JoVE Logo
著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

体外培養は、生菌の存在を直接検出する方法です。このプロトコルは、ボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラト複合体、再発熱ボレリア種、およびボレリア・ミヤモトイのものを含む、多様なボレリア・スピロヘータの培養方法について説明しています。これらの種は潔癖で成長が遅いですが、培養することができます。

要約

ボレリアは、ライムボレリア症(LB)グループの3つの種グループで構成され、B.ブルグドルフェリセンスラト(s.l.)としても知られ、最近ボレリエラ、再発熱(RF)グループボレリア、およびスピロヘータの3番目の爬虫類関連グループに再分類されました。体液または組織からの病原体の培養が複製病原体を直接検出し、研究のためのソース材料を提供するため、培養ベースの方法は、研究と臨床作業の両方で細菌感染の実験室検出のゴールドスタンダードであり続けています。ボレリアとボレリエラ・スピロヘータは潔癖で成長が遅いため、一般的に臨床目的で培養されていません。 しかし、研究には文化が必要です。このプロトコルは、B. afzelii、B. americana、B. andersonii、B. bavariensis、B. bissettii/bissettiae、B. burgdorferi sensu stricto(s.s)、B. californiensis、B. carolinensis、B. chilensis、B. finlandensis、B. garinii、B. japonica、B. kurtenbachii、B. lanei、 B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis, and RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis, B. miyamotoi.LBおよびRFスピロヘータを成長させるための基本的な培地は、確立された培養物におけるスピロヘータの成長を確実にサポートするバーバー・ストーナー・ケリー(BSK-IIまたはBSK-H)培地です。接種材料中で初期スピロヘータ数が低いダニまたは宿主由来のサンプルから新たに単離されたボレリア分離株を増殖させることができるように、修飾ケリー・ペッテンコーファー(MKP)培地が好ましい。この培地は、B. miyamotoiの増殖もサポートします。RFスピロヘータの栽培の成功は、成分の品質にも大きく依存します。

概要

ボレリアは、ライムボレリア症(LB)グループ、再発熱(RF)グループ、および爬虫類に限定されているように見えるあまり特徴のないグループの3つの主要なクレードを含むスピロヘータ細菌の属です。ボレリア分類学は、他のほとんどの分類群1,2,3,4,5,6,7と同様に、ゲノムとプロテオームの比較を可能にする分子方法論の出現により流動的である。LBグループ(ライム病グループとも呼ばれます)は、伝統的に、その最も特徴的なメンバーであるボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ストリクトにちなんでボレリア・ブルグドルフェリ・センス・ラトと呼ばれています。この論文では、現在最も広く使用されている用語であるLB、RF、および爬虫類関連グループを使用し、LBおよびRFグループの培養プロトコルについて説明します。

スピロヘタ科のメンバーに期待されるように、ボレリアは、典型的には長さ20〜30μm、幅0.2〜0.3μmの独特の長くて細いらせん形状を採用することができる。しかし、ボレリア細胞は非常に多形性であり、それらの複雑な細胞および遺伝子構造の結果として、培養およびin vivoの両方で他の多くの形状を採用することができます1,8。そのスピロヘータ形態では、平面正弦波形態は、内膜と外膜の間のペリプラズム空間で回転する軸方向の鞭毛藻に起因します。この構造は、細胞が宿主組織と相互作用することを可能にするタンパク質を含む外膜を有する、細胞を高度に運動させることを可能にする9,10。外膜タンパク質の発現は厳密に調節されており、宿主組織への浸潤だけでなく、宿主免疫系との相互作用にも影響を及ぼす11。この複雑な遺伝子発現により、ボレリア細胞は脊椎動物宿主と無脊椎動物ベクターの非常に異なる環境の間を行き来することができます。ボレリアのゲノムは原核生物の間では珍しく、環状染色体ではなく線状染色体で構成されています。直鎖染色体に加えて、ボレリア種は7〜21個のプラスミドを含み、いくつかは線状およびいくつかは環状である。プラスミドは宿主の適応と病原性に必要な遺伝子の大部分を保持しており、プロファージに由来する環状プラスミドは、スピロヘータ細胞間の水平遺伝子流動の大部分を担っていると考えられています12,13。宿主適応における役割と一致して、ライムボレリア症群の一部、おそらく多くまたはすべてのメンバーは、培養においてプラスミドを失う14。B. burgdorferiの最も研究されている「実験室適応」株であるB31は、この種の野生分離株に見られる9つのプラスミドのうち7つだけを持っています15。同様に、B. gariniiは培養16でプラスミドを失います。いくつかの研究では、RF種とB. miyamotoiが培養時にプラスミドを保持することが示されています14,17が、最近の研究では、長期間のin vitro培養でプラスミドと感染力が変化していることが示されています18。

