ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における微小電極アレイおよびパッチクランプ記録の技術的応用

要約

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、薬物誘発性心毒性スクリーニングおよび疾患モデリングのための有望な in vitro モデルとして浮上しています。ここでは、hiPSC-CMの収縮性と電気生理機能を測定するためのプロトコルについて詳しく説明します。

要約

薬物誘発性心毒性は、薬物の減少と市場からの撤退の主な原因です。したがって、適切な前臨床心臓安全性評価モデルを使用することは、医薬品開発中の重要なステップです。現在、心臓の安全性評価は依然として動物実験に大きく依存しています。しかし、動物モデルは、特に心臓の電気生理学的特性の点で、種固有の違いのために、ヒトに対する翻訳特異性が低いことに悩まされています。したがって、前臨床心臓安全性評価のための信頼性が高く、効率的で、人間ベースのモデルを開発することが急務です。ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)は、薬物誘発性心毒性スクリーニングおよび疾患モデリングのための貴重な in vitro モデルとして浮上しています。hiPSC-CMは、多様な遺伝的背景やさまざまな病状を持つ個人から取得できるため、薬物誘発性心毒性を個別に評価するための理想的な代理となります。そのため、hiPSC-CMの機能特性を網羅的に調べるための方法論を確立する必要があります。このプロトコルでは、収縮性、電界電位、活動電位、カルシウム処理の測定など、hiPSC-CMで評価できるさまざまな機能アッセイについて詳しく説明します。全体として、前臨床心臓安全性評価にhiPSC-CMを組み込むことは、医薬品開発に革命をもたらす可能性を秘めています。

概要

医薬品開発は長くて費用のかかるプロセスです。2009年から2018年の間に米国食品医薬品局(FDA)によって承認された新しい治療薬の研究では、資本化された研究および臨床試験の推定中央値は製品あたり9億8500万ドルであると報告^{されています1}。薬物誘発性心毒性は、薬物の減少と市場からの撤退の主な原因です²。特に、心毒性は治療薬の複数のクラスの間で報告されています³。したがって、心臓の安全性評価は、医薬品開発プロセスにおける重要な要素です。心臓の安全性評価の現在のパラダイムは、依然として動物モデルに大きく依存しています。しかし、動物モデルの使用との種の違いは、ヒト患者における薬物誘発性心毒性の不正確な予測の主な原因としてますます認識されています⁴。例えば、心臓活動電位の形態は、異なる再分極電流からの寄与のために、ヒトとマウスの間で実質的に異なる⁵。さらに、心臓生理学に影響を与える可能性のある心筋ミオシンおよび環状RNAの差次的アイソフォームは、種の間で十分に文書化されています^6,7。これらのギャップを埋めるには、前臨床心臓の安全性評価のための信頼性が高く、効率的な、人間ベースのモデルを確立することが不可欠です。

人工多能性幹細胞(iPSC)技術の画期的な発明は、前例のない薬物スクリーニングおよび疾患モデリングプラットフォームを生み出しました。過去10年間で、ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞(hiPSC-CM)を作製する方法は十分に確立されている^8,9。hiPSC-CMは、疾患モデリング、薬物誘発性心毒性スクリーニング、および精密医療における潜在的な用途に大きな関心を集めています。例えば、hiPSC-CMは、QT延長症候群¹⁰、肥大型心筋症11,12、拡張型心筋症^13,14,15などの遺伝的遺伝によって引き起こされる心疾患の病理学的表現型をモデル化するために利用されてきた。その結果、心疾患の病因に関与する重要なシグナル伝達経路が特定され、効果的な治療のための潜在的な治療戦略に光を当てることができます。さらに、hiPSC-CMは、ドキソルビシン、トラスツズマブ、およびチロシンキナーゼ阻害剤を含む抗癌剤に関連する薬物誘発性心毒性をスクリーニングするために使用されています^16,17,18;結果として生じる心毒性を軽減するための戦略は調査中です。.最後に、hiPSC-CMに保持される遺伝情報は、個人レベルと集団レベルの両方で薬物誘発性心毒性のスクリーニングと予測を可能にします^19,20。まとめると、hiPSC-CMは、パーソナライズされた心臓の安全性予測のための非常に貴重なツールであることが証明されています。

このプロトコルの全体的な目標は、hiPSC-CMを疾患モデリング、薬物誘発性心毒性スクリーニング、および精密医療に適用する上で非常に重要なhiPSC-CMの機能特性を包括的かつ効率的に調査するための方法論を確立することです。ここでは、収縮性、電界電位、活動電位、カルシウム(^Ca2+)ハンドリングの測定など、hiPSC-CMの機能特性を評価するための一連の機能アッセイについて詳しく説明します(図1)。

