土壌密度分別による異なる土壌炭素プールの分離

要約

土壌密度分別は、土壌有機物を安定化メカニズム、化学的性質、および回転時間が異なる異なるプールに分離します。特定の密度を有するポリタングステン酸ナトリウム溶液は、遊離粒子状有機物と鉱物関連有機物の分離を可能にし、管理および気候変動に対する土壌応答を記述するのに適した有機物画分をもたらす。

要約

土壌有機物(SOM)は、遊離の部分的に分解された植物成分から、土壌凝集体に保持されているより微生物的に変化した化合物、反応性土壌ミネラルと強い関連を持つ高度に処理された微生物副産物まで、さまざまな化合物の複雑な混合物です。土壌科学者は、土壌を簡単に測定でき、土壌炭素(C)モデリングに役立つ画分に土壌を分離する方法を見つけるのに苦労してきました。密度に基づいて土壌を分画することがますます使用されており、SOMと異なる鉱物との関連性の程度に基づいて実行が容易でCプールが得られます。したがって、土壌密度分別は、SOMの特性評価とSOM安定化メカニズムの特定に役立ちます。ただし、報告されている土壌密度分別プロトコルは大きく異なり、さまざまな研究や生態系の結果を比較することは困難です。ここでは、粒子状有機物と鉱物関連有機物を分離する堅牢な密度分別手順について説明し、土壌を2つ、3つ、またはそれ以上の密度画分に分離することの利点と欠点について説明します。そのような画分は、それらの化学的およびミネラル組成、代謝回転時間、ならびに微生物処理の程度、ならびにミネラル安定化の程度においてしばしば異なる。

概要

土壌は陸生炭素(C)の最大の貯蔵庫であり、上部1mに1,500Pg以上のCを含み、世界のより深いレベルではそのほぼ2倍の量であるため、土壌には植物バイオマスと大気を合わせたよりも多くのCが含まれていることを意味します¹。土壌有機物(SOM)は、水と土壌栄養素を保持し、植物の生産性と陸域生態系の機能に不可欠です。土壌の健康と農業生産性にとって適切なSOMストックの重要性が世界的に認識されているにもかかわらず、持続不可能な森林と農業の管理、景観の変化、気候温暖化により、土壌Cストックが大幅に枯渇しています^2,3。土壌の健康を回復し、自然気候ソリューションの主要なプレーヤーとして土壌Cの保持を使用することへの関心の高まりは、多様な環境における土壌Cの隔離と安定化を制御する要因を理解するための努力につながりました^4,5。

土壌有機物(SOM)は、遊離の部分的に分解された植物成分から、土壌凝集体に保持されるより微生物的に変化した化合物(ここでは、別々のユニットまたはアイテムの組み合わせによって形成される材料として定義)から、反応性土壌ミネラルと強い関連を持つ高度に処理された微生物副産物までの範囲に及ぶさまざまな化合物の複雑な混合物です⁶.SOM内の個々の化合物の完全なスイートを特定することが現実的でない場合、研究者はしばしば、物理的現実として存在し、回転率、一般的な化学組成、および土壌のミネラル成分による安定化の程度によって異なるCの少数の機能プールを特定することに焦点を当てます^1、7.プールを批判的に解釈しモデル化するためには、分離されたプールの数が少なく、理論的なものではなく直接測定可能であり、組成と反応性に明確な違いを示すことが不可欠です⁸。

土壌Cの意味のあるプールを分離するために、化学的および物理的の両方の多くの異なる技術が採用されており、これらはvon Lützow et ^al.9およびPoeplau et ^al.10によってよく要約されています。化学的抽出技術は、結晶性の低いFeおよび^Al11のいずれかに関連するCなどの特定のプールを単離することを目的としています。有機溶媒は、脂質¹²などの特定の化合物を抽出するために使用されており、SOMの加水分解または酸化のいずれかが^C13,14の不安定なプールの尺度として使用されてきた。ただし、これらの抽出方法のいずれも、Cのすべてのプールを測定可能またはモデル化可能な画分に分類しません。土壌の物理的分別は、すべての土壌Cをサイズに基づいてプールに分類し、植物の破片の分解が断片化とますます小さな粒子をもたらすと仮定します。サイズだけでは、鉱物関連のSOM¹⁵から遊離植物の残骸を分離することはできませんが、これら2つのプールを定量化することは、形成と代謝回転における共通の空間的、物理的、および生物地球化学的違いによる土壌C安定化を理解するために重要です¹⁶。

