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요약

시험관 내 배양은 살아있는 박테리아의 존재에 대한 직접적인 검출 방법입니다. 이 프로토콜은 Borrelia burgdorferi sensu lato complex, 재발 열 Borrelia 종 및 Borrelia miyamotoi를 포함하여 다양한 Borrelia spirochetes의 배양 방법을 설명합니다. 이 종은 까다 롭고 느리게 자라지 만 배양 할 수 있습니다.

초록

Borrelia는 B. burgdorferi sensu lato (sl)라고도 알려진 라임 보렐리 아증 (LB) 그룹의 세 그룹으로 구성되며 최근에는 Borreliella, 재발 열 (RF) 그룹 Borrelia 및 세 번째 파충류 관련 스피로 체타 그룹으로 재 분류되었습니다. 배양 기반 방법은 체액 또는 조직에서 병원체를 배양하여 복제 병원체를 직접 감지하고 연구를 위한 소스 자료를 제공하기 때문에 연구 및 임상 작업 모두에서 실험실 박테리아 감염 검출을 위한 황금 표준으로 남아 있습니다. Borrelia와 Borreliella spirochetes는 까다롭고 느리게 자라기 때문에 일반적으로 임상 목적으로 배양되지 않습니다. 그러나 연구에는 문화가 필요합니다. 이 프로토콜은 B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis 및 RFspirochetes, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis 및 B. miyamotoi. LB 및 RF 스피로헤타를 성장시키기 위한 기본 배지는 Barbour-Stoenner-Kelly(BSK-II 또는 BSK-H) 배지로, 기존 배양에서 스피로헤타의 성장을 안정적으로 지원합니다. 접종물에서 초기 스피로헤타 수가 적은 진드기 또는 숙주 유래 샘플에서 새로 분리된 Borrelia 분리물을 성장시킬 수 있으려면 변형된 Kelly-Pettenkofer(MKP) 배지가 선호됩니다. 이 배지는 또한 B. miyamotoi 의 성장을 지원합니다.RF 스피로헤타 재배의 성공 여부는 성분의 품질에 크게 좌우됩니다.

서문

Borrelia는 라임 보렐리오스(LB) 그룹, 재발열(RF) 그룹 및 파충류에 국한된 것처럼 보이는 덜 잘 특성화된 그룹의 세 가지 주요 분기군을 포함하는 스피로헤타 박테리아의 속입니다. Borrelia 분류학은 대부분의 다른 분류학적 그룹 1,2,3,4,5,6,7과 마찬가지로 게놈과 프로테옴 비교를 허용하는 분자 방법론의 출현과 함께 유동적입니다. LB 그룹(라임병 그룹이라고도 함)은 전통적으로 가장 특징적인 구성원인 Borrelia burgdorferi sensu stricto의 이름을 따서 Borrelia burgdorferi sensu lato라고 불렸습니다.  이 논문은 현재 가장 널리 사용되는 용어인 LB, RF 및 파충류 관련 그룹을 사용하고 LB 및 RF 그룹에 대한 배양 프로토콜을 설명합니다.

Spirochaetaceae 계통의 구성원에게 예상되는 바와 같이 Borrelia는 일반적으로 길이 20-30 μm, 너비 0.2-0.3 μm의 독특하고 길고 얇은 나선형 모양을 채택 할 수 있습니다. 그러나 Borrelia 세포는 매우 다형성이며 복잡한 세포 및 유전 구조의 결과로 배양 및 생체 내 1,8 모두에서 다른 많은 모양을 채택할 수 있습니다. 스피로헤탈 형태에서 평면 사인파 형태는 내막과 외막 사이의 주변세포질 공간에서 회전하는 축 방향 내편모충의 결과입니다. 이 구조는 세포가 숙주 조직과 상호 작용할 수 있도록 하는 단백질을 포함하는 외막과 함께 세포가 매우 운동성을 가질 수 있도록 합니다 9,10. 외막 단백질의 발현은 엄격하게 조절되며 숙주 조직 침습뿐만 아니라 숙주 면역계와의 상호 작용에도 영향을 미친다11. 이 복잡한 유전자 발현은 Borrelia 세포가 척추동물 숙주와 무척추동물 벡터의 매우 다른 환경 사이를 왕복할 수 있도록 합니다. Borrelia의 게놈은 원형 염색체가 아닌 선형 염색체로 구성된 원핵 생물 중에서 드뭅니다. 선형 염색체 외에도 Borrelia 종에는 7-21 개의 플라스미드가 포함되어 있으며 일부는 선형이고 일부는 원형입니다. 플라스미드는 숙주 적응 및 독성에 필요한 대부분의 유전자를 보유하고 있으며, 프로파지에서 유래한 원형 플라스미드는 스피로헤탈 세포 사이의 수평 유전자 흐름의 대부분을 담당하는 것으로 생각됩니다12,13. 숙주 적응에서의 역할과 일관되게, 라임 보렐리아증(Lyme borreliosis) 그룹의 일부, 아마도 많은 구성원 또는 전부가 배양에서 플라스미드를 잃는다14. 가장 잘 연구된 B. burgdorferi, B31의 "실험실 적응" 균주는 이 종의 야생 분리주에서 발견되는 9개의 플라스미드 중 7개만 가지고 있다15. 유사하게, B. garinii는 배양물16에서 플라스미드를 잃는다. 일부 연구에서는 RF종과 B. miyamotoi가 배양 시 플라스미드를 보유하는 것으로 나타났으나 14,17, 최근 연구에서는 장기간 체외 배양을 통해 플라스미드와 감염성이 변화된 것으로 나타났다18.