培養ベースの方法は、研究と臨床研究の両方において、細菌感染症の実験室検出のゴールドスタンダードであり続けています14,17。体液または組織からの病原体の培養は、複製病原体を直接検出し、研究のためのソース材料を提供します14,17。このプロトコルは、LBグループ、RFボレリアおよびB.miyamotoiのスピロヘータをうまく培養するために必要な方法論とレシピを示しています。ボレリア・スピロヘータを増殖させるための基本的な培地は、汚染された原核生物の増殖を減少させるための抗生物質の有無にかかわらず、バーバー・ストーナー・ケリー培地(BSK-IIまたは市販のBSK-H)である。この培地は、もともとRFボレリア19をサポートするために使用されていた培地から適応され、Stoenner20によってさらに変更され、次にBarbour21によって修正されました。それ以来、多くの改変が開発されており、それぞれが細菌生理機能に影響を及ぼし、成長、感染力、および病原性に影響を与える可能性があります22。この培地は、確立された培養物におけるスピロヘータの成長を確実に支持し、ダニ、哺乳類、および臨床サンプルからスピロヘータを単離するために使用されています23。より最近開発されたバリエーションである修飾ケリー・ペッテンコーファー(MKP)培地は、培養物の播種に利用可能なサンプル中に存在するスピロヘータの数が少ない場合に、環境サンプルから新しいボレリア分離株を単離する際に、より良い単離成功、形態、および運動性を提供できます23,24。すべての場合において、栽培の成功は、新たに調製された培地と適切な成分の使用に大きく依存しています。すべての市販の原料が高品質の培地を生産するわけではありません。接種培養物は、少量の残留周囲酸素の存在下で、従来の32〜34°Cのインキュベーター内で振とうすることなく便利にインキュベートすることができる。ボレリア・スピロヘータは嫌気性菌ですが、自然界では酸素と二酸化炭素の濃度の変動にさらされ、遺伝子発現の変化に応答します26,27,28,29。したがって、遺伝子発現、成長、およびその他の代謝研究は、酸素制御インキュベーターまたは嫌気性チャンバーを使用して酸素および二酸化炭素レベルを制御する必要があります。培養では、培養物は毎週、またはより頻繁に、暗視野顕微鏡または位相差顕微鏡のいずれかでスピロヘータの存在についてチェックされます。培養塗抹標本は、銀染色、免疫組織化学、または蛍光タグ付き株29、30のいずれかで染色することができる。PCRとそれに続くDNAシーケンシングは、ボレリア種を検出し、遺伝的に同定または確認するための高感度で特異的な方法です30、31、32、33。

BSK-IIには多くのマイナーなバリエーションが存在し、一部は市販されています。セクション1でここで説明されているプロトコルは、Barbour (1984)21から適応されています。液体MKP培地は、より最近開発された培地であり、セクション2に記載されている。これは、以前に報告されたプロトコル33,34に従って調製され、BSK培地と同様に、基本培地の調製および完全培地の調製の2つの工程からなる。ボレリア培養培地は、セクション3に記載されているように、抗生物質の有無にかかわらず調製できます。抗生物質は、セクション4で説明されているように、臨床サンプルまたは環境サンプルを接種するときに導入される汚染細菌を減らすように機能します。純粋なボレリアsp.培養物を接種する場合、抗生物質は必要ないかもしれません。ボレリアの長期株を作ることはしばしば重要であり、そのためのプロトコルはセクション5で説明されています。セクション6では、これらの培地を使用して、臨床サンプルまたは環境サンプルから純粋なボレリアセンスラトクローンを単離する方法について説明します。可能なアプローチはいくつかあります36。以下は効果的であることが判明したものです。このプロトコルで使用されるプレーティング媒体は、BSK-IIメッキ培地37およびMKP培地34の改変です(ウサギ血清を10%38に増加)。

プロトコル

ヒト被験者から得られたサンプルを含むすべての研究は、関連する大学および/または医療施設の治験審査委員会によって承認され、サンプルが収集される前に参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。動物から得られたサンプルを含むすべての研究は、施設動物倫理委員会のガイドラインの下で承認され、実施されました。必要に応じて、環境サンプリングの承認が得られています。

注:文化の成功は、食材の品質に大きく依存しています。市販のBSK培地が利用可能であり、実験室に適応した純粋な B.ブルグドルフェリ および高用量の接種材料を使用して培養物を播種できる関連種の増殖を強力にサポートします。一次生物学的材料からの菌株の単離物の場合、新たに調製された培地が好ましく、しばしば必要である。

ボレリア sp.は既知または疑われる病原体であり、スクリーニングされていないヒトまたは動物の組織もバイオハザードになる可能性があります。感染の可能性のある物質の取り扱いには、治験責任医師の安全のために個人用保護具と滅菌技術が必要です。さらに、培地は非常に栄養が豊富であるため、培養物は簡単に汚染されます。この作業にはバイオセーフティレベル2の封じ込めが一般的に必要であり、 Borrelia sp.またはサンプルを使用したすべての作業は生物学的安全キャビネットで実施する必要があります。

