのペプチドの骨格を消化し、少数のアミノ酸のみを含む偽オリゴ糖を生成する別のアプローチが開発されました。さまざまな非特異的酵素が偽オリゴ糖の生成に使用されており、Pronase Eが最も効率的で再現性のある消化を提供することがわかっています9。私たちは、C. jejuni N-グリカン10,11を解析するために、Pronase Eに基づくグライコミクス戦略を開発しました。疑似オリゴ糖は、キャピラリー電気泳動質量分析(CE-MS)および/または過メチル化後のマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析(MALDI-TOF MS)によって直接分析されました。

ここでは、非特異的なPronase E消化とパーメチル化を使用して粘膜病原体 C.jejuniからのグリコシル化を研究するグライコミクス分析の普遍的な方法について説明します。この方法は、真核生物系と細菌系の両方で発現するN結合型糖鎖の特性評価が可能であり、N結合型糖鎖修飾経路の新規中間体の同定にも有用です。

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プロトコル

1. C. jejuni 11168Hの培養と総タンパク質の抽出

注: C. jejuni 11168Hは、NCTC 1116812の高運動性クローン性誘導体です。

  1. 細胞ペレット(約0.15 g、NCTC)を約5 mLのMueller-Hinton培地で再水和して細胞培養を開始します。一次ブロスチューブを数滴使用して、Mueller-Hinton寒天プレートに接種します。.微好気性雰囲気、すなわち5%O2、10%CO2、および85%N2の下で37°Cで18時間インキュベートします。
  2. 1mLのBrain Heart Infusion(BHI)ブロスで細菌の芝生を収穫します。収穫物をBHIブロスで約1 x 105 cfu / mLになるように希釈します。37°Cの微好気性雰囲気中で振とう(100rpm)しながら18時間細胞を増殖させます。
  3. プレートを氷上に10分間置いて細胞を冷却し、遠心分離(4°Cで4,500 x g )で細胞を回収します。上清を捨て、氷冷した0.1 M Tris-HCl(pH 7.8)の3 Lで細胞を2回洗浄します。
  4. 細胞(10、8-10、11 C. jejuni 細胞)を8 mLの氷冷0.1 M Tris-HCl(pH 7.8)に再懸濁し、超音波処理により溶解します(材料表)。次のように超音波処理を行います:4秒パルス、1秒オフ、毎回1分、合計3回。
  5. 9,500 x g で4°Cで45分間遠心分離し、上清を別のチューブに移します。上清中のタンパク質を0.1 M Tris-HCl(pH 7.5)に対して2回、4°Cで3時間透析します。
  6. 市販のProtein Assay13 (4〜6 μg/μLの範囲)でタンパク質濃度を測定します。
  7. 1 mLの0.1 M Tris-HCl緩衝液(pH 7.5)に1 mgのタンパク質を溶解し、2.5 mgのPronase Eを溶液に加えます。37°Cで48時間インキュベートした後、溶液を100°Cで5分間煮沸して酵素を不活性化します。
  8. タンパク質消化液は、さらに使用するために-80°Cで保存してください。

2. 多孔質黒鉛カーボン(PGC)による精製

  1. 0.1 % トリフルオ酢酸(TFA)を含む 80% (v/v) アセトニトリル (ACN) 1 mL を加えて PGC カートリッジ (100 mg、5 mL) を活性化し、2 回繰り返します。
  2. PGCカートリッジを1 mLの水で3回洗浄します。
  3. 1 mgのタンパク質からPronase E消化液をPGCにロードします(容量はタンパク質濃度に依存します)。
  4. カートリッジを毎回1mLの水で3回洗って塩分を取り除きます。
  5. 1 mL の 25% ACN を 0.1 % TFA に溶出し、続いて 1 mL の 50% ACN を 0.1 % TFA に溶出します。
  6. 両方のフラクションをプールし、冷蔵真空濃縮器(Table of Materials)でサンプルを乾燥させて、さらに処理します。
    注:Asn-glycan精製にはMSグレードの溶媒を使用してください。