배양 기반 방법은 연구 및 임상 작업 모두에서 박테리아 감염의 실험실 검출을 위한 황금 표준으로 남아 있습니다14,17. 체액 또는 조직에서 병원체의 배양은 복제 병원체를 직접 감지하고 연구를위한 소스 자료를 제공합니다14,17. 이 프로토콜은 LB 그룹과 RF Borrelia 및 B. miyamotoi의 스피로헤타를 성공적으로 배양하는 데 필요한 방법론과 레시피를 보여줍니다. Borrelia spirochetes를 재배하기 위한 기본 배지는 오염된 원핵생물의 성장을 줄이기 위해 항생제를 사용하거나 사용하지 않는 Barbour-Stoenner-Kelly 배지(BSK-II 또는 상업적으로 이용 가능한 BSK-H)입니다. 이 매체는 원래 RF Borrelia19를 지원하는 데 사용된 매체에서 채택되었으며 Stoenner20과 Barbour21에 의해 추가로 수정되었습니다. 그 이후로 많은 변형이 개발되었으며, 각각은 성장, 감염성 및 병원성에 영향을 미칠 수 있는 박테리아 생리학에 영향을 미친다22. 이 배지는 확립된 배양균에서 스피로헤타의 성장을 안정적으로 지원하며, 진드기, 포유류, 임상 검체에서 스피로헤타를 분리하는 데 사용되어 왔다23. 보다 최근에 개발된 변형인 변형된 Kelly-Pettenkofer(MKP) 배지는 배양에 사용할 수 있는 샘플에 존재하는 스피로헤타의 수가23,24개 낮을 때 환경 샘플에서 새로운 Borrelia 분리주를 분리할 때 더 나은 분리 성공, 형태 및 운동성을 제공할 수 있습니다. 모든 경우에 재배의 성공 여부는 신선하게 준비된 배지와 적절한 재료의 사용에 크게 좌우됩니다. 모든 상업용 성분이 고품질 매체를 생산하는 것은 아닙니다. 접종된 배양물은 소량의 잔류 주변 산소의 존재 하에 통상적인 32-34°C 인큐베이터에서 진탕 없이 편리하게 인큐베이션될 수 있다. Borrelia spirochetes는 혐기성 세균이지만 본질적으로 산소 및 이산화탄소 농도의 변동에 노출되며 유전자 발현의 변화에 반응합니다26,27,28,29. 따라서 유전자 발현, 성장 및 기타 대사 연구는 산소 제어 인큐베이터 또는 혐기성 챔버를 사용하여 산소 및 이산화탄소 수준을 제어해야 합니다. 배양에서 배양은 암시야 현미경 또는 위상차 현미경을 사용하여 스피로헤타의 존재 여부를 매주 또는 더 자주 확인합니다. 배양 도말은 은 염색, 면역조직화학, 또는 형광 태그가 부착된 균주29,30을 사용하여 염색할 수 있습니다. PCR 후 DNA 시퀀싱은 Borrelia 종30,31,32,33을 검출하고 유전적으로 식별하거나 확인하는 민감하고 특이적인 방법입니다.