1. BSK-II培地の作り方

  1. 完全なBSK-II培地の調製
    1. 表1に示すように 1 Lの培地を調製して試薬を得た。
      注:BSAの純度(または純度の欠如)は、最適な成長にとって重要です。特にBSA純度はメーカーとロットで異なります。成功している製品と成功していない製品のリストについては、 表2 を参照してください。異なるベンダーからいくつかのサンプルを入手し、最適な成長のためにそれらをテストし、次に最良のロットを大量に購入することは、この問題を軽減し、優れた培地を作成するための効果的な戦略です。
    2. BSAをビーカーに溶かして水を入れて沸騰させることから始めますが、これには少なくとも30分かかります。
    3. すべての乾燥化学物質を加えて溶かします。次に、CMRL を追加します。
    4. 必要に応じて、BSK-II培地のpHを1 M NaOHで7.6に調整します。
    5. ウサギ血清をBSK-II培地に6%〜10%の濃度で加える。BSK-II培地をフィルター滅菌(孔径0.22μm)します。血清の必要量は ボレリア 種によって異なります。RF種と菌株、および ボレリア・ブルグドルフェリ ・センス・ラトには6%〜7%を使用してください。成長が強くない場合は、さらに1%〜2%の滅菌ウサギ血清を培地に加えます。
    6. BSK-II培地のストックを100 mLまたは400 mLのアリコートで凍結します。
    7. RF株の場合、ゼラチンが必要です。100 mLの7%滅菌ゼラチン(少し温めて溶液に入れます)を400 mL BSK-II培地に加えます。BSK-IIをゼラチンとともに37°Cで温め、ゼラチンを溶かしてから培養液に接種します。
      注:培地は、フィルター滅菌およびウサギ血清およびゼラチン(RFスピロヘータ用)の添加前、またはフィルター滅菌および血清(およびゼラチン)添加後に凍結(-20°C)することができます。培地は長時間凍結しても安定です。冷蔵庫で保存する場合は、1ヶ月以内に培地を使用してください。RF種は、通常1週齢以下の新鮮な培地で最もよく成長します。凍結していない場合は、培地の品質に濁りがないか目視検査します。汚染されている、沈殿する成分、またはその他の疑わしいと思われる培地を廃棄します。
    8. 抗生物質を培地に添加する場合は、作りたての培地または以前に凍結したアリコートに追加します。後者はより柔軟なアプローチです。Oliver et al.39に記載されている抗生物質濃度を使用してください。
    9. 培地のチューブを解凍しながら、精密天びんを使用して、抗生物質を滅菌(オートクレーブ)1.7 mLチューブまたは滅菌15 mLコニカルチューブに計量します。25 mgのアムホテリシンBを10 mLのDMSOに、20 mgのホスホマイシンを1 mLのオートクレーブ蒸留水に、50 mgのリファンピシンを1 mLのDMSOに溶解します。
    10. フィルターは抗生物質を滅菌し(0.2μmシリンジフィルター)、適切なサイズの新しいチューブに移します。
    11. 抗生物質を培地の1:1000の比率で希釈して、最終濃度に到達します。500 mLのBSKに対して、0.5 mLのアムホテリシンBストック溶液(DMSO溶液2.5 mg/mL)、0.5 mLのホスホマイシンストック溶液(滅菌H2O溶液20 mg/mL)、および0.5 mLのリファンピシン(米国:リファンピン)ストック溶液(50 mg/mLのDMSO溶液)を加えます。
    12. 抗生物質を添加した培地またはアリコートを使用し、-20°Cで凍結します。
成分量 (/L)
BSAフラクションV50グラム
CMRL-1066 (10倍速)100ミリリットル
ネオペプトン5グラム
ヘペス6グラム
クエン酸三ナトリウム二水和物0.7 グラム
グルコース5グラム
TC酵母ート2グラム
ピルビン酸(Na塩)0.8グラム
N-アセチル-D-グルコースアミン0.4グラム
炭酸水素ナトリウム2.2 グラム
水(高純度)900ミリリットル

表1:BSK-II培地1Lの組成。

源相応
Serva GmbH, ハイデルベルク, ドイツはい
プロリアントバイオロジカルズ、ブーンIA、米国はい
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), St. Louis, MO, アメリカ合衆国いいえ

表2:BSAの供給源とBSK-II培地への適合性。

2. MKPの作成手順

  1. 基本培地の調製
    1. 以下の 表3 に記載されているすべての粉末成分を、ddH2O(約750 mL)の最終容量の3/4に注意深く計量して溶解し、完全に溶解するまで攪拌します(~1時間かかります)。
    2. 完全に溶解した後、NaOHでpHを7.6に、容量を1000mLに調整し、ろ過(0.22μmフィルター)で滅菌します。
      注:塩基性培地は、-20°Cで最大3か月間保存できます。
  2. MKP完全培地の調製
    1. 表4に記載されているすべての成分を滅菌方法で混合します。オートクレーブ滅菌でゼラチンを滅菌し、無菌で取り扱ってください。滅菌生物学的安全キャビネットで作業し、滅菌ろ過された血清を使用してください。
    2. MKPを50 mLチューブに分注します。少量のアリコート1個を33°Cで数日間入れ、暗視野顕微鏡で汚染がないかどうかを確認します。
      注意: MKP完全培地を+ 4°Cで1か月以内に保ち、凍結しないでください。完全な培地は、0.22μmフィルターを使用したろ過によってさらに滅菌できます。
成分量 (/L)
CMRL-1066 (グルタミンなしで10回)100 mL (液体の場合)/9.7 g/L (粉末の場合)
ネオペプトン3グラム
ヘペス6グラム
クエン酸0.7 グラム
グルコース3グラム
ピルビン酸0.8グラム
N-アセチルグルコースアミン0.4グラム
炭酸水素ナトリウム2グラム

