Estratégia glicômica baseada em proteólise inespecífica para glicoproteínas bacterianas

Resumo

Este estudo apresenta um método para análise glicômica de glicoproteínas por uma combinação de digestão de pronase E, permetilação e análise por espectrometria de massa. Este método é capaz de analisar todos os tipos de glicanos ligados a N, incluindo N-glicanos bacterianos.

Resumo

A glicosilação de proteínas é uma das modificações pós-traducionais mais comuns e complexas. Muitas técnicas têm sido desenvolvidas para caracterizar os papéis específicos dos glicanos, a relação entre suas estruturas e seu impacto nas funções das proteínas. Um método comum para análise de glicanos é empregar clivagem de exoglicosidase para liberar glicanos ligados a N de glicoproteínas ou glicopeptídeos usando peptídeo-N-glicosidase F (PNGase F). No entanto, as ligações glicano-proteína nas bactérias são diferentes e não há enzima disponível para liberar glicanos das glicoproteínas bacterianas. Além disso, glicanos livres também foram descritos em células de mamíferos, bactérias, leveduras, plantas e peixes. Neste artigo, apresentamos um método que pode caracterizar o sistema de glicosilação ligado a N em Campylobacter jejuni , detectando glicanos livres e ligados à asparagina (Asn) que não estão ligados às suas proteínas-alvo. Neste método, as proteínas totais de C. jejuni foram digeridas pelo Pronase E com uma maior proporção enzima/proteína (2:1−3:1) e um tempo de incubação mais longo (48−72 h). Os Asn-glicanos e glicanos livres resultantes foram então purificados usando cartuchos de carbono grafítico poroso, permetilados e analisados por espectrometria de massa.

Introdução

A N-glicosilação da proteína é uma das modificações pós-traducionais mais comuns e complexas em eucariotos¹. Os N-glicanos desempenham um papel essencial no dobramento de proteínas e também têm impacto na classificação de proteínas no tráfego biossintético². A espectrometria de massas tem sido amplamente utilizada na análise de glicanos liberados pela clivagem da exoglicosidase (glicômica). Os peptídeos desglicosilados restantes (glicoproteômica) têm sido comumente usados para identificar as sequências de peptídeos glicosilados em eucariotos³. A identificação de glicanos ligados a N em Campylobacter jejuni sugeriu que a N-glicosilação não se restringe a eucariotos 4,5,6,7,8. No entanto, para as bactérias, faltam exoglicosidases ou endoglicosidases eficazes para liberar oligossacarídeos para análise de glicanos.

Uma abordagem alternativa foi desenvolvida para caracterizar sítios de glicosilação e estruturas de glicanos em glicoproteínas, que se baseia no uso de proteólise inespecífica para digerir a estrutura da maioria dos peptídeos e gerar pseudo-oligossacarídeos que contêm apenas alguns aminoácidos. Várias enzimas não específicas têm sido usadas para gerar pseudo-oligossacarídeos e verificou-se que o Pronase E ofereceu a digestão mais eficiente e reprodutível⁹. Desenvolvemos uma estratégia glicômica baseada no Pronase E para analisar N-glicanos de C. jejuni ^10,11. Os pseudo-oligossacarídeos foram analisados diretamente por espectrometria de massas por eletroforese capilar (CE-MS) e/ou por espectrometria de massas por tempo de voo de ionização/dessorção a laser assistida por matriz (MALDI-TOF MS) após permetilação.

Aqui, um método universal é descrito para análise glicômica que usa digestão e permetilação inespecíficas da Pronase E para estudar a glicosilação do patógeno da mucosa C. jejuni. Este método é capaz de caracterizar glicanos ligados a N expressos por sistemas eucarióticos e bacterianos e também é útil na identificação de novos intermediários nas vias de glicosilação ligadas a N.

Protocolo

1. Cultivo de C. jejuni 11168H e extração de proteínas totais

NOTA: C. jejuni 11168H é um derivado clonal hipermóvel do NCTC 11168¹².