BSK-II에는 많은 사소한 변형이 존재하며 일부는 상업적으로 이용 가능합니다. 섹션 1에서 여기에 설명된 프로토콜은 Barbour(1984)21에서 채택되었습니다. 액체 MKP 배지는 보다 최근에 개발된 배지이며 섹션 2에 설명되어 있습니다. 이전에보고 된 프로토콜33,34에 따라 제조되며, BSK 배지와 유사하게 기본 배지 준비 및 완전 배지 준비의 두 단계로 구성됩니다. Borrelia 배양 배지는 섹션 3에 설명된 바와 같이 항생제를 사용하거나 사용하지 않고 제조할 수 있습니다. 항생제는 섹션 4에 설명된 대로 임상 또는 환경 샘플을 접종할 때 유입되는 오염 박테리아를 줄이는 역할을 합니다. 순수한 Borrelia sp. 배양액으로 접종하는 경우 항생제가 필요하지 않을 수 있습니다. 장기 Borrelia 주식을 만드는 것은 종종 중요하며 이를 위한 프로토콜은 섹션 5에 설명되어 있습니다. 섹션 6은 이러한 배지를 사용하여 임상 또는 환경 샘플에서 순수한 Borrelia sensu lato 클론을 분리하는 방법을 설명합니다. 가능한 여러 가지 접근법이 있습니다36; 아래는 효과적인 것으로 밝혀졌습니다. 이 프로토콜에 사용된 도금 매체는 BSK-II 도금 매체37 및 MKP 배지 34(토끼 혈청이 10%38로 증가)의 변형입니다.

프로토콜

인간 피험자로부터 얻은 샘플과 관련된 모든 연구는 관련 대학 및/또는 의료 시설의 기관 검토 위원회의 승인을 받았으며 샘플을 수집하기 전에 참가자로부터 서면 동의서를 얻었습니다. 동물에서 채취한 샘플과 관련된 모든 연구는 기관 동물 윤리 위원회의 지침에 따라 승인되고 수행되었습니다. 해당되는 경우 환경 샘플링에 대한 승인을 받았습니다.

참고: 문화의 성공은 재료의 품질에 크게 좌우됩니다. 상업용 BSK 배지를 사용할 수 있으며 실험실에서 적응한 순수 B. burgdorferi 및 고용량 접종물을 사용하여 배양물을 파종할 수 있는 관련 종의 성장을 강력하게 지원합니다. 1차 생물학적 물질로부터 균주를 분리하는 경우, 새로 준비된 배지가 선호되며 종종 필요합니다.

Borrelia sp. 알려진 또는 의심되는 병원체이며 선별되지 않은 인간 또는 동물 조직도 생물학적 위험이 될 수 있습니다. 감염 가능성이 있는 물질을 취급하려면 조사자의 안전을 위해 개인 보호 장비와 멸균 기술이 필요합니다. 또한 배지는 영양이 풍부하여 배양물이 쉽게 오염됩니다. 이 작업에는 일반적으로 생물 안전 레벨 2 봉쇄가 필요하며 Borrelia sp. 또는 샘플은 생물학적 안전 캐비닛에서 수행해야 합니다.