表3:1Lの塩基性MKP(変性ケリー・ペッテンコーファー)培地の組成。

成分使用量(mL)
基本メディア500
7%ゼラチン(H2O中)(オートクレーブしたてだが熱くない)100
ウサギ血清36
35% BSA17.5

表4:MKP(修飾ケリー・ペッテンコーファー)完全培地の組成。

3.抗生物質の有無にかかわらず 、ボレリアの文化

  1. 生物学的安全キャビネット内の無菌作業条件下ですべての実験ステップを実行します。表面とすべての材料を70%エタノールで消毒し、すぐに生物学的安全キャビネットに移します。作業開始前に、生物学的安全キャビネット内のすべての非生物学的材料を5分間UV滅菌します。
  2. 可能な限り新鮮な培地を使用してください。
  3. 培養を開始するには、培地(33°C〜37°C)をインキュベーター内で事前に温めます。必要に応じて振とうします。
    メモ: 培地の容量によっては、この手順に数時間かかる場合があります。
  4. グリセロールまたは類似のストックから解凍した ボレリア 培養液を、液体になったらすぐに、-80°Cで保存し、室温(RT)で解凍した~1 mLを、事前に温めたBSK培地5-15 mLに加えます。スクリューキャップ付きの市販のガラスまたはプラスチックバイアルを使用して、培養液を少量(5〜15 mLのBSK)に接種します。チューブをほぼいっぱいにして、微嫌気性または嫌気性雰囲気を作ります。チューブをしっかりと閉じます。この方法で培養すれば、CO2 は不要である。
  5. RF種(および B. persica)を撹拌または撹拌せずにインキュベーター内で37°Cで増殖させる。 B. burgdorferi sensu lato種を33-34°Cで育てる。
  6. 位相差顕微鏡または暗視野顕微鏡を使用して、200倍から400倍の倍率で ボレリア 培養の成長を監視します(図3)。細胞を均一に分布させるには、培養液を血清学的ピペットで混合するか、3 mLトランスファーピペットでさらに混合しながらピペッティングします。
    注: ボレリア は高倍率(200X〜400X)で最も目立ちますが、血球計算盤200倍の倍率で最もよく数えられます40. ボレリア の動きと形態は、これらの細菌の存在を示しています。
  7. 細菌の増殖を定量化するには、血球計算盤の両側の面積をカウントする16フィールドのグリッドパターンでいくつかの(10)個々の小さな正方形を数え、平均します。小さな正方形あたりの平均細胞数に、mLあたりの細胞数を決定するために使用する血球計算盤に適した変換係数を掛けます。
  8. 1〜2日間隔で細菌の増殖を監視します。 ボレリア の指数関数的増殖は生存率と細胞密度に依存し、34°Cで1週間以上かかる場合があります。 血球計算盤にロードする前に、1.7 mLチューブ内の培地で指数相培養を1:2または1:4の比率で希釈します。細胞数を決定する際には、希釈係数を適切に考慮してください。使用後、表面と血球計算盤に希釈漂白剤(10%)および/または70%エタノールをスプレーします。.
    注: ボレリア は、細胞濃度が1〜5 x 107 細胞/ mLの場合、指数関数的に成長します。この範囲内であれば、細胞はよく成長する。
  9. 長時間の培養は栄養素を枯渇させ、培地のpHを変化させるため、継代培養が必要です。生物学的安全キャビネット内の無菌条件下で、培養容量の1/10を新しいチューブに移し、新しい培地(前の継代を成長させるために使用したのと同じ培地の新鮮なアリコート)で満たします。1:10希釈が最適です。培養量を変更する場合は、それに応じて接種量を調整し、インキュベーションを継続します。継代数は、培地が変化するたびに増加します。
  10. DNAの抽出またはボレリア細胞の単離のために、指数相ボレリアを4000 x gで10分間遠心分離して、細菌をペレット化します。上清を適切なバイオハザード廃棄物に廃棄する。市販のDNA抽出キットでペレット化した細菌を処理するか、目的の実験に適した培地に細菌を再懸濁します。
  11. 各操作の最後に、機器に応じて、すべての機器をエタノールとUV放射で滅菌します。余分な培養液を含む廃液を廃液ボトルに回収し、最終濃度10%になるまで漂白剤を加えます。廃棄する前に、このボトルを-80°Cに置いてください。あるいは、オートクレーブにより漂白剤やアルコールを含まない廃液や培養液を殺菌する。

4. ボレリア 培養物の長期保存

  1. ボレリア培養物のグリセロールストックの調製
    1. 指数関数的段階培養の~1.8 mLアリコート、細胞濃度~107-10 8 細胞/mLを取り、滅菌グリセロールを最終濃度10%(濃度5%-20%の仕事)まで加えます。
    2. 2 mLスクリューキャップ極低温バイアルに入れます。-80°Cで保存してください。
    3. 冷凍庫に各菌株の少なくとも10本のチューブを入れた在庫を維持します。
  2. 永久貯蔵用のグリセロールストックを製造するための代替貯蔵レシピ
    1. ボレリア培養物の2/3をブルセラブロス中の15%グリセロールの1/3と混合します。滅菌濾過したddH 2Oの100mLに溶解した2.8gのブルセラブロスを使用する(0.22μm)。
    2. サンプルのグリセロールストックを-70°Cから-80°Cに保ちます。

5.環境または臨床源からのスピロヘータの分離

注意: 人間、動物、または環境源から材料を分離する場合は、必要に応じて、研究倫理、動物の世話、または生態学的認証を取得する必要があります。

  1. ハードダニからの ボレリア の栽培
    1. 成人の女性、男性、および/または幼虫ダニを収集します。
    2. すべてのダニサンプルを70%エタノールに2分間浸し、生物学的安全キャビネットで風乾して表面滅菌します。滅菌メスで個別にいくつかの部分に解剖します。抗生物質を添加した1.5 mLの培地を含む2 mLチューブに小片を入れます。
    3. 培養液を34°Cでインキュベートし、暗視野顕微鏡または位相差顕微鏡でスピロヘータを最初の2週間は週2回、その後は6週間(RFスピロヘータの場合はより頻繁に)チェックします。5 mLの同じ培地で継代培養陽性サンプル。
      注:汚染された培養物は、0.2 μmフィルターを使用したろ過によってある程度精製できます。汚染を完全に解決するには、抗生物質が必要になる場合があります。
  2. 血液サンプルからの ボレリア の培養
    注意: 血液サンプルは、材料の出所に応じて、資格のある医療、獣医、または研究の専門家が採取する必要があります。RTで24時間未満はサンプル間で経過する必要があります
    取り外してラボに到着します。
    1. 10 mLの血液を取得し、酸性クエン酸デキストロース(ACD;「イエロートップ」)を抗凝固剤として使用します。室温で放置してください。採血から接種まで24時間以内が推奨されます。
    2. 血液を抗凝固剤で200〜400 x g で10分間遠心分離して、血球から血漿を分離します。
    3. チューブから血漿を静かに取り出し、1 mLの血漿を5 mLの予熱されたMKP完全培地に接種します。MKPは抗生物質を補給することができます。ボレリアの成長が気付くまで(RF ボレリアの場合が多い)、最大9週間かかることがあるまで、毎日の目視検査と毎週の暗視野または位相差顕微鏡で培養物を33°Cでインキュベートします。
      注意: 接種量が多いまたは小さい場合は、接種剤と培地の比率を1:5に維持してください。全血ではなく血清または血漿を使用してください。
  3. 皮膚生検からの ボレリア の栽培
    1. 皮膚生検(理想的には3 mm x 3 mm x 3 mmの立方体、つまり70%エタノールと過酸化水素)を表面滅菌します。生検サンプルを生理食塩水に入れます。
      注意: 生検サンプルは、材料の出所に応じて、資格のある医療、獣医、または研究の専門家が採取する必要があります。RTで24時間未満は、サンプルを取り出してからラボに到着するまでに経過する必要があります。
    2. 生理食塩水に浸しながら、滅菌ガラスペトリ皿に滅菌かみそりの刃を使用してサンプルを2〜6個の小さな断片にさいの目に切る。皮膚生検を保存したすべてのサンプルと~1 mLの生理食塩水を、抗生物質を添加した5 mLの予熱培地に移し、33°Cでインキュベートします。
    3. 汚染細菌の異常増殖の場合は、上記のステップ1.1.10のように抗生物質を追加するか、スルファメトキサゾール(23.75 mg;最終濃度5 mg / mL)+トリメトプリム(1.25 mg; 0.25 mg / mL)またはバクトリム(最小阻害濃度>128 μg / mL)、アミカシン2錠(2 x 30 μg、最終濃度12 μg / mL)、 ホスフォマイシンの2錠(2 x 200 μg、最終濃度80 μg / mL)。.
      注:すべての場合において、培養が試みられているボレリア種の抗生物質の最小阻害濃度を下回るようにしてください41,42,43。
    4. 培養物が ボレ リアに対して陽性である場合は、さらに3〜4日間、または ボレリア の量が40倍の対物レンズを使用して顕微鏡フィールドで10+スピロヘータに達するまで培養物を保持します。永久保存用のグリセロールストックを作成します。