密度に基づく土壌Cの分画はますます使用されており、実行が容易であり、異なる鉱物との関連度に基づいてCの異なるプールを識別する17,18,19;したがって、土壌密度分画は、異なる土壌C安定化メカニズムの解明に役立ちます。分別される土壌の主な要件は、有機物と鉱物粒子を完全に分散させる能力です。分散すると、ミネラルを比較的含まない分解有機物は~1.85 g / cm 3より軽い溶液に浮遊しますが、ミネラルは通常2〜4.5 g / cm 3の範囲になりますが、酸化鉄の密度は最大5.3 g / cm³です。軽いまたは遊離粒子画分は、ターンオーバー時間が短くなる傾向があり(木炭による重大な汚染がない限り)、栽培やその他の障害に非常に敏感であることが示されています。重い(>1.85 g / cm³)またはミネラル関連画分は、有機分子が反応性鉱物表面と結合するときに得られる微生物媒介分解に対する耐性のために、ターンオーバー時間が長くなることがよくあります。しかしながら、重質画分は飽和する(すなわち、ミネラル錯化能力の上限に達する)可能性があるが、軽質画分は理論的にはほぼ無期限に蓄積することができる。したがって、鉱物関連有機物と粒子状有機物のプール内の有機物の物理的分布を理解することは、効率的な炭素隔離のためにどの生態系を管理できるか、そしてさまざまなシステムが気候変動と人為的撹乱の変化パターンにどのように反応するかを解明するのに役立ちます²⁰。

過去10年間で、さまざまな密度のポリタングステン酸ナトリウム溶液を使用した密度分画の使用が大幅に増加しましたが、技術とプロトコルは大きく異なり、さまざまな研究やさまざまな生態系の結果を比較するのは困難です。1.85 g / cm 3の密度は、ミネラル関連有機物(MAOM)¹⁷の包含を最小限に抑えて最大量の自由光画分を回収することが示されていますが、多くの研究では1.65〜2.0 g / cm³の範囲の密度を使用しています。ほとんどの研究では、土壌を2つのプール(軽フラクションとヘビーフラクション、以下LFとHF)に分画していますが、他の研究では、複数の密度を使用して、関連するミネラル、ミネラルと有機コーティングの相対比率、または凝集の程度(たとえば、 Sollins et al.17, Sollins et ^al.18, Hatton et al.21, Lajtha et al.22, Yeasmin et al.23, Wagai et al.24, Volk et ^al.25)。さらに、サイズと密度の両方の分離を組み合わせたより複雑な分画手順が提案されており、その結果、プールの数が多くなりますが(例:Yonekura et al.26、Virto et ^al.27、Moni et al.15、Poeplau et ^al.10)、方法論とプールサイズの両方においてエラーの余地も大きくなります。さらに、著者らはまた、鉱物表面から凝集体およびMAOMを分散させるために、様々な強度および時間で超音波処理を使用した^28,29,30。

ここでは、最初に土壌炭素の2つのユニークなプール(LFとHF、またはPOMとMAOM)を特定する堅牢な密度分別手順について説明し、HFプールをさらに鉱物学、有機コーティングの程度、または凝集に基づいて異なる追加の画分に分離するための技術と議論の両方を提供します。ここで同定された画分は、それらの化学組成、回転時間、微生物処理の程度、およびミネラル安定化の程度において異なることが示されている^18,19。