1. BSK-II 매체 제작 지침

  1. 완전한 BSK-II 배지의 제조
    1. 표 1과 같이 1 L의 배지를 준비하여 시약을 얻었다.
      참고: BSA 순도(또는 순도 부족)는 최적의 성장에 매우 중요합니다. 특히, BSA 순도는 제조업체와 로트에 따라 다릅니다. 더 많은 제품과 덜 성공적인 제품 목록을 보려면 표 2 를 참조하십시오. 서로 다른 공급업체로부터 여러 샘플을 채취하여 최적의 성장을 위해 테스트한 다음 가장 좋은 로트를 대량으로 구매하는 것이 이 문제를 완화하고 좋은 매체를 생산하는 효과적인 전략입니다.
    2. 물을 저어 비커에 BSA를 녹이는 것으로 시작하면 최소 30분이 소요됩니다.
    3. 모든 건조 화학 물질을 첨가하고 용해시킵니다. 그런 다음 CMRL을 추가합니다.
    4. 필요한 경우 1M NaOH를 사용하여 BSK-II 배지의 pH를 7.6으로 조정합니다.
    5. 토끼 혈청을 BSK-II 배지에 6%-10%의 농도로 첨가합니다. 필터는 BSK-II 배지(0.22μm 공극 크기)를 살균합니다. 필요한 혈청의 양은 Borrelia 종에 따라 다릅니다. RF 종 및 균주에 대해 6%-7%를 사용하고 Borrelia burgdorferi sensu lato에 사용합니다. 성장이 강하지 않으면 배지에 1 % -2 % 멸균 토끼 혈청을 더 첨가하십시오.
    6. BSK-II 배지의 스톡을 100mL 또는 400mL 분취량으로 동결합니다.
    7. RF 균주의 경우 젤라틴이 필요합니다. 100mL의 7% 멸균 젤라틴(용액에 넣기 위해 약간 따뜻하게 함)을 400mL BSK-II 배지에 넣습니다. 배양물을 접종하기 전에 젤라틴을 녹이기 위해 37°C에서 젤라틴으로 BSK-II를 데우십시오.
      참고: 배지는 필터 멸균 및 토끼 혈청 및 젤라틴(RF 스피로헤타용) 또는 필터 멸균 및 혈청(및 젤라틴) 첨가 후 동결(-20°C)할 수 있습니다. 매체는 장시간 동결 될 때 안정적입니다. 냉장고에 보관할 경우 1개월 이내에 사용하십시오. RF 종은 일반적으로 1주일 이상 되지 않은 신선한 배지에서 가장 잘 자랍니다. 얼지 않은 경우 탁도에 대해 매체의 품질을 육안으로 검사하십시오. 오염되거나 침전성 성분 또는 기타 의심스러운 것으로 보이는 매체는 폐기하십시오.
    8. 항생제를 배지에 첨가해야 하는 경우 갓 만든 배지 또는 이전에 냉동된 분취량에 첨가하십시오. 후자가 더 유연한 접근 방식입니다. Oliver et al.39에 설명된 대로 항생제 농도를 사용하십시오.
    9. 배지의 튜브를 해동하는 동안 정밀 저울을 사용하여 멸균(오토클레이브) 1.7mL 튜브 또는 멸균 15mL 원추형 튜브에 항생제의 무게를 잰다. 다음과 같이 저장 용액을 준비하십시오 : 25 mg의 amphotericin B를 10 mL의 DMSO에, 20 mg의 포스 포 마이신을 1 mL의 오토 클레이브 증류수에 용해시키고, 50 mg의 리팜피신을 1 mL의 DMSO에 용해시킨다.
    10. 항생제를 필터로 멸균(0.2μm 주사기 필터)하고 적절한 크기의 새 튜브에 옮깁니다.
    11. 항생제를 배지의 1:1000 비율로 희석하여 최종 농도에 도달합니다. BSK 500mL의 경우 암포테리신 B 원액 0.5mL(DMSO에서 2.5mg/mL), 포스포마이신 원액 0.5mL(멸균 H 2O에서20mg/mL) 및 리팜피신(미국: 리팜핀) 원액(DMSO에서 50mg/mL).
    12. 항생제가 보충된 배지 또는 분취액을 사용하고 -20°C에서 동결합니다.
성분금액(/L)
BSA 분획 V50 그램
CMRL-1066 (10배)100 밀리리터
네오펩톤5 그램
헤페스6 그램
구연산 트리 소듐 염 이수화 물0.7 그램
포도당5 그램
TC 효모2 그램
피루브산(Na 염)0.8 그램
N-아세틸-D-글루코세아민0.4 그램
중탄산 나트륨2.2 그램
물(고순도)900 밀리리터

표 1: BSK-II 배지 1L의 조성.

근원적당
Serva GmbH, 하이델베르크, 독일예
Proliant Biologicals, Boone IA, 미국예
Sigma (Millipore-Sigma & Sigma- Aldrich), 미국 미주리주 세인트루이스아니요

표 2: BSA의 출처 및 BSK-II 배지에 대한 적합성.

2. MKP 제작 지침

  1. 염기성 배지의 제조
    1. 완전히 용해될 때까지 교반하여 표 3에 나열된 모든 분말 성분을 아래 표 4에 조심스럽게 칭량하고 용해합니다.2O(약 750mL) 완전히 용해될 때까지 교반하여 ~1시간이 걸립니다.
    2. 용해 완료 후 NaOH로 pH를 7.6, 부피를 1000 mL로 조절한 후 여과(0.22μm 필터)로 살균한다.
      참고: 기본 배지는 -20°C에서 최대 3개월 동안 보관할 수 있습니다.
  2. MKP 완전배지의 제조
    1. 표 4에 열거된 모든 성분을 멸균 방식으로 혼합하고; 고압 증기 멸균으로 젤라틴을 살균하고 멸균 방식으로 취급하십시오. 멸균 생물학적 안전 캐비닛에서 작업하고 멸균 여과 혈청을 사용하십시오.
    2. 분취량 MKP를 50mL 튜브에 담습니다. 작은 분취량 하나를 33°C에서 며칠 동안 보관한 다음 암시야 현미경으로 오염이 없는지 확인합니다.
      알림: MKP 완전 배지를 +4°C에서 1개월 이상 보관하지 말고 얼리지 마십시오. 완전한 배지는 0.22 μm 필터를 사용하여 여과하여 추가로 멸균할 수 있습니다.
성분금액(/L)
CMRL-1066 (글루타민 없이 10배)100mL(액체인 경우)/분말인 경우 9.7g/L
네오펩톤3 그램
헤페스6 그램
구연산0.7 그램
포도당3 그램
피루브산0.8 그램
N-아세틸글루코세아민0.4 그램
중탄산 나트륨2 그램

표 3: 염기성 MKP(Modified Kelly-Pettenkofer) 배지 1L의 조성.