6. 固体培地培養による液体培養物からのB. burgdorferi sensu lato spirochetesおよびB. miyamotoiのモノクローナル集団の単離

  1. プレートを作るには、300 mLの1.5X MKP完全培地(ゼラチンなし)を温めます。また、200mLの1.7%アガロース(脱イオン水中でオートクレーブ滅菌、RTで保存、使用前にマイクロ波処理)を55°Cに温めた。 両方の液体を混ぜます。
  2. この混合物15mLを16枚の深部シャーレのそれぞれにピペットで入れ、底寒天オセレイヤーを作製した。
  3. 残りの培地を水浴中で55°Cに保持する。
    注: ボレリア は上部のアガロース層に混合されます。
  4. まず、血球計算盤を使用して ボレリア 培養密度を定量し、液体培地で目的の密度に希釈します。
    注意: プレートあたり500、200、100、および50のスピロヘータがうまく機能します。
  5. 底板が固まったら、残りのアガロース混合物10 mLを適切な数のスピロヘータを含む15 mLチューブに加えます。
  6. ラベルの付いたペトリ皿の底のアガロースに懸濁液を注ぎます。
    注意: ボレリア ・スピロヘータは高温に敏感であるため、細菌が55°Cに長時間さらされないように注意する必要があります。培地中の菌体に加えたらすぐにトップ寒天を注ぎます。
  7. プレートが完全に固まったら、ペトリ皿を閉じ、2.5%CO2中で34〜35°Cで逆さまに置きます。
    注:手順が成功した場合、コロニーはメッキの1週間後に現れます。
  8. 個々のコロニーをスクリーニングして拡張するには、プレートから単一のコロニーを選択し、滅菌2 mL培養チューブ内の1.5 mLの修飾液体MKPまたは他の適切な培地に入れます。
  9. 培養液を34°Cでインキュベートし、暗視野顕微鏡または位相顕微鏡でスピロヘータを調べます。上記のように作られた分析またはストックのためにこれらの培養物を使用してください。

結果

ボレリア 培地BSKおよびMKP、およびバリアントは、順次調製および滅菌する必要がある成分を含む豊富な培地です。正しく調製されると、BSK培地は赤橙色で透明になります(図1)。加温後も持続する濁度と沈殿は、問題のある成分、中程度の生産、または汚染を示しています。そのような培地は捨てるのが一番です。ゼラチンをBSKおよびMKPに添加すると、冷蔵すると...

ディスカッション

細菌の実験室培養は研究の出発点です。培養能力によってもたらされる大きな利点は、梅毒の病因であるスピロヘータであるトレポネーマパリダムを培養するために、ごく最近成功に至った1世紀以上にわたる闘争によって例示されます44。ボレリア・スピロヘータも培養に挑戦的であるが、培養は可能である23、24、<...