プロトコル

1.培地と溶液の準備

1. 50x B27サプリメントの10 mLボトルと500 mLのRPMI 1640培地を混合して、hiPSC-CM維持培地を調製します。培地を4°Cで保存し、1ヶ月以内に使用してください。使用前に培地を室温(RT)に平衡化してください。
2. 20 mLの血清置換培地と180 mLのhiPSC-CM維持培地(10%希釈、v/v)を混合して、hiPSC-CMシーディング培地を調製します。新たに調製した播種培地が好ましいが、4°Cで2週間以内保存することができる。使用前に培地をRTに平衡化してください。
3. 基底膜マトリックス1本(10 mL)を4°Cで一晩解凍し、500 μLの基底膜マトリックスを滅菌1.5 mLチューブに分注して、細胞外マトリックスコーティング溶液を調製します。さらに使用するには、-20°Cで保存してください。500 μLの基底膜マトリックスと100 mLの氷冷DMEM/F12培地(1:200希釈、v/v)を混合して、基底膜マトリックスコーティング溶液を作ります。
4. 135 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl 2、1.8 mM CaCl₂、5 mM グルコース、および10 mM HEPESを含むタイロード溶液50 mLを調製します。NaOHでpHを7.4に調整します。実験当日に新鮮なTyrodeの溶液を準備します。
5. 120 mM KCl、1 mM MgCl₂、10 mM EGTA、および10 mM HEPESを含む50 mLの細胞内ピペット溶液を調製します。KOHでpHを7.2に調整します。細胞内ピペット溶液を滅菌5 mLチューブに分注し、-20°Cで保存します。 実験当日、溶液にMgATPを新たに添加して、最終濃度3mMを達成します。
6. 2 μMのフラ-2 AMと0.1%プルロニックF-127を含む1 mLのフラ-2 AMローディング溶液を調製します。実験当日に新鮮なローディング溶液を準備し、光から保護します。

2. hiPSC-CM収縮運動の測定

1. 96ウェルプレートの各ウェルに100 μLの細胞外マトリックスコーティング溶液を添加して、基底膜マトリックスコーティングプレートを調製します。加湿した細胞培養インキュベーター内で96ウェルプレートを37°C、5%_CO2 で一晩インキュベートする。
2. hiPSC-CMの酵素的解離
   1. スタンフォード心臓血管研究所iPS細胞バイオバンク(http://med.stanford.edu/scvibiobank.html)にhiPS細胞を請求してください。先行文献^8,9に従ってhiPSC-CMを生成する。6ウェルプレートで培養したhiPSC-CMを顕微鏡下で10倍の倍率で観察します。
      注:細胞がまだ増殖しているときは、細胞を解離しないでください。さもなければ、細胞は再メッキ後にウェル上で増殖し、機能アッセイの不正確な結果をもたらすであろう。通常、hiPSC-CMは18〜23日目に増殖を停止します。
   2. hiPSC-CMが強く鼓動し、純度が95%を超えていることを確認してください。心筋細胞の特異的マーカーである心筋トロポニンTに対する免疫染色により純度を評価する^8、9。
   3. 維持培地を吸引し、1x DPBSで細胞を2回洗浄します。6ウェルプレートの各ウェルに1 mLの細胞剥離溶液を加え、37°Cで10分間インキュベートします。
      注:潜伏期間は定期的に監視する必要があります。細胞の生存率を低下させるため、細胞を過剰消化しないように注意してください。
   4. 5 mLピペットを使用してhiPSC-CMを数回穏やかにピペットで上下させ、シングルセル懸濁液を生成します。等量のhiPSC-CMs播種培地を添加し、細胞剥離液を中和します。
   5. hiPSC-CMを300 x g でRTで3分間遠心分離し、上清を吸引し、細胞ペレットを1〜2 mLのhiPSC-CM播種培地に再懸濁します。
   6. 細胞密度と生存率をトリパンブルー排除法を用いて定量化します。簡単に説明すると、10μLの細胞懸濁液を等量のトリパンブルーと混合し、細胞計数スライドに移し、次いで細胞カウンターを用いて計数する^{(前述のように21})。
3. ハイPSC-CMのシーディング
   1. 細胞外マトリックスコーティング溶液を96ウェルプレートから除去します。
   2. 1ウェルあたり50,000個の細胞を100 μLのhiPSC-CM播種培地に播種し、96ウェルプレートを加湿細胞培養インキュベーターに入れ、37°C、5%_CO2 で一晩過ごします。
   3. プレーティングの1日後に、hiPSC-CMシード培地を100 μLのhiPSC-CM維持培地と交換します。記録するまで2日ごとにhiPSC-CMメンテナンス培地を交換してください。
4. データ・アクイジション
   1. メッキ後少なくとも10日でhiPSC-CMの収縮運動を測定します(推奨)。
   2. 温度コントローラーの電源を入れ、37°Cを推奨温度として設定します。顕微鏡、カメラ、および_CO2 電源の電源を入れます。
   3. プレートホルダーのウォータージャケットに適量の滅菌脱イオン水を入れます(図2A)。96ウェルプレートをプレートホルダーに置き、細胞を少なくとも5分間順応させます。
   4. 表示ソフトウェアを開き、カメラのフレームレートを75フレーム/秒(fps)に設定し、ビデオ/画像の解像度を1024×1024ピクセルに設定します。オートフォーカスとオートブライトネス機能を適用します。ハイPSC-CMの動画や画像を録画します。
      注意: 記録中は顕微鏡テーブルの振動を避けてください。
   5. 自動分析のためにアナライザーソフトウェアを開きます。