성분양(mL)
기본 매체500
7 % 젤라틴 (H2O) (갓 고압 증기 멸균되었지만 뜨겁지 않음)100
토끼 혈청36
BSA 35%17.5

표 4: MKP(Modified Kelly-Pettenkofer) 완전 배지의 조성.

3. 항생제 유무에 관계없이 보렐리아의 문화

  1. 생물학적 안전 캐비닛의 멸균 작업 조건에서 모든 실험 단계를 수행합니다. 70% 에탄올로 표면과 모든 물질을 소독하고 즉시 생물학적 안전 캐비닛으로 옮깁니다. UV는 작업 시작 전에 생물학적 안전 캐비닛의 모든 비생물학적 물질을 5분 동안 살균합니다.
  2. 가능한 한 가장 신선한 매체를 사용하십시오.
  3. 배양을 시작하려면 배양기에서 배지(33°C - 37°C)를 예열합니다. 필요한 경우 흔들어 주십시오.
    알림: 매체의 부피에 따라 이 단계는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.
  4. 이전에 -80°C에서 보관하고 액체가 되는 즉시 실온(RT)에서 해동한 글리세롤 또는 이와 유사한 스톡에서 해동된 보 렐리아 배양액 ~1mL를 예열된 BSK 배지 5-15mL에 추가합니다. 스크류 캡이 있는 시중에서 판매되는 유리 또는 플라스틱 바이알을 사용하여 배양액을 소량(BSK 5-15mL)에 접종합니다. 미세 또는 혐기성 분위기를 만들기 위해 튜브를 거의 가득 채웁니다. 튜브를 단단히 닫으십시오. 이러한 방식으로 배양하면CO2 가 필요하지 않습니다.
  5. RF 종(및 B. 페르시카)을 교반 또는 교반 없이 인큐베이터에서 37°C에서 성장시킨다. B. burgdorferi sensu lato 종을 33-34 °C에서 재배합니다.
  6. 200x-400x 배율에서 위상차 또는 암시야 현미경을 사용하여 Borrelia 배양의 성장을 모니터링합니다(그림 3). 세포의 균일한 분포를 보장하기 위해 배양물을 혈청학적 피펫으로 혼합하거나 위아래로 피펫팅하면서 3mL 이송 피펫으로 더 혼합하십시오.
    참고: Borrelia 는 더 높은 배율(200X-400X)에서 가장 잘 보이지만 혈구계40에서 200X 배율에서 가장 잘 셀 수 있습니다. Borrelia 의 움직임과 형태는 이러한 박테리아의 존재를 나타냅니다.
  7. 박테리아 성장을 정량화하려면 혈구계의 양쪽에 있는 면적을 계수하는 16개 필드 그리드 패턴에서 여러(10) 개의 개별 작은 사각형을 계산하고 평균을 계산합니다. 작은 제곱당 평균 세포 수와 mL당 세포 수를 결정하는 데 사용되는 혈구계에 적합한 변환 계수를 곱합니다.
  8. 1-2 일 간격으로 박테리아 성장을 모니터링하십시오. 보렐리아 의 기하급수적 성장은 생존율 및 세포 밀도에 따라 달라지며 34°C에서 1주일 이상 걸릴 수 있습니다. 지수 상 배양을 1:2 또는 1:4의 비율로 희석하여 1.7mL 튜브에 배지를 넣고 혈구계에 로딩합니다. 세포 수를 결정할 때 희석 계수에 대한 적절한 고려를 포함하십시오. 사용 후에는 희석된 표백제(10%) 및/또는 70% 에탄올로 표면과 혈구계를 분무하십시오.
    참고: Borrelia 는 세포 농도가 1-5 x 107 cells/mL일 때 기하급수적으로 성장합니다. 이 범위 내에서 세포가 잘 자랍니다.
  9. 배양 기간이 연장되면 영양소가 고갈되고 배지 pH가 변경되므로 계대배양이 필요합니다. 생물학적 안전 캐비닛의 무균 조건에서 배양 부피의 1/10을 새 튜브에 옮기고 새 배지(이전 계대를 성장시키는 데 사용된 것과 동일한 배지의 신선한 분취량)로 채웁니다. 1:10 희석이 최적입니다. 배양량을 변경해야 하는 경우 그에 따라 접종량을 조정하고 배양을 계속합니다. 각 매체가 바뀔 때마다 통로 수가 증가합니다.
  10. DNA를 추출하거나 Borrelia 세포를 분리하기 위해 지수 위상 Borrelia를 4000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 박테리아를 펠릿화합니다. 상청액을 적절한 생물학적 위험 폐기물에 버리십시오. 펠렛화된 박테리아를 상업용 DNA 추출 키트로 처리하거나 의도한 실험을 위해 적절한 배지에 박테리아를 재현탁합니다.
  11. 각 조작이 끝나면 장비에 맞게 에탄올 및 UV 방사선으로 모든 장비를 멸균하십시오. 과잉 배양액을 포함한 액체 폐기물을 쓰레기통에 수거하고 표백제를 최종 농도 10%까지 첨가합니다. 폐기하기 전에 이 병을 -80°C에 두십시오. 또는 액체 폐기물을 멸균하고 표백제나 알코올 없이 고압증기멸균으로 배양합니다.