開示事項

利益相反は宣言されていません。

謝辞

この作業は、カナダ自然科学工学研究評議会とカナダライム病財団(ABおよびVL)、スウェーデン研究評議会(SB、M-LF、IN)、TAČR GAMA 2プロジェクト-「生物学センターCASでのアプリケーションポテンシャル検証2.0のサポート」(TP01010022)(MGおよびNR)、およびチェコ共和国保健省NV19-05-00191(MGおよびNR)からの助成金によって部分的にサポートされました。図4の画像についてはS. Vranjes(2021、Rudenkoラボ)に、図5の画像についてはJ. Thomas-Ebbett(2021、ロイドラボ)に感謝します。この分野に貢献したすべての研究者に感謝し、スペースの制限のために引用できなかった研究者に謝罪します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.7 mL tubesVWR87003-294Standard item - any supplier will do
0.2 µm Sterile syringe filter VWR28145-501Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tipNeptuneBT10XLS3Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes Celltreat229011BStandard item - any supplier will do
1000 µL barrier pipette tipNeptuneBT1000.96Standard item - any supplier will do
15 mL tubeCelltreat188261Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tipNeptuneBT20Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe BD309661Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tipNeptuneBT200Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture TubesFisher Scientific14-933CStandard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettesCelltreat229025BStandard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringeBD309657Standard item - any supplier will do
35% BSA SigmaA-7409Source is important - see note
5 mL Serological pipettes Celltreat229006BStandard item - any supplier will do
50 mL tubeCelltreat229421Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes SchottSchott Nr. 26 135 115Standard item - any supplier will do
AmikacineSigmaPHR1654Standard item - any supplier will do
Amphotericin BSigmaA9528-100MGStandard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazoleSigmaPHR1126-1GStandard item - any supplier will do
BBL Brucella broth BD211088Standard item - any supplier will do
Biosafety CabinetLabconco302419100Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD)Fisher ScientificBD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD)Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum] Darlynn biologicalsBB83-500Standard item - any supplier will do
centrifuge Eppendorfmodel 5430Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrateSigmaC-8532 100 gStandard item - any supplier will do
CMRLGibco BRL21540 500 mLStandard item - any supplier will do
CMRL-1066Gibco21-510-018Standard item - any supplier will do
Cryogenic Tubes (Nalgene)Fisher Scientific5000-0020Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mmSigmaP7741Standard item - any supplier will do
Digital IncubatorVWRmodel 1545Standard item - any supplier will do
DMSOThermoFisherD12345Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilizationMillipore 0.22μm GPExpressPLUS MembraneSCGPU05REStandard item - any supplier will do
GelatinDifco BD214340 500 gStandard item - any supplier will do
Glass Culture TubesFisher Scientific99449-20Standard item - any supplier will do
GlucoseSigmaG-7021 1 kgStandard item - any supplier will do
GlycerolSigmaG5516Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge )LabwissenModel 3220Standard item - any supplier will do
HEPESSigma H-3784 100 gStandard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamineSigma A-3286 25 gStandard item - any supplier will do
NeopeptoneDifco  BD211681 500 gStandard item - any supplier will do
Neubauer HematocytometerSigma Z359629Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope LeitzStandard item - any supplier will do
PhosphomycinSigmaP5396-1GStandard item - any supplier will do
PhosphomycineSigmaP5396Standard item - any supplier will do
PipetboyIntegraStandard item - any supplier will do
Precision Standard BalanceOHAUSmodel TS200SStandard item - any supplier will do
Pyruvic acid (Na salt)SigmaP-8574 25 gStandard item - any supplier will do
Rabbit Serum Gibco16-120-032Source is important 
Rabbit Serum SigmaR-4505  100 mLSource is important 
RifampicinSigmaR3501-1GStandard item - any supplier will do
Sodium bicarbonateSigmaS-5761     500 gStandard item - any supplier will do
Sufametaxazole SigmaPHR1126Standard item - any supplier will do
TC YeastolateDifco  BD255752 100 gStandard item - any supplier will do
Transfer PipettesVWR470225-044Standard item - any supplier will do
TrimethoprimSigmaPHR1056Standard item - any supplier will do