3. ヒPSC-CM電界電位の測定

1. 基底膜マトリックスコーティングプレートの作製
   1. 8 μLの細胞外マトリックスコーティング液滴を、48ウェル微小電極アレイ(MEA)プレートの各ウェルの記録電極領域に注意深く置きます。液滴配置に適した電極領域については 、図3A を参照してください。このステップは、hiPSC-CM単分子膜を電極に集中させるために重要です。いかなる状況でも電極に触れないでください。
   2. コーティング溶液の蒸発を防ぐために、3ウェルMEAプレートのウェル(図3A)の周囲に48 mLの滅菌脱イオン水を追加します。加湿した細胞培養インキュベーター内で48ウェルMEAプレートを37°C、5%_CO2 で45〜60分間インキュベートします。
      注意: 基底膜マトリックスの乾燥を防ぐために、長時間インキュベートしないでください。
2. ステップ2.2に記載のようにhiPSC-CMの酵素解離を実行します。
3. ハイPSC-CMのシーディング
   1. 同じ単一列または列内の200 μLピペットチップを使用して、電極に触れることなく、ウェル表面からほとんどの細胞外マトリックス培地を除去します。
   2. 1ウェルあたり50,000個の細胞を、8 μLのhiPSC-CMシーディング培地に、同じ行または列の各ウェルの記録電極領域に播種します。
   3. すべてのウェルに細胞が播種されるまで、最後の2つのステップを繰り返します。すべてのウェルにhiPSC-CM懸濁液が含まれていることを顕微鏡で確認します。必要な密度については、 図3Bを参照してください。
      注:基底膜マトリックスが完全に乾燥すると、hiPSC-CMの付着が損なわれ、細胞の付着が最適ではなくなります。
   4. 加湿細胞培養インキュベーター内で48ウェルMEAプレートを37°C、5%_CO2 で60分間インキュベートします。
   5. 150 μLのhiPSC-CMシーディング培地を48ウェルMEAプレートの各ウェルにゆっくりと穏やかに加えます。事前に播種したhiPSC-CMを分散せずに培地を添加するには、プレートを45°の角度で保持し、ピペットチップを各ウェルの壁に立てかけ、培地をゆっくりと放出します。
      注意: 培地の追加が速すぎたり、高圧で行ったりすると、付着した心筋細胞が剥がれます。hiPSC-CMドロップサスペンションとの直接接触を避けてください。
   6. 加湿細胞培養インキュベーター内で48ウェルMEAプレートを37°C、5%_CO2 で一晩インキュベートする。
   7. めっきの1日後に、hiPSC-CM播種培地を300 μLのhiPSC-CM維持培地でリフレッシュします。hiPSC-CMメンテナンス培地は、記録前に2日ごとに交換してください。
4. データ・アクイジション
   1. めっき後少なくとも10日でMEA測定を実行してください(推奨)。めっき後10日目に、 図3Cに示すように、10倍の倍率で顕微鏡下で自発拍解hiPSC-CM単分子膜の密度を確認します。
   2. 48ウェルMEAプレートを記録装置に入れます。タッチスクリーンは、温度(37°C)とCO₂ (5%)の状態を観察することができます。
   3. ナビゲーターソフトウェアを開きます。実験セットアップウィンドウで、 心臓リアルタイム構成とフィールド電位記録を選択します。自発的またはペースのあるビート構成を適用します。
   4. 拍動検出パラメータでは、検出スレッショルドを300μV、最小鼓動時間を250ms、最大鼓動周期を5秒に設定します。フィールドポテンシャル期間(FPD)計算の 多項式回帰 を選択します。
   5. ベースラインの電気的活動信号が成熟していて安定しているかどうかを確認します。
      注:マルチウェルMEAプレートから各電極によって記録された成熟波形は、図3D-Fに示すように、心臓の脱分極スパイクと再分極位相と一致する簡単に識別できる特性を備えた心電界電位を反映している必要があります。
   6. ベースラインの心臓活動を1〜3分間取得します。薬物治療が必要な場合は、ベースライン記録後に化合物をウェルに追加します。次の記録の前に、プレートをインキュベーターに少なくとも30分間置きます。