4. Borrelia 문화의 장기 보관

  1. Borrelia 배양의 글리세롤 스톡의 제조
    1. ~1.8mL의 지수상 배양액, 세포 농도 ~107-10 8 cells/mL의 분취량을 취하고 멸균 글리세롤을 최종 농도 10%(농도 5%-20% 작업)에 추가합니다.
    2. 2mL 스크류 캡 극저온 바이알에 넣습니다. -80 °C에서 보관하십시오.
    3. 냉동실에 각 균주의 튜브를 10개 이상 보관하십시오.
  2. 영구 보관을 위한 글리세롤 스톡을 생산하기 위한 대체 보관 레시피
    1. 브루셀라 국물에 보렐리아 배양액의 2/3와 15% 글리세롤의 1/3을 섞습니다. 100 mL의ddH2O에 용해된 2.8 g의 브루셀라 액체배지를 사용하고, 멸균여과(0.22 μm)하였다.
    2. 샘플의 글리세롤 스톡을 -70°C 내지 -80°C에서 유지한다.

5. 환경 또는 임상 소스에서 스피로헤타의 분리

참고: 인간, 동물 또는 환경적 출처에서 재료를 분리하는 경우 적절한 경우 연구 윤리, 동물 관리 또는 생태학적 인증을 받아야 합니다.

  1. 딱딱한 진드기에서 Borrelia 의 재배
    1. 성인 여성, 남성 및/또는 애벌레 진드기를 수집합니다.
    2. 모든 진드기 샘플을 70 % 에탄올에 2 분 동안 담그고 생물학적 안전 캐비닛에서 자연 건조하여 표면 멸균합니다. 멸균 메스로 개별적으로 여러 조각으로 해부하십시오. 항생제가 보충된 1.5mL의 배지가 들어 있는 2mL 튜브에 조각을 넣습니다.
    3. 배양물을 34°C에서 배양하고 암시야 또는 위상차 현미경으로 처음 2주 동안 매주 2회, 그 후 6주 동안 매주 스피로체가 있는지 확인합니다(RF 스피로체의 경우 더 자주). 계대 배양 양성 시료를 동일한 배지 5mL에 넣습니다.
      참고: 오염된 배양물은 0.2μm 필터를 사용하여 여과하여 어느 정도 정제할 수 있습니다. 오염을 완전히 해결하기 위해 항생제가 필요할 수 있습니다.
  2. 혈액 샘플에서 Borrelia 재배
    알림: 혈액 샘플은 재료의 출처에 따라 자격을 갖춘 의료, 수의사 또는 연구 전문가가 채취해야 합니다. RT에서 24시간 미만이 경과해야 합니다.amp르
    제거 및 실험실 도착.
    1. 혈액 10mL를 채취하고, 산성 구연산염 포도당(ACD; "노란색 상단") 항응고제로. 실온에서 두십시오. 채혈과 접종 사이에 24시간 미만이 경과하는 것이 좋습니다.
    2. 혈액 세포에서 혈장을 분리하기 위해 200-400 x g 에서 10분 동안 항응고제로 혈액을 원심분리합니다.
    3. 튜브에서 혈장을 부드럽게 제거하고 혈장 1mL를 예열된 MKP 완전 배지 5mL에 접종합니다. MKP는 항생제로 보충 될 수 있습니다. 보렐리알 성장이 감지될 때까지 매일 육안 검사와 매주 암시야 또는 위상차 현미경을 사용하여 33°C에서 배양을 배양하며(RF Borrelia의 경우 더 자주), 최대 9주가 소요될 수 있습니다.
      참고: 더 크거나 더 작은 접종량을 사용하는 경우 접종제와 중간의 비율을 1:5로 유지하십시오. 전혈보다는 혈청이나 혈장을 사용하십시오.
  3. 피부 생검에서 Borrelia 의 재배
    1. 피부 생검을 표면 멸균합니다(이상적으로는 3mm x 3mm x 3mm 큐브, 즉 70% 에탄올과 과산화수소 사용). 생검 샘플을 생리 식염수에 넣습니다.
      알림: 생검 샘플은 재료의 출처에 따라 자격을 갖춘 의료, 수의사 또는 연구 전문가가 채취해야 합니다. RT에서 24시간 미만이 경과해야 합니다.ample 제거와 실험실 도착 사이.
    2. 생리 식염수에 담그는 동안 멸균 유리 페트리 접시에 멸균 면도날을 사용하여 샘플을 2-6개의 작은 조각으로 깍둑썰기합니다. 피부 생검을 보관한 모든 샘플과 생리식염수 ~1mL를 항생제가 보충된 예열 배지 5mL에 옮기고 33°C에서 배양합니다.
    3. 오염 박테리아가 과도하게 증식하는 경우 위의 1.1.10 단계에서와 같이 항생제를 추가하거나 설파메톡사졸(23.75mg, 최종 농도 5mg/mL) + 트리메토프림(1.25mg, 0.25mg/mL) 또는 박트림(최소 억제 농도>128μg/mL), 아미카신 2정(2 x 30μg, 최종 농도 12μg/mL), 및 포스포마이신 2정(2 x 200μg, 최종 농도 80μg/mL).
      참고: 모든 경우에 배양이 시도되고 있는 Borrelia 종에 대한 항생제의 최소 억제 농도 미만으로 유지해야 합니다41,42,43.
    4. 배양액이 Borrelia에 양성인 경우 추가로 3-4일 동안 또는 4X 대물렌즈를 사용하여 현미경 필드에서 Borrelia의 양이 10+ 스피로헤타에 도달할 때까지 배양을 유지합니다. 영구 저장을 위해 글리세롤 스톡을 만듭니다.