3. Asn型糖鎖の過メチル化

  1. 乾燥したAsn型糖鎖を1.5 mLチューブ中の100 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)で可溶化します。
  2. 2 mL の DMSO に 2 mL の NaOH ペレットを混合して、DMSO-NaOH スラリーを調製します。200 μLのDMSO-NaOHスラリーと100 μLのヨウ化メチルをサンプルに加えます。
  3. チューブにしっかりとキャップをし、ボルテックスミキサーで室温で3,000rpmで10分間攪拌します。
  4. 1mLの水を加えてパーメチル化をクエンチします。
  5. 1 mLのクロロホルムとボルテックスを1分間加えて、ペルメチル化Asn-グリカンを抽出します。
  6. 9,000 x gで3分間遠心分離します。上清を取り除き、ペルメチル化Asn-グリカンを含む下部クロロホルム相を保持します。
  7. 有機層を洗浄するには、1mLの水を加えてボルテックスで1分間加熱します。9,000 x g で3分間遠心分離し、上清を除去します。2回繰り返します。
  8. 有機相をヒュームフードに入れ、窒素流で室温で乾燥させます。
  9. 過メチル化Asn-glycansを-80°Cで保存し、質量分析にかけます。

4. エレクトロスプレーイオン化質量分析(ESI-MS)およびESI-MS/MS分析

  1. ペルメチル化Asn-グリカンを50% 2-プロパノール20 μLの水(v/v)に溶解します。
  2. 90 cmの裸のフューズドシリカキャピラリーを使用し、シースフローが50% 2-プロパノールの水中水溶液(1 μL/min)で行いました。
    注:CE-MSは、キャピラリー電気泳動(CE)と質量分析を組み合わせたシステムです。CEは、イオン移動度に基づいてイオンを分離します。このプロトコルでは、CEシステムを使用して微量のサンプルを導入し、オンラインで脱塩を行います。
  3. ESI電圧を正のモードで5kVに設定します。
  4. ペルメチル化 Asn-glycan サンプルを 500 mbar で 0.2 分間ロードします (これは約 100 nL に相当します)。
  5. 質量分析計(Table of Materials)を用いて、以下の取得パラメータを用いてMSデータを取得します。
    1. フル MS の場合は、滞留時間を 0.1 m/z 単位のステップあたり 2.0 ミリ秒に設定します。MS2 およびMS3 の実験で、プロダクトイオンスキャン(EPI)を強化して、スキャン速度を4,000 Da/sに設定し、Q0トラップを使用します。トラップのフィル時間を 「Dynamic 」に、Q1の解像度を 「Unit」に設定します。MS3 実験では、励起係数を設定して、単一の荷電したプリカーサーのモノアイソトピックピークのみが選択されるようにします。励起時間を 100 ミリ秒に設定します。

5. MALDI-TOF MSによるペルメチル化糖鎖の解析

  1. ペルメチル化Asn-グリカンを10 μLの50%メタノール/水(v/v)に溶解します。
  2. 溶解した Asn-グリカン 1 μL を 2,5-ジヒドロキシ安息香酸溶液 2 μL (50% アセトニトリル/水 (v/v)) に 10 mg/mL を混合します。
  3. 混合サンプル1 μLを384ウェルMALDIプレートに加え、サンプルが完全に乾燥するまで待ちます。
  4. プレートをパルス窒素レーザー(337 nm)を搭載したMALDI-TOF質量分析計に挿入します。加速電圧を正のモードで20kVに設定します。
  5. レーザー出力を任意のスケール6,000に設定し、 m/z 1,000から5,000までの正反射モードでデータを取得します。

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結果

プロナーゼE消化と過メチル化の組み合わせに基づく方法を、C. jejuni 11168Hの全タンパク質抽出物からのN-グリカン分析に適用しました。典型的な消化では、酵素と糖タンパク質の比率は1:100から1:20の間で設定されていました。ここでは、プロナーゼEとタンパク質の比率を2:1〜3:1に増加させ、より長い消化を使用して、37°Cで48時間インキュ...

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ディスカッション

このユニバーサルグライコミクス戦略の実施のために、プロトコルには2つの重要なステップがあります。最初の重要なステップは、排気ガスの消化を完了することです。この方法は、Pronase E消化の完了に強く依存します。そのため、消化時間を長くし、酵素とタンパク質の比率を高くすることが不可欠です。通常、Pronase /タンパク質には2:1〜3:1の比率を使用し、イ?...