4. hiPSC-CM活動電位の測定

1. 35 mmディッシュのガラス底部に500 μLの細胞外マトリックスコーティング溶液を入れて、基底膜マトリックスコーティングディッシュを準備します(図4A)。加湿した細胞培養インキュベーター内で35 mmディッシュを37°C、5%_CO2 で一晩インキュベートします。
2. ステップ2.2に記載のようにhiPSC-CMの酵素解離を実行します。
3. ハイPSC-CMのシーディング
   1. 細胞外マトリックスコーティング溶液を35 mmディッシュから除去します。ウェルあたり50,000細胞を500 μLのhiPSC-CMシーディング培地に35 mmディッシュのガラス底部に播種します。
   2. 加湿した細胞培養インキュベーター内で35 mmディッシュを37°C、5%_CO2 で一晩インキュベートします。hiPSC-CMシーディング培地を取り出し、2 mLのhiPSC-CM維持培地を35 mmディッシュに加えます。
      注:細胞に触れないように、200 μLのろ過されていないチップを2 mL吸引ピペットの上に置いて使用済み培地を除去することをお勧めします。
   3. 記録前に2日ごとにhiPSC-CM培地を交換してください。
4. データ・アクイジション
   1. めっき後少なくとも10日で活動電位測定を行ってください(推奨)。ステップ1.4の説明に従って、新しいTyrodeの溶液を調製します。細胞内ピペット溶液1アリコートを解凍し、MgATPを最終濃度3 mMまで新たに添加します。
   2. マイクロピペットプーラーを使用して、ホウケイ酸ガラスキャピラリーからマイクロピペットを引き出します。
      注:マイクロピペットの抵抗は2〜5MΩが好ましいです。
   3. hiPSC-CM維持培地をタイロードの溶液に交換し、細胞をタイロードの溶液に15分間順応させます(図4C)。温度センサーをチャンバーに挿入し、図4Cに示すように35 mmディッシュをチャンバーに入れ、温度を37° Cに調整します(図4D)。
   4. マイクロピペットに細胞内溶液を充填し、パッチクランプアンプヘッドステージに接続されたホルダーに挿入します(図4E)。刺激/取得ソフトウェアを開き、活動電位記録プロトコルをロードして、電圧クランプ構成を選択します。
   5. マイクロピペットを入浴液に挿入し、適切な単一のhiPSC-CMを選択し、マイクロマニピュレーターを使用して選択したセルの横にあるマイクロピペットの位置を調整および下げます。ピペットチップをバス溶液に挿入したら、オシロスコープのモニターで観察できるピペット抵抗を確認します。
   6. ピペットをセルの近くに配置すると、電流パルスがわずかに減少し、シール抵抗の増加を反映します。負圧で穏やかな吸引を適用して抵抗を増やし、ギガシールを形成します。 シール 機能を適用します。
   7. 追加の吸引を適用してメンブレンを破壊し、セル全体の記録構成を取得します。ピペット領域内の膜部分が吸引によって破裂すると、内部溶液は細胞質と平衡状態になります。この時点で、アンプダイアログを使用して、電圧クランプモード(Vクランプ)から電流クランプモードまたは電流注入なし(Cクランプ)に切り替えます。[記録]ボタンを押して、アクションポテンシャル 記録 ファイルを生成して保存します。
      注:モード変更により、トリガーや刺激記録プロトコル なしで hiPSC-CMの自発的な活動電位を連続的に記録でき、パッチクランプアンプのV-mon出力で監視できます。