参考文献

  1. Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
  2. Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A. Phyloproteomic and functional analyses do not support a split in the genus Borrelia (phylum Spirochaetes). BMC Evolutionary Biology. 19 (1), 54 (2019).
  3. Parte, A. C., Carbasse, J. S., Meier-Kolthoff, J. P., Reimer, L. C., Göker, M. List of prokaryotic names with standing in nomenclature (LPSN) moves to the DSMZ. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (11), 5607-5612 (2020).
  4. . List of prokaryotic names with standing in nomenclature Genus Borrelia Available from: https://lpsn.dsmz.de/gnus/borrelia (2022)
  5. Margos, G., et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 13 (12), 0208432 (2018).
  6. Gupta, R. S., et al. Distinction between Borrelia and Borreliella is more robustly supported by molecular and phenotypic characteristics than all other neighbouring prokaryotic genera: Response to Margos' et al. The genus Borrelia reloaded. PLoS ONE. 14 (12), 0221397 (2019).
  7. Barbour, A. G., Qiu, W., Trujillo, S., Dedysh, P., DeVos, B., Hedlund, P., Kampfer, F. A., Rainey, W. B., Whitman, Borreliella. Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria. , 1-22 (2019).
  8. Rudenko, N., Golovchenko, M., Kybicova, K., Vancova, M. Metamorphoses of Lyme disease spirochetes: Phenomenon of Borrelia persisters. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-10 (2019).
  9. Strnad, M., et al. Nanomechanical mechanisms of Lyme disease spirochete motility enhancement in extracellular matrix. Communications Biology. 4 (1), 268 (2021).
  10. Niddam, A. F., et al. Plasma fibronectin stabilizes Borrelia burgdorferi-endothelial interactions under vascular shear stress by a catch-bond mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (17), 3490-3498 (2017).
  11. Anderson, C., Brissette, C. A. The brilliance of Borrelia: Mechanisms of host immune evasion by Lyme disease-causing Spirochetes. Pathogens. 10 (3), 1-17 (2021).
  12. Brisson, D., Drecktrah, D., Eggers, C. H., Samuels, D. S. Genetics of Borrelia burgdorferi. Annual Review of Genetics. 46, 515-536 (2012).
  13. Schwartz, I., Margos, G., Casjens, S. R., Qiu, W. G., Eggers, C. H. Multipartite genome of lyme disease Borrelia: Structure, variation and prophages. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 409-454 (2021).
  14. Lopez, J. E., et al. Relapsing fever spirochetes retain infectivity after prolonged in vitro cultivation. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 8 (6), 813-820 (2008).
  15. Schwan, T. G., Burgdorfer, W., Garon, C. F. Changes in infectivity and plasmid profile of the Lyme disease spirochete, Borrelia Burgdorferi, as a result of in vitro cultivation. Infection and Immunity. 56 (8), 1831-1836 (1988).
  16. Biškup, U. G., Strle, F., Ružić-Sabljić, E. Loss of plasmids of Borrelia burgdorferi sensu lato during prolonged in vitro cultivation. Plasmid. 66 (1), 1-6 (2011).
  17. Gilmore, R. D., et al. Borrelia miyamotoi strain LB-2001 retains plasmids and infectious phenotype throughout continuous culture passages as evaluated by multiplex PCR. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (1), 101587 (2021).
  18. Krishnavajhala, A., Armstrong, B. A., Lopez, J. E. The impact of in vitro cultivation on the natural life cycle of the tick-borne relapsing fever spirochete Borrelia turicatae. PLoS One. 15 (10), 0239089 (2020).
  19. Kelly, R. Cultivation of Borrelia hermsi. Science. 173 (3995), 443-444 (1971).
  20. Stoenner, H. G. Biology of Borrelia hermsii in Kelly Medium. Applied Microbiology. 28 (4), 540-543 (1974).
  21. Barbour, A. G. Isolation and cultivation of Lyme disease spirochetes. Yale Journal of Biology and Medicine. 57 (4), 521-525 (1984).
  22. Wang, G., et al. Variations in Barbour-Stoenner-Kelly culture medium modulate infectivity and pathogenicity of Borrelia burgdorferi clinical isolates. Infection and Immunity. 72 (11), 6702-6706 (2004).
  23. Pollack, R. J., Telford, S. R., Spielman, A. Standardization of medium for culturing Lyme disease spirochetes. Journal of Clinical Microbiology. 31 (5), 1251-1255 (1993).
  24. Ružiæ-Sabljiæ, E., et al. Comparison of MKP and BSK-H media for the cultivation and isolation of Borrelia burgdorferi sensu lato. PLoS One. 12 (2), 0171622 (2017).
  25. Ružić-Sabljić, E., et al. Comparison of isolation rate of Borrelia burgdorferi sensu lato in two different culture media, MKP and BSK-H. Clinical Microbiology and Infection. 20 (7), 636-641 (2014).
  26. Hyde, J. A., Trzeciakowski, J. P., Skare, J. T. Borrelia burgdorferi alters its gene expression and antigenic profile in response to CO2 levels. Journal of Bacteriology. 189 (2), 437-445 (2007).
  27. Seshu, J., Boylan, J. A., Gherardini, F. C., Skare, J. T. Dissolved oxygen levels alter gene expression and antigen profiles in Borrelia burgdorferi. Infection and Immunity. 72 (3), 1580-1586 (2004).
  28. Raffel, S. J., Williamson, B. N., Schwan, T. G., Gherardini, F. C. Colony formation in solid medium by the relapsing fever spirochetes Borrelia hermsii and Borrelia turicatae. Ticks and Tick-borne Diseases. 9 (2), 281-287 (2018).
  29. Margos, G., et al. Long-term in vitro cultivation of Borrelia miyamotoi. Ticks and Tick-borne Diseases. 6 (2), 181-184 (2015).
  30. Middelveen, M. J., et al. Culture and identification of Borrelia spirochetes in human vaginal and seminal secretions. F1000Research. 3, 309 (2014).
  31. Moriarty, T. J., et al. Real-time high resolution 3D imaging of the Lyme disease spirochete adhering to and escaping from the vasculature of a living host. PLoS Pathogens. 4 (6), 1000090 (2008).
  32. Cerar, T., Korva, M., Avšič-Županc, T., Ružić-Sabljić, E. Detection, identification and genotyping of Borrellia spp. In rodents in Slovenia by PCR and culture. BMC Veterinary Research. 11, 188 (2015).
  33. Liebisch, G., Sohns, B., Bautsch, W. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks attached to human skin by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 36 (11), 3355-3358 (1998).
  34. Ružić-Sabljić, E., Strle, F. Comparison of growth of Borrelia afzelii, B. gavinii, and B. burgdorferi sense strict in MKP and BSK-II medium. International Journal of Medical Microbiology. 294 (6), 407-412 (2004).
  35. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Schierz, G. European Borrelia burgdorferi isolated from humans and ticks culture conditions and antibiotic susceptibility. Zentralblatt fur Bakteriologie Mikrobiologie und Hygiene. Series A, Medical Microbiology, Infectious Diseases, Virology, Parasitology. 263 (1-2), 112-118 (1986).
  36. Preac-Mursic, V., Wilske, B., Reinhardt, S. Culture of Borrelia burgdorferi on six solid media. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 10 (12), 1076-1079 (1991).