6. 고체 배지에서 배양하여 액체 배양에서 B. burgdorferi sensu lato spirochetes 및 B. miyamotoi의 단일 클론 개체군 분리

  1. 플레이트를 만들기 위해 300mL의 1.5X MKP 완전 배지(젤라틴 제외)를 따뜻하게 합니다. 또한, 200 mL의 1.7% 아가로오스 (탈이온수 중 오토클레이브, RT에서 저장하고, 사용 전에 마이크로웨이브)를 55°C로 보온한다. 두 액체를 섞는다.
  2. 이 혼합물 15 mL를 각각 16개의 깊은 페트리 접시에 넣어 바닥 한천 오세층을 만든다.
  3. 나머지 배지를 수조에서 55°C로 유지한다.
    참고: Borrelia 는 상단 아가로스 층에 혼합됩니다.
  4. 먼저, 혈구계를 사용하여 Borrelia 배양 밀도를 정량화하고 액체 배지에서 원하는 밀도로 희석합니다.
    참고: 플레이트당 500, 200, 100 및 50개의 스피로체가 잘 작동합니다.
  5. 바닥 플레이트가 고형화 된 후, 나머지 아가로스 혼합물 10 mL를 적절한 수의 스피로 체가 들어있는 15 mL 튜브에 첨가한다.
  6. 라벨이 붙은 페트리 접시의 바닥 아가로스에 현탁액을 붓습니다.
    알림: Borrelia spirochetes는 고온에 민감하기 때문에 박테리아가 장기간 55°C에 노출되지 않도록 주의해야 합니다. 배지의 박테리아 세포에 첨가하자마자 상단 한천을 붓습니다.
  7. 플레이트가 완전히 고형화 된 후, 페트리 접시를 닫고 2.5 %CO2에서 34-35 °C에서 거꾸로 놓습니다.
    참고: 절차가 성공하면 도금 후 1주일 후에 콜로니가 나타납니다.
  8. 개별 콜로니를 스크리닝하고 확장하려면 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 멸균된 2mL 배양 튜브에 있는 1.5mL의 변형된 액체 MKP 또는 기타 적절한 배지에 넣습니다.
  9. 배양물을 34°C에서 배양하고 암시야 또는 위상 현미경으로 스피로헤타를 검사합니다. 위에서 설명한 대로 만들어진 분석 또는 주식을 위해 이러한 배양물을 사용하십시오.

결과

Borrelia 배양 배지 BSK 및 MKP 및 변종은 순차적으로 준비하고 멸균해야 하는 성분이 포함된 풍부한 배양 배지입니다. 올바르게 준비되면 BSK 배지는 빨간색-주황색이고 투명해야 합니다(그림 1). 온난화 후에도 지속되는 탁도와 강수량은 문제가있는 성분, 중간 생산 또는 오염을 나타냅니다. 이러한 매체는 폐기하는 것이 가장 좋습니다. 젤라틴이 BSK와 MKP에 첨가되면 냉장...