1. Inicie a cultura celular reidratando o pellet celular (aproximadamente 0,15 g, NCTC) com aproximadamente 5 mL de meio de cultura Mueller-Hinton. Use várias gotas do tubo de caldo primário para inocular uma placa de ágar Mueller-Hinton. Incubar a 37 °C durante 18 h sob uma atmosfera microaerofílica, ou seja, 5% de O₂, 10% de CO₂ e 85% de N₂.
2. Colha gramados bacterianos com 1 mL de caldo Brain Heart Infusion (BHI). Diluir a colheita para atingir aproximadamente 1 x 10⁵ ufc/mL com caldo BHI. Cultivar células durante 18 h com agitação (100 rpm) numa atmosfera microaerofílica a 37 °C.
3. Resfrie as células colocando as placas no gelo por 10 min e colha as células por centrifugação (4.500 x g a 4 ° C). Descarte o sobrenadante e lave as células 2x em 3 L de Tris-HCl 0,1 M gelado (pH 7,8).
4. Ressuspenda as células (10, 8-10,¹¹ células de C. jejuni) em 8 mL de Tris-HCl 0,1 M gelado (pH 7,8) e lise por sonicação (Tabela de Materiais). Execute a sonicação da seguinte forma: pulso de 4 s, 1 s desligado, 1 min de cada vez e três vezes no total. 
5. Centrifugar a 9.500 x g durante 45 min a 4 °C e transferir o sobrenadante para outro tubo. Dialisar proteínas no sobrenadante 2x contra 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5) a 4 ° C por 3 h.
6. Determine as concentrações de proteínas com um ensaio proteico¹³ disponível comercialmente (deve estar em uma faixa de 4 a 6 μg/μL).
7. Dissolva 1 mg de proteínas em 1 mL de tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 7,5) e adicione 2,5 mg de Pronase E à solução. Incubar a 37 °C durante 48 h, seguido de ferver a solução a 100 °C durante 5 min para desativar a enzima.
8. Conservar a solução de digestão de proteínas a -80 °C para utilização posterior.

2. Purificação usando carbono grafítico poroso (PGC)

1. Ative os cartuchos de PGC (100 mg, 5 mL) adicionando 1 mL de acetonitrila a 80% (v / v) (ACN) contendo 0,1% de ácido trifluoacético (TFA) e repita 2x.
2. Lave o cartucho PGC com 1 mL de água 3x.
3. Carregue a digestão do Pronase E a partir de 1 mg de proteína no PGC (o volume depende da concentração de proteína).
4. Lave o cartucho 3x com 1 mL de água de cada vez para remover os sais.
5. Eluir Asn-glicanos com 1 mL de ACN a 25% em TFA a 0,1%, seguido por 1 mL de ACN a 50% em TFA a 0,1%.
6. Agrupe ambas as frações e seque as amostras com o concentrador de vácuo refrigerado (Tabela de Materiais) para processamento posterior.
   NOTA: Use solventes de grau MS para purificação de Asn-glicano.

3. Permetilação de Asn-glicanos

1. Solubilize Asn-glicanos secos com 100 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) em um tubo de 1,5 mL.
2. Prepare a pasta DMSO-NaOH misturando dois pellets de NaOH com 2 mL de DMSO. Adicione 200 μL de pasta DMSO-NaOH e 100 μL de iodeto de metila à amostra.
3. Tampe bem o tubo e mexa a 3.000 rpm por 10 min em temperatura ambiente com um misturador de vórtice.
4. Resfrie a permetilação adicionando 1 mL de água.
5. Adicione 1 mL de clorofórmio e vórtice por 1 min para extrair Asn-glicanos permetilados.
6. Centrifugue a 9.000 x g por 3 min. Remover o sobrenadante e manter a fase inferior do clorofórmio com Asn-glicanos permetilados.
7. Lave a camada orgânica adicionando 1 mL de água com vórtice por 1 min. Centrifugue a 9.000 x g por 3 min e remova o sobrenadante. Repita 2x.
8. Colocar a fase orgânica numa hotte e deixar secar com uma corrente de azoto à temperatura ambiente.
9. Armazenar Asn-glicanos permetilados a -80 °C para análise por espectrometria de massa.

4. Espectrometria de Massa por Ionização por Eletrospray (ESI-MS) e análise ESI-MS/MS

1. Dissolva os asn-glicanos permetilados em 20 μL de 2-propanol a 50% em água (v/v).
2. Realize a análise CE-ESI-MS usando um capilar de sílica fundida nua de 90 cm com um fluxo de bainha de 50% de 2-propanol em água a 1 μL / min.
   NOTA: CE-MS é um sistema que combina eletroforese capilar (CE) e espectrometria de massa. CE separa íons com base em sua mobilidade iônica. Neste protocolo, o sistema CE é empregado para introduzir o volume minuto de amostras e realizar a dessalinização on-line.
3. Defina o volume ESItage em 5 kV no modo positivo.
4. Carregue amostras de Asn-glicano permetilado a 500 mbar por 0,2 min, correspondendo a aproximadamente 100 nL.
5. Adquira dados de MS usando um espectrômetro de massa (Tabela de Materiais) usando os seguintes parâmetros de aquisição.
   1. Para MS completo, defina o tempo de permanência em 2.0 ms por passo de 0.1 m/z unidade. Nos experimentos MS² e MS³ com varredura de íons de produto aprimorada (EPI), defina a velocidade de varredura para 4.000 Da/s, com captura Q0. Defina o tempo de preenchimento do trapping como Dinâmico e a resolução de Q1 como Unidade. Para experimentos MS³ , defina o coeficiente de excitação para garantir que apenas o pico monoisotópico para um único precursor carregado seja selecionado. Defina os tempos de excitação em 100 ms.

5. Análise de glicanos permetilados por MALDI-TOF MS

1. Dissolver os asn-glicanos permetilados em 10 μL de metanol/água a 50% (v/v).
2. Misture 1 μL de Asn-glicanos dissolvidos com 2 μL de solução de ácido 2,5-di-hidroxibenzóico (10 mg / mL em acetonitrila / água a 50% (v / v)).
3. Adicione 1 μL de amostra mista a uma placa MALDI de 384 poços e espere até que a amostra esteja completamente seca.
4. Inserir a placa no espectrómetro de massas MALDI-TOF equipado com um laser de azoto pulsado (337 nm). Defina a tensão de aceleração em 20 kV no modo positivo.
5. Defina a potência do laser para uma escala arbitrária de 6.000 e adquira dados no modo refletron positivo de m/z 1.000 a 5.000.

Resultados

O método baseado na combinação de digestão e permetilação da pronase E foi aplicado à análise de N-glicanos a partir de extratos proteicos totais de C. jejuni 11168H. A Figura 1 mostra um fluxograma do procedimento experimental. Na digestão típica, a proporção de enzima para glicoproteína foi definida entre 1:100 e 1:20. Aqui, a proporção de Pronase E para proteína foi aumentada para 2: 1-3: 1 e uma digestão mais longa foi empregada...

Discussão

Existem duas etapas críticas no protocolo para a implementação dessa estratégia glicomômica universal. O primeiro passo crítico é a conclusão da digestão do escapamento. Este método depende fortemente da conclusão da digestão do Pronase E. Portanto, é essencial usar um longo tempo de digestão e uma alta relação enzima-proteína. Normalmente, sugere-se o uso de uma proporção de 2:1-3:1 para Pronase E/proteína e um tempo de incubação de 48 h. Foi demonstrado que essa d...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB),	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	149357
2-Propanol	Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)	AA22906K7
4000 Q-Trap	AB Sciex (Concord, Canada)		Mass spectrometer
4800 MALDI-TOF/TOF	Applied Biosystems (Foster City, CA)		Mass spectrometer
acetonitrile (ACN)	Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)	A996-4
Brain Heart Infusion (BHI) broth	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	5121
C18 Sep-Pak cartridges	Waters (Milford, MA).	WAT036945
chloroform	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	CX1054
Difco	Fisher Science (Ottawa, Ontario,Canada)	DF0037-17-8	Fisher Science
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	276855
Eppendorf tube	Diamed (Missisauga, Ontario,Canada)	SPE155-N
glacial acetic acid	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	A6283
methanol	Fisher Scientific, Ottawa, Ontario,Canada)	A544-4
methyl iodide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	289566
PGC cartridge	Thermo Scientific(Waltham,MA)	60106-303	Porous graphitic carbon
Pronase E	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	7433-2
Protein Assay Kit	Bio-rad (Mississauga, Ontario, Canada)	5000001
Refrigerated vacuum concentrator	Thermo Scientific(Waltham,MA)	SRF110P2-230
sodium hydroxide	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	367176
Sonicator Ultrasonic Processor	Mandel Scientific (Guelph, Ontario,Canada)	XL 2020
Trifluoacetic acid (TFA)	Fisher Scientific( Ottawa, Ontario,Canada)	A11650
Tris-HCl	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)	T3253