5. ヒPSC-CM^Ca2+ トランジェントの測定

1. ^Ca2+イメージング²¹用にカスタマイズされた細胞チャンバーを調製するための前のプロトコルを参照してください。基底膜マトリックスコーティング細胞室の調製には、細胞室に200 μLの細胞外マトリックスコーティング溶液を入れます。加湿した細胞培養インキュベーター内で細胞チャンバーを37°C、5%_CO2で一晩インキュベートする。
2. ステップ2.2に記載のようにhiPSC-CMの酵素解離を実行します。
3. ハイPSC-CMのシーディング
   1. 細胞外マトリックスコーティング溶液を細胞室から除去する。ウェルあたり20,000個の細胞を200 μLのhiPSC-CM播種培地に播種します。
   2. 播種後1日目にhiPSC-CM播種培地を200 μLのhiPSC-CM維持培地に交換します。hiPSC-CMメンテナンス培地は、記録前に2日ごとに交換してください。
4. データ・アクイジション
   1. めっき後少なくとも10日で^Ca2+ 過渡測定を実行します(推奨)。ステップ1.4の説明に従って、新しいTyrodeの溶液を調製します。ステップ1.6の説明に従って、新しいFura-2 AMローディング溶液を調製します。
   2. hiPSC-CM維持培地を吸引し、タイロード溶液で2回洗浄します。100 μLのFura-2 AMローディング溶液を塗布し、RTで10分間インキュベートします。
   3. Fura-2 AMローディング溶液をTyrodeの溶液に置き換え、Fura-2 AMの完全な脱エステル化のために少なくとも5分間待ちます。
   4. 40倍の油浸対物レンズ(0.95 NA)を備えた倒立落射蛍光顕微鏡の40倍の対物レンズに液浸油を一滴加えます。セルチャンバーを顕微鏡のステージアダプターに配置します(図5A)。
   5. 温度調節器ワイヤーを槽に取り付け、37°Cに設定します。 電界刺激電極を取り付け、パルスを0.5 Hzに設定し、持続時間20ミリ秒にします。
   6. 超高速波長スイッチング光源をオンにし、機器の指示に従って340nmおよび380nmの高速スイッチングモードに設定します。
   7. 両方の波長に20ミリ秒の露光時間を適用し、ソフトウェアで20秒の記録時間を適用します。hiPSC-CMにおける^Ca2+ トランジェントのリアルタイム変化を反映した動画を撮影します。データをスプレッドシートにエクスポートし、前述のようにデータを分析します²³。

結果

このプロトコルでは、hiPSC-CMの収縮運動、電界電位、活動電位、および^Ca2+ 過渡現象の測定方法について説明します。酵素消化、細胞播種、維持、および機能アッセイ伝導を含む概略図を 図1に示します。収縮運動測定にはhiPSC-CM単分子膜の形成が必要です(図2B)。hiPSC-CMの収縮-緩和運動の代表的な痕跡を 図2Cに示しま?...

ディスカッション

ヒトiPS細胞技術は、疾患モデリングと薬物スクリーニングのための強力なプラットフォームとして登場しました。ここでは、hiPSC-CMの収縮性、電界電位、活動電位、および^Ca2+過渡現象を測定するための詳細なプロトコルについて説明します。このプロトコルは、hiPSC-CMの収縮性と電気生理学の包括的な特性評価を提供します。これらの機能アッセイは、我々のグループ12、

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	D35-20-1.5-N	Patch clamp
50x B27 supplements	Life Technologies	17504-044	hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate	E & K Scientific	EK-27160	hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates	Corning	3603	Contraction motion measurement
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964	Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS)	Axion Biosystems		navigator software
Borosilicate glass capillaries	Harvard Apparatus	BF 100-50-10,	Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115	Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10228	Cell counting
CytoView 48-well MEA plates	Axion Biosystems	M768-tMEA-48B	MEA
DMEM/F12	Gibco/Life Technologies	12634028	Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	14-190-250
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier	Warner Instruments	89-5000	Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant	ThermoFisher Scientific	F1221	Ca2+ transient measurement
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Tyrode’s solution
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode’s solution
hiPSCs	Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl	Sigma-Aldrich	529552	Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement	ThermoFisher Scientific	10828-028	hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M	Sigma-Aldrich	P4494	Intracellular pipette solution
Lambda DG 4	Sutter Instrument Company		Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter	WISBIOMED	LB-L20001	Cell counting
Maestro Pro MEA system	Axion Biosystems		MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231	Extracellular matrix medium
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Intracellular pipette solution
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Tyrode’s solution
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Tyrode’s solution
NaOH 10 M	Sigma-Aldrich	72068	Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)	ThermoFisher Scientific	P3000MP	Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium	Life Technologies	11875-119	hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System	Sony Biotechnology		Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller	Sutter Instruments	P-97	Patch clamp
Trypan blue stain	Life Technologies	T10282	Cell counting