토론

박테리아의 실험실 배양은 연구의 발판입니다. 배양 능력에 의해 부여되는 심오한 이점은 매독의 병인인 스피로헤타인 Treponema pallidum을 배양하기 위한100년 이상의 투쟁에서 예시됩니다 44. Borrelia spirochetes도 문화에 도전하지만 문화는 가능합니다 23,24,34,44,45,46,47,48,49.

공개

이해 상충은 선언되지 않았습니다.

감사의 말

이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회와 캐나다 라임병 재단(AB 및 VL), 스웨덴 연구 위원회(SB, M-LF 및 IN), TAČR GAMA 2 프로젝트 - "생물학 센터 CAS에서 응용 가능성 검증 2.0 지원"(TP01010022)(MG 및 NR) 및 체코 보건부 NV19-05-00191(MG 및 NR)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다. 그림 4의 이미지에 대해 S. Vranjes(2021, Rudenko lab)에게, 그림 5의 이미지에 대해 J. Thomas-Ebbett(2021, Lloyd lab)에게 감사드립니다. 이 분야에 기여한 모든 연구자들에게 감사드리며, 지면의 제약으로 인해 인용하지 못한 분들께 사과드립니다.

자료

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0.2 µm Sterile syringe filter VWR28145-501Standard item - any supplier will do
10 µL barrier pipette tipNeptuneBT10XLS3Standard item - any supplier will do
10 mL Serological pipettes Celltreat229011BStandard item - any supplier will do
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15 mL tubeCelltreat188261Standard item - any supplier will do
20 µL barrier pipette tipNeptuneBT20Standard item - any supplier will do
20 mL Sterile syringe BD309661Standard item - any supplier will do
200 µL barrier pipette tipNeptuneBT200Standard item - any supplier will do
25 mL Screw Cap Culture TubesFisher Scientific14-933CStandard item - any supplier will do
25 mL Serological pipettesCelltreat229025BStandard item - any supplier will do
3 mL Sterile syringeBD309657Standard item - any supplier will do
35% BSA SigmaA-7409Source is important - see note
5 mL Serological pipettes Celltreat229006BStandard item - any supplier will do
50 mL tubeCelltreat229421Standard item - any supplier will do
6.5 ml MKP glass tubes SchottSchott Nr. 26 135 115Standard item - any supplier will do
AmikacineSigmaPHR1654Standard item - any supplier will do
Amphotericin BSigmaA9528-100MGStandard item - any supplier will do
Bactrim/rimethoprim/sulfamethoxazoleSigmaPHR1126-1GStandard item - any supplier will do
BBL Brucella broth BD211088Standard item - any supplier will do
Biosafety CabinetLabconco302419100Standard item - any supplier will do
Blood collection tubes (yellow top - ACD)Fisher ScientificBD Vacutainer Glass Blood Collection Tubes with Acid Citrate Dextrose (ACD)Standard item - any supplier will do
BSK-H Medium [w 6% Rabbit serum] Darlynn biologicalsBB83-500Standard item - any supplier will do
centrifuge Eppendorfmodel 5430Standard item - any supplier will do
Citric acid TrisodiumSaltDihydrateSigmaC-8532 100 gStandard item - any supplier will do
CMRLGibco BRL21540 500 mLStandard item - any supplier will do
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Cryogenic Tubes (Nalgene)Fisher Scientific5000-0020Standard item - any supplier will do
Deep Petri with stacking ring 100 mm × 25 mmSigmaP7741Standard item - any supplier will do
Digital IncubatorVWRmodel 1545Standard item - any supplier will do
DMSOThermoFisherD12345Standard item - any supplier will do
Filters for filter sterilizationMillipore 0.22μm GPExpressPLUS MembraneSCGPU05REStandard item - any supplier will do
GelatinDifco BD214340 500 gStandard item - any supplier will do
Glass Culture TubesFisher Scientific99449-20Standard item - any supplier will do
GlucoseSigmaG-7021 1 kgStandard item - any supplier will do
GlycerolSigmaG5516Standard item - any supplier will do
Hemafuge (Hematocrit & Immuno hematology centrifuge )LabwissenModel 3220Standard item - any supplier will do
HEPESSigma H-3784 100 gStandard item - any supplier will do
N-acetylglucoseamineSigma A-3286 25 gStandard item - any supplier will do
NeopeptoneDifco  BD211681 500 gStandard item - any supplier will do
Neubauer HematocytometerSigma Z359629Standard item - any supplier will do
Phase contrast microscope LeitzStandard item - any supplier will do
PhosphomycinSigmaP5396-1GStandard item - any supplier will do
PhosphomycineSigmaP5396Standard item - any supplier will do
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Pyruvic acid (Na salt)SigmaP-8574 25 gStandard item - any supplier will do
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TrimethoprimSigmaPHR1056Standard item - any supplier will do

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