次の手順では、特定の密度の溶液に既知量の土壌を混合することにより、バルク土壌を粒子状有機物(POM)と鉱物関連有機物(MAOM)に分離します。手順の有効性は、初期土壌サンプル質量およびC含有量に対する土壌質量および炭素の複合回収によって測定される。ポリタングステン酸ナトリウム(SPT)を脱イオン水に溶解することにより、高密度溶液が得られます。土壌は最初に高密度SPT溶液と混合され、攪拌されて土壌凝集体を完全に混合および分散させる。次に、遠心分離を使用して、溶液中に浮遊(軽フラクション)または沈む(重いフラクション)のいずれかの土壌材料を分離します。混合、分離、回収、および洗浄のステップが複数回繰り返され、材料からのSPTの除去とともに、軽質画分と重質画分の分離が保証されます。最後に、土壌画分を乾燥させ、秤量し、C含有量について分析します。分画された材料は、後続の手順および分析に使用できます。

プロトコル

1.ポリタングステン酸ナトリウム(SPT)の原液を作る

注意: SPTは刺激物であり、飲み込んだり吸入したりすると有害です。それは水生生物に有毒です。環境への放出を避けてください。

1. 密度1.85 g/^cm3のSPT溶液1 Lを作るには、結晶化SPT1,051 gを約600 mLの脱イオン蒸留(DDI)水に溶解します。SPTが完全に溶解するまで溶液を約15分間攪拌し、次にDDIで溶液容量を1 Lにします。
   注:溶液密度<1.85 g / cm³を使用した炭素回収は、粒子状有機物^17,18に由来する軽質分率炭素を募集し、サンプル中の炭素量を誤って表す可能性があります。したがって、典型的な土壌サンプル(すなわち、C含有量<10%)のほとんどの砂、シルト、および粘土ロームの粒子状有機物に関連する炭素をより包括的にするために、1.85 g / cm³のSPT溶液密度^{が提案されます8,17}。
2. 密度2.40 g/cm3のSPT溶液1 Lを作るには、固体SPT1,803 gを約500 mLのDDI水に溶解します。SPTが完全に溶解するまで溶液を攪拌し、DDIで溶液容量を1 Lにします。
   注:土壌分画の潜在的な用途を超えて、プロトコルの後のステップでSPT溶液を調整するために、密度が1.85 g / cm 3を超える溶液が必要になることがよくあります(ステップ^3.2を参照)。余分な2.40 g / cm 3溶液が残っている場合は、溶液を脱イオン水で1.85 g / cm³に希釈し、土壌分別に使用できます。
3. 分画に使用する前に、CおよびN含有量についてSPTを分析します。固体または液体の元素分析装置を使用してこの分析を実行します(方法例:ISO 10694:1995、ISO 20236:2018)。
   1. 液体元素分析装置に対してステップ1.1の溶液を1:100希釈して、元素スクラバーと触媒の劣化を減らします。SPT溶液中のCおよびN汚染に対する耐性は、サンプルおよびその後の土壌画分の使用に依存する。典型的には、CおよびN含有量<それぞれ1ppmおよび<0.1ppmのSPT溶液は、このような溶液がはるかに大きな土壌CおよびNプールを変更するための最小容量を提示するため、使用に適していると考えられる。