  37. Rosa, P. A., Hogan, D. Colony formation by Borrelia burgdorferi in solid medium: clonal analysis of osp locus variants. First International Conference on Tick Borne Pathogens at the Host-Vector Interface: An Agenda for Research. , 95-103 (1992).
  38. Wagemakers, A., Oei, A., Fikrig, M. M., Miellet, W. R., Hovius, J. W. The relapsing fever spirochete Borrelia miyamotoi is cultivable in a modified Kelly-Pettenkofer medium, and is resistant to human complement. Parasites and Vectors. 7 (1), 4-9 (2014).
  39. Oliver, J. H., et al. First isolation and cultivation of Borrelia burgdorferi sensu lato from Missouri. Journal of Clinical Microbiology. 36 (1), 1-5 (1998).
  40. Greenfield, E. A. Myeloma and hybridoma cell counts and viability checks. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (10), 689-690 (2019).
  41. Baradaran-Dilmaghani, R., Stanek, G. In vitro susceptibility of thirty borrelia strains from various sources against eight antimicrobial chemotherapeutics. Infection. 24 (1), 60-63 (1996).
  42. Ružić-Sabljić, E., Podreka, T., Maraspin, V., Strle, F. Susceptibility of Borrelia afzelii strains to antimicrobial agents. International Journal of Antimicrobial Agents. 25 (6), 474-478 (2005).
  43. Sicklinger, M., Wienecke, R., Neubert, U. In vitro susceptibility testing of four antibiotics against Borrelia burgdorferi: A comparison of results for the three genospecies Borrelia afzelii, Borrelia garinii, and Borrelia burgdorferi sensu stricto. Journal of Clinical Microbiology. 41 (4), 1791-1793 (2003).
  44. Edmondson, D. G., Hu, B., Norris, S. J. Long-term in vitro culture of the syphilis spirochete treponema pallidum subsp. Pallidum. mBio. 9 (3), 01153 (2018).
  45. Wilhelmsson, P., et al. Prevalence and diversity of Borrelia species in ticks that have bitten humans in Sweden. Journal of Clinical Microbiology. 48 (11), 4169-4176 (2010).
  46. Toledo, A., et al. Phylogenetic analysis of a virulent Borrelia species isolated from patients with relapsing fever. Journal of Clinical Microbiology. 48 (7), 2484-2489 (2010).
  47. Elbir, H., et al. Genome sequence of the Asiatic species Borrelia persica. Genome Announcements. 2 (1), 01127 (2014).
  48. Sapi, E., et al. Improved culture conditions for the growth and detection of Borrelia from human serum. International Journal of Medical Sciences. 10 (4), 362-376 (2013).
  49. Liveris, D., et al. Quantitative detection of Borrelia burgdorferi in 2-millimeter skin samples of erythema migrans lesions: Correlation of results with clinical and laboratory findings. Journal of Clinical Microbiology. 40 (4), 1249-1253 (2002).
  50. Wormser, G. P., et al. Comparison of the yields of blood cultures using serum or plasma from patients with early Lyme disease. Journal of Clinical Microbiology. 38 (4), 1648-1650 (2000).
  51. Lagal, V., Postic, D., Ruzic-Sabljic, E., Baranton, G. Genetic diversity among Borrelia strains determined by single-strand conformation polymorphism analysis of the ospC gene and its association with invasiveness. Journal of Clinical Microbiology. 41 (11), 5059-5065 (2003).
  52. Lin, Y. P., Diuk-Wasser, M. A., Stevenson, B., Kraiczy, P. Complement evasion contributes to Lyme Borreliae-host associations. Trends in Parasitology. 36 (7), 634-645 (2020).
  53. Real-time PCR: understanding Ct. Application Note Real-time PCR. Thermo Fisher Scientific Inc Available from: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/PG1503-PJ9169-CO019879-Re-brand-Real-Time-PCR-Undertanding-Ct-Value-Americas-FHR.pdf (2016)
  54. Adams, B., Walter, K. S., Diuk-Wasser, M. A. Host specialisation, immune cross-reaction and the composition of communities of co-circulating Borrelia strains. Bulletin of Mathematical Biology. 83 (6), 66 (2021).
  55. Marosevic, D., et al. First insights in the variability of Borrelia recurrentis genomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (9), 0005865 (2017).
  56. Koetsveld, J., et al. Development and optimization of an in vitro cultivation protocol allows for isolation of Borrelia miyamotoi from patients with hard tick-borne relapsing fever. Clinical Microbiology and Infection. 23 (7), 480-484 (2017).
  57. Kuleshov, K. V., et al. Whole genome sequencing of Borrelia miyamotoi isolate Izh-4: Reference for a complex bacterial genome. BMC Genomics. 21 (1), 16 (2020).
  58. Replogle, A. J., et al. Isolation of Borrelia miyamotoi and other Borreliae using a modified BSK medium. Scientific Reports. 11 (1), 1926 (2021).
  59. Stanek, G., Reiter, M. The expanding Lyme Borrelia complex-clinical significance of genomic species. Clinical Microbiology and Infection. 17 (4), 487-493 (2011).
  60. Seifert, S. N., Khatchikian, C. E., Zhou, W., Brisson, D. Evolution and population genomics of the Lyme borreliosis pathogen, Borrelia burgdorferi. Trends in Genetics. 31 (4), 201-207 (2015).
  61. Kurokawa, C., et al. Interactions between Borrelia burgdorferi and ticks. Nature Reviews Microbiology. 18 (10), 587-600 (2020).
  62. Coburn, J., et al. Lyme disease pathogenesis. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 473-518 (2021).
  63. Wolcott, K. A., Margos, G., Fingerle, V., Becker, N. S. Host association of Borrelia burgdorferi sensu lato: A review. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (5), 101766 (2021).
  64. Thompson, D., Watt, J. A., Brissette, C. A. Host transcriptome response to Borrelia burgdorferi sensu lato. Ticks and Tick-borne Diseases. 12 (2), 101638 (2021).
  65. Chaconas, G., Moriarty, T. J., Skare, J., Hyde, J. A. Live imaging. Current Issues in Molecular Biology. 42 (1), 385-408 (2021).
  66. Kerstholt, M., Netea, M. G., Joosten, L. A. B. Borrelia burgdorferi hijacks cellular metabolism of immune cells: Consequences for host defense. Ticks and Tick-borne Diseases. 11 (3), 101386 (2020).
  67. Rudenko, N., Golovchenko, M. Sexual transmission of Lyme Borreliosis? The question that calls for an answer. Tropical Medicine and Infectious Disease. 6 (2), 87 (2021).
  68. Cutler, S. J., et al. Diagnosing Borreliosis. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 17 (1), 2-11 (2017).
  69. Middelveen, M. J., et al. Persistent Borrelia infection in patients with ongoing symptoms of Lyme disease. Healthcare. 6 (2), 33 (2018).
  70. Bernard, Q., Grillon, A., Lenormand, C., Ehret-Sabatier, L., Boulanger, N. Skin Interface, a key player for Borrelia multiplication and persistence in Lyme Borreliosis. Trends in Parasitology. 36 (3), 304-314 (2020).
  71. Bobe, J. R., et al. Recent progress in Lyme disease and remaining challenges. Frontiers in Medicine. 8, 666554 (2021).
  72. Branda, J. A., Steere, A. C. Laboratory diagnosis of lyme borreliosis. Clinical Microbiology Reviews. 34 (2), 1-45 (2021).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

189

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved