인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에 대한 미세 전극 어레이 및 패치 클램프 기록의 기술적 응용

요약

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 유망한 시험관 내 모델로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM의 수축성과 전기 생리학을 측정하기위한 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

초록

약물 유발 심장 독성은 약물 소모 및 시장 철수의 주요 원인입니다. 따라서 적절한 전임상 심장 안전성 평가 모델을 사용하는 것은 약물 개발 과정에서 중요한 단계입니다. 현재 심장 안전성 평가는 여전히 동물 연구에 크게 의존하고 있습니다. 그러나 동물 모델은 종 특이적 차이, 특히 심장 전기생리학적 특성 측면에서 인간에 대한 열악한 번역 특이성에 시달리고 있습니다. 따라서, 전임상 심장 안전성 평가를 위한 신뢰할 수 있고, 효율적이며, 인간 기반 모델을 개발하는 것이 시급하다. 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포 (hiPSC-CM)는 약물 유도 심장 독성 스크리닝 및 질병 모델링을위한 귀중한 시험 관 내 모델로 부상했습니다. hiPSC-CM은 다양한 유전적 배경과 다양한 질병 상태를 가진 개인으로부터 얻을 수 있으므로 약물 유발 심장 독성을 개별적으로 평가하는 데 이상적인 대용물입니다. 따라서 hiPSC-CM의 기능적 특성을 종합적으로 조사할 수 있는 방법론을 수립할 필요가 있다. 이 프로토콜에서는 수축성, 전계 전위, 활동 전위 및 칼슘 처리 측정을 포함하여 hiPSC-CM에서 평가할 수 있는 다양한 기능 분석에 대해 자세히 설명합니다. 전반적으로 hiPSC-CM을 전임상 심장 안전성 평가에 통합하면 약물 개발에 혁명을 일으킬 잠재력이 있습니다.

서문

약물 개발은 길고 비용이 많이 드는 과정입니다. 2009년과 2018년 사이에 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 신약 치료에 대한 연구에 따르면 자본화된 연구 및 임상 시험의 예상 중간^{비용은 제품당} 9억 8,500만 달러였습니다1. 약물 유발 심장 독성은 약물 소모 및 시장 철수의 주요 원인입니다². 특히, 심장 독성은 여러 종류의 치료 약물³에서 보고됩니다. 따라서 심장 안전성 평가는 약물 개발 과정에서 중요한 구성 요소입니다. 심장 안전성 평가를위한 현재의 패러다임은 여전히 동물 모델에 크게 의존합니다. 그러나, 동물 모델의 사용으로부터의 종 차이는 인간 환자에서 약물 유도 심장 독성에 대한 부정확 한 예측의 주요 원인으로 점점 더 인식되고있다⁴. 예를 들어, 심장 활동 전위의 형태는 상이한 재분극 전류⁵로부터의 기여로 인해 인간과 마우스 사이에 실질적으로 다르다. 또한, 심장 생리학에 영향을 줄 수있는 심장 미오신 및 원형 RNA의 차등 이소 형은 종 ^6,7에서 잘 문서....

프로토콜

1. 매체 및 용액 준비

1. 50x B27 보충제 10mL 병과 RPMI 1640 배지 500mL를 혼합하여 hiPSC-CM 유지 배지를 준비합니다. 배지를 4 ° C에 보관하고 한 달 이내에 사용하십시오. 사용하기 전에 매체를 실온(RT)으로 평형화하십시오.
2. 혈청 대체 배지 20mL와 hiPSC-CM 유지 배지 180mL(10% 희석, v/v)를 혼합하여 hiPSC-CM 파종 배지를 준비합니다. 신선하게 준비된 파종 배지가 선호되지만 4 ° C에서 2 주 이상 보관할 수 없습니다. 사용하기 전에 매체를 RT와 평형화하십시오.
3. 4°C에서 하룻밤 동안 기저막 매트릭스 1병(10mL)을 해동하고 멸균된 1.5mL 튜브에서 기저막 매트릭스 500μL를 분취하여 세포외 매트릭스 코팅 용액을 준비합니다. 추가 사용을 위해 -20 °C에서 보관하십시오. 500μL의 기저막 매트릭스와 100mL의 얼음처럼 차가운 DMEM/F12 배지(1:200 희석, v/v)를 혼합하여 기저막 매트릭스 코팅 용액을 만듭니다.
4. 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM_CaCl2, 5 mM 포도당 및 10 mM 헤페스를 포함하는 50 mL의 티로드 용액....

결과

이 프로토콜은 hiPSC-CM의 수축 운동, 전계자전위, 활동전위 및^{Ca 2+} 과도 상태를 측정하는 방법을 설명합니다. 효소 소화, 세포 파종, 유지 및 기능 분석 전도를 포함하는 개략도가 그림 1에 나와 있습니다. hiPSC-CM 단층의 형성은 수축 운동 측정에 필요합니다(그림 2B). hiPSC-CM의 수축-이완 운동의 대표적인 흔적이 그림 2C에 나?.......

토론

인간 iPSC 기술은 질병 모델링 및 약물 스크리닝을 위한 강력한 플랫폼으로 부상했습니다. 여기에서는 hiPSC-CM 수축성, 전계자전위, 활동전위 및^Ca2+ 과도 상태를 측정하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 hiPSC-CM 수축성 및 전기 생리학의 포괄적인 특성화를 제공합니다. 이러한 기능적 분석은 우리 그룹 12,13,18,24,25,26,27의 여러 간행물에 적용되었습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	D35-20-1.5-N	Patch clamp
50x B27 supplements	Life Technologies	17504-044	hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate	E & K Scientific	EK-27160	hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates	Corning	3603	Contraction motion measurement
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964	Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS)	Axion Biosystems		navigator software
Borosilicate glass capillaries	Harvard Apparatus	BF 100-50-10,	Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115	Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10228	Cell counting
CytoView 48-well MEA plates	Axion Biosystems	M768-tMEA-48B	MEA
DMEM/F12	Gibco/Life Technologies	12634028	Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium	Fisher Scientific	14-190-250
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier	Warner Instruments	89-5000	Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant	ThermoFisher Scientific	F1221	Ca2+ transient measurement
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Tyrode’s solution
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode’s solution
hiPSCs	Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl	Sigma-Aldrich	529552	Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement	ThermoFisher Scientific	10828-028	hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M	Sigma-Aldrich	P4494	Intracellular pipette solution
Lambda DG 4	Sutter Instrument Company		Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter	WISBIOMED	LB-L20001	Cell counting
Maestro Pro MEA system	Axion Biosystems		MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	356231	Extracellular matrix medium
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Intracellular pipette solution
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Tyrode’s solution
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Tyrode’s solution
NaOH 10 M	Sigma-Aldrich	72068	Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)	ThermoFisher Scientific	P3000MP	Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium	Life Technologies	11875-119	hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System	Sony Biotechnology		Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller	Sutter Instruments	P-97	Patch clamp
Trypan blue stain	Life Technologies	T10282	Cell counting