2. SPT中の土壌の溶解

1. 風乾し、2 mmにふるいにかけた土壌50 gを250 mLの円錐形ポリプロピレン遠心チューブに加えます。質量を少なくとも4つの有効数字に記録します。オーブン乾燥土壌は、熱誘起細胞溶解³¹により可溶性炭素を増加させる可能性があるため使用しないでください。
   注:圃場湿潤土壌³¹を使用することができるが、SPT溶液の目標密度を維持するために、後のステップでさらなる調整が必要である。岩や木質の破片など、分別結果を歪める可能性のある大きな材料を除去するために、土壌材料を2mmにふるいにかけることをお勧めします。
   1. 定量化の重大な誤差を避けるために、各画分の適切な質量が回収されるように土壌質量を調整します。質量調整の最も一般的な理由は、POM含有量が低いことです(たとえば、総土壌質量の<2%)。このような土壌については、POM回収率を正確に定量化するために、追加の土壌質量を提供します。全体として、サンプル質量を変更してもPOMとMAOMの比率は変更されないため、個々のサンプルごとに土壌質量を調整することは許容されます。ただし、遠心分離機のバランスをとるために、一貫した質量を使用することがしばしば有用です。
   2. 分別前に炭酸塩が豊富な土壌を処理して無機炭酸塩を除去します³²。
2. 50 mLの1.85 g / cm³ 密度SPTを遠沈管に加え、蓋をしっかりと元に戻します。土壌量と同様に、必要に応じてSPT量を調整します。POMが豊富な表層土壌(例えば、多くの温帯森林土壌)では、土壌とSPTの比率を大きく(例えば、30 gの土壌と60 mLのSPT)使用して、軽質画分と重質画分の材料を適切に分離します。
3. チューブを手で~60秒間激しく振って、水に安定しない凝集体を分解します。土壌凝集体と遠沈管の側壁との力強い衝突が望まれ、単に溶液をボルテックスするだけでは不十分である可能性がある。
4. チューブをプラットフォームシェーカーに固定します。多くの場合、チューブを横に配置すると、溶液のスロッシング力が増加し、土壌層の立位高さが低下するため、土壌の分散に役立ちます。チューブがしっかりと密閉されているように注意し、40〜120 rpmで2時間振とうします。定期的にシェーカーからチューブを取り外し、手で激しく振って、より密度の高い凝集材料の攪拌を増やします。

3.粗い土壌分別を行う

1. シェーカーからチューブを取り外します。SPT溶液を慎重に追加して遠心分離管の質量を均等にし、遠心分離するチューブのセット全体で一貫した質量に到達し、SPT溶液を追加した後、30秒間手で激しく振とうします。スイングバケット遠心分離機で3,000 x g で10分間遠心分離します。
2. サンプルを吸引する前に、ピペットで5 mLの溶液を引き出し、天秤で質量を確認して、上清の密度をテストします。必要に応じてSPT密度を調整して、目的の密度を実現します。溶液密度調整が行われた場合は、もう一度振とうして遠心分離します。
3. 1Lのサイドアームフラスコを真空ポンプに取り付けます。110 mmのガラス繊維フィルター(0.7 μmの孔径)を12 cmの磁器ブフナー漏斗に入れます。円錐形のゴム製ガスケットを使用して漏斗をサイドアームフラスコに慎重に密封します。
   注意: ガラス繊維フィルターは、150°Cの乾燥オーブンで事前に洗浄し、使用前にDDIですすいでください。
4. 真空に取り付けられた追加の1Lサイドアームフラスコを1つセットアップします。フラスコの上部にゴム栓を置き、吸引用に~0.5mの突き出た長さのチューブを取り付けます。
   注意: 吸引中の吸引の制御を改善するために、プラスチックチップ(端が斜めにクリップオフされた5mLの使い捨てピペットチップなど)を吸引チューブの端に取り付けると便利な場合があります( 図1を参照)。
5. 遠心管の側面に沿って溶液の最上層に沈殿した上澄み液と懸濁物質を穏やかに吸引し、吸引管の先端を下のペレット状の土壌表面に触れないように注意します。
   注意: 土壌ペレット材料(重い画分)が懸濁(軽い分画)材料と一緒に誤って吸引された場合は、分画手順を繰り返す必要があります。気づかない場合、そのような誤差は、予想よりも重い軽分率の質量をもたらし、C含有量は予想よりも低く、これは同様の土壌特性を持つサンプルのデータ分析によって明らかになる可能性があります。
   1. サンプル間の吸引チューブを洗浄するには、チューブの先端をDDI水にすばやく(たとえば、0.1秒間沈めます)、真空ポンプをオンにしてラインに~5 mLのDDI水を吸い込みます。すべての材料が真空管から洗い流されるまで繰り返します。
   2. サイドアームフラスコからゴム栓と吸引チューブアタッチメントを取り外し、真空ポンプをオンにして内容物をブフナー漏斗の上部に注ぎます。
   3. フラスコをDDI水ですすぎ、渦巻き、フラスコの内容物をブフナー漏斗に注ぎます。フラスコの側面に付着した残留物がすべて除去されるまで繰り返します。
6. 50 mLのSPTを遠沈管に加え、手で60秒間激しく振とうし(土壌が急速に分散しない場合はシェーカーテーブルを使用)、チューブの底にある硬いペレットを分解して、すべての残留物が再懸濁されるようにします。3,000 x gで10分間遠心分離します。
7. 手順 3.5 を繰り返します。フラスコの内容物をステップ3.5.2で使用したのと同じブフナー漏斗に注ぎます。
8. 遠心分離管に50 mLのSPTを加え、手で激しく振って、チューブの底にある硬いペレットを確実に砕きます。3,000 x gで10分間遠心分離します。
9. 手順 3.5 を繰り返します。フラスコの内容物をステップ3.5.2で使用したのと同じブフナー漏斗に注ぎます。