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開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

著者は、Kenneth Chan、David J. McNally、Harald Nothaft、Christine M. Szymanski、Jean-Robert Brisson、およびEleonora Altmanの支援と有益な議論に感謝します。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB),Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)149357
2-PropanolFisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)AA22906K7
4000 Q-TrapAB Sciex (Concord, Canada)Mass spectrometer
4800 MALDI-TOF/TOFApplied Biosystems (Foster City, CA)Mass spectrometer
acetonitrile (ACN)Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)A996-4
Brain Heart Infusion (BHI) brothSigma-Aldrich (St. Louis, MO)5121
C18 Sep-Pak cartridgesWaters (Milford, MA).WAT036945
chloroformSigma-Aldrich (St. Louis, MO)CX1054
DifcoFisher Science (Ottawa, Ontario,Canada)DF0037-17-8Fisher Science
dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)276855
Eppendorf tubeDiamed (Missisauga, Ontario,Canada)SPE155-N
glacial acetic acidSigma-Aldrich (St. Louis, MO)A6283
methanolFisher Scientific, Ottawa, Ontario,Canada)A544-4
methyl iodideSigma-Aldrich (St. Louis, MO)289566
PGC cartridgeThermo Scientific(Waltham,MA)60106-303Porous graphitic carbon
Pronase ESigma-Aldrich (St. Louis, MO)7433-2
Protein Assay KitBio-rad (Mississauga, Ontario, Canada)5000001
Refrigerated vacuum concentratorThermo Scientific(Waltham,MA)SRF110P2-230
sodium hydroxideSigma-Aldrich (St. Louis, MO)367176
Sonicator Ultrasonic ProcessorMandel Scientific (Guelph, Ontario,Canada)XL 2020
Trifluoacetic acid (TFA)Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)A11650
Tris-HClSigma-Aldrich (St. Louis, MO)T3253

参考文献

  1. Dwek, R. A. Glycobiology: more functions for oligosaccharides. Science. 269 (5228), 1234-1235 (1995).
  2. Scheiffele, P., Peränen, J., Simons, K. N-glycans as apical sorting signals in epithelial cells. Nature. 378 (6552), 96-98 (1995).
  3. Hofmann, J., Hahm, H. S., Seeberger, P. H., Pagel, K. Identification of carbohydrate anomers using ion mobility-mass spectrometry. Nature. 526 (7572), 241-244 (2015).
  4. Kowarik, M., et al. N-linked glycosylation of folded proteins by the bacterial oligosaccharyltransferase. Science. 314 (5802), 1148-1150 (2006).
  5. Young, N., et al. Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoproteins in the Gram-negative bacterium, Campylobacter jejuni. Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42530-42539 (2002).
  6. Wacker, M., et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science. 298 (5599), 1790-1793 (2002).
  7. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  8. Linton, D., et al. Functional analysis of the Campylobacter jejuni N-linked protein glycosylation pathway. Molecular Microbiology. 55 (6), 1695-1703 (2005).
  9. Nwosu, C. C., et al. Simultaneous and Extensive Site-specific N- and O-Glycosylation Analysis in Protein Mixtures. Analytical Chemistry. 85, 956-963 (2013).
  10. Liu, X., et al. Mass spectrometry-based glycomics strategy for exploring N-linked glycosylation in eukaryotes and bacteria. Analytical Chemistry. 78 (17), 6081-6087 (2006).
  11. Nothaft, H., Liu, X., McNally, D. J., Li, J., Szymanski, C. M. Study of free oligosaccharides derived from the bacterial N-glycosylation pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 15019-15024 (2009).
  12. Macdonald, S. E., et al. Draft genome sequence of Campylobacter jejuni 11168H. Genome Announcements. 5 (5), e01556(2017).
  13. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  14. Liu, X., Chan, K., Chu, I. K., Li, J. Microwave-assisted nonspecific proteolytic digestion and controlled methylation for glycomics applications. Carbohydrate Research. 343 (17), 2870-2877 (2008).
  15. Liu, X., et al. 34;One-pot" methylation in glycomics application: Esterification of sialic acids and permanent charge construction. Analytical Chemistry. 79 (10), 3894-3900 (2007).

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