4. 高密度SPTを用いた密度分離の追加

注:複数の追加の密度分画を実行する場合は、後続の分画を密度の高い順に実行する必要があります。ここでは、1.85-2.4 g / cm 3および>2.4 g / cm³密度SPTを使用して単離する手順を示します。

1. ステップ3の>1.85 g / cm 3土壌材料を含む遠沈管に50 mLの2.4 g / cm³ SPTを追加します。手で激しく振って(>60秒)、チューブの底にある硬いペレットを必ず砕きます。3,000 x gで10分間遠心分離します。
2. サンプルを吸引する前に、ピペットで5 mLの溶液を引き出し、天秤で質量を確認して、上清の密度をテストします。必要に応じてSPT密度を調整して、目的の密度を実現します。溶液密度調整が行われた場合は、もう一度振とうして遠心分離します。
3. 前に使用した1.85 g / cm 3 SPT溶液の代わりに、2.4 g / cm³ SPT溶液を使用して手順3を繰り返します。ステップ3の終わりに、ブフナー漏斗で分離された材料の密度は1.85〜2.4 g / cm 3になり、遠心分離管に残っている材料の密度は>2.4 g / cm³になります。

5.重質および軽質画分サンプルからのSPTの洗浄

注意: 分別されたすべての材料に対して、次の洗浄手順を実行する必要があります。SPT溶液が材料から完全に洗い流されていない場合、対応する分数の重みは不正確になります。

1. 重質画分材料を入れた50 mLのDDI水を遠沈管に加え、手で激しく振って(60秒)、チューブの底にある硬いペレットを砕くようにします。3,000 x gで10分間遠心分離します。
2. ステップ3.5のように吸引します。この時点で、すべての軽質分画材料が除去されているはずです。透明な吸引剤は、フィルター漏斗に追加するのではなく、廃棄物バケツに廃棄してください。
3. 手順5.1〜5.2を2回繰り返します。最終的にチューブ内の溶液を吸引する前に、トランスファーピペットを使用して25 mLの上清を引き出し、溶液の重量を体積で割って密度を確認し、SPTがサンプルから適切に除去されていることを確認します。密度が<1.01 g/mLの場合は、次の手順に進みます。密度が1.01 g / mL以上の場合は、密度が1.01 g / mL未満になるまで、上記のように追加の水洗浄を実行します。
4. 軽質画分からSPTを完全に除去するには、各ブフナー漏斗にDDI水を満たし、ガラス繊維フィルターで内容物をろ過します。水が完全にろ過されたら、これをさらに2回繰り返します。土壌の有機物が多い場合、ろ過には最大48時間かかる場合があります。

6.重質分率材料の収集

1. 遠心分離管から汚れを慎重にこすり落とし、清潔でラベルの付いたガラスビーカーまたはジャーに入れます。残りの土壌を緩めるのに十分なDDI水をチューブに注ぎます。キャップを元に戻して振ってから、スラリーをガラス容器に加えます。遠沈管から残っている汚れをすべて洗い流し、脱イオン水を使用してガラス容器に移します。
2. ガラス容器を40〜60°Cに設定された乾燥オーブンに入れます。 一定の乾燥重量に達するまで、通常は24〜72時間乾燥させます。

7.軽質分率材料の収集

1. 真空ポンプの電源を切り、サイドアームフラスコから漏斗を取り外します。漏斗をラベルの付いたガラスビーカーまたはジャーの上に水平に保持し、DDI水洗浄ボトルを使用してフィルターから粒子をそっと洗い流します。
   注意: スパチュラを使用してフィルターをそっとこすり、フィルターの両側をすすぎ、すべての残留物を取り除く必要がある場合があります。
2. ガラス容器を40〜60°Cに設定された乾燥オーブンに入れます。 一定の乾燥重量に達するまで、通常は24〜72時間乾燥させます。

8.分別された材料の乾燥質量を計量する

1. 各容器から乾燥した材料をすべてプラスチック製の計量ボートにそっとこすり落とします。小数点以下4桁までの質量を記録します。サンプルをラベル付きの保存バイアルまたはバッグに入れます。
2. すべての乾燥サンプルについて繰り返します。

9. 全有機炭素のデータ収集と分析

1. 元素C含有量の分析に使用する機器(ISO 10694:1995など)に従って分析手順に従ってください。
   注:乾燥した画分材料を微粉末に粉砕することは、元素分析の前に分画されたサンプルの均一性を確保するための一般的な方法です。
2. すべてのフラクションの累積質量が、元の土壌サンプル質量の少なくとも~90%に等しいことを確認してください。材料の損失が>10%の場合は、追加の反復分画をお勧めします。
3. フラクション中の土壌有機炭素(SOC)の累積回収率を定量化します。SOCの損失は、フラクション材料の不均衡な損失および溶存有機炭素の損失による質量損失と完全に相関しない場合があります。それでも、SOCの損失も土壌サンプルの初期SOCの<10%である必要があります。

結果

土壌密度分画は、土壌の粒子状および鉱物関連有機物含有量の違いを調査するのに理想的です。SOCをこれら2つの異なるプールに分離することで、バルク土壌C含有量の傾向を観察すると不明瞭な土壌C含有量の変化と安定化ダイナミクスを解明する手段が提供されます。重い材料(密度>1.85 g / cm³)をさらに分離すると、土壌Cの安定化の変化と傾向に関する追加の洞察が得られますが、手?...

ディスカッション

土壌密度分画プロトコル全体を通して、土壌画分の分離と分析のエラーを減らすために綿密に監視しなければならないいくつかの特定の手順があります。土壌密度分画手順の重要なステップは、SPT溶液の密度を繰り返し検証することです。土壌サンプル中の水分はSPT溶液を希釈することが多く、SPTの密度が低下します。したがって、研究者は、遠心分離後に軽溶液と重溶液の完全な分離が達?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator/vacuum tubing 1/4 x 1/2"	Kimble	10847-216
Conical polypropylene centrifuge tube, 250mL	Thermo Scientific	376814
Conical rubber gasket for filtering flasks	DWK Life Sciences	292020001
Double flat ended stainless steel spatula/scraper	Fisher Scientific	14-373-25A
Glass fiber filter, grade GF/F, 110 mm	Whatman	WHA1825110
Glass mason jar, 16 oz	Ball Corporation		500 ml beaker or glass weigh dish are also suitable
Polypropylene conical bottle adapter, 250mL	Beckman Coulter	369385
Porcelain buchner funnel, 90mm	FisherBrand	FB966F
Reciprocating shaker, 2-speed	Eberbach	E6000.00
Sidearm flask, 1000mL	VWR	89000-386
Sodium Polytungstate, crystalline	Sometu	SPT-0 or SPT-1, see Discussion for SPT choice	Shipping via FedEx from Germany
Swinging bucket centrifuge	Beckman Coulter	3362020