ショウジョウバエメラノガスターを用いた揮発性物質のハイスループット調査のための連続麻酔アレイ

要約

ショウジョウバエ(ショウジョウバエメラノガスター)は、生物学的および毒物学的研究に広く使用されています。ハエの有用性を拡大するために、複数のハエサンプルを同時に揮発性全身麻酔薬(VGA)にさらす装置、シリアル麻酔アレイを開発し、VGAの付随的影響(毒性と保護性)を調査できるようにしました。

要約

揮発性全身麻酔薬(VGA)は、世界中のあらゆる年齢や病状の何百万人もの人々に使用されています。高濃度のVGA(数百マイクロモルから低ミリモル)は、観察者に「麻酔」として提示する脳機能の深遠で非生理学的な抑制を達成するために必要です。そのような高濃度の親油性物質によって引き起こされる付随的効果の全範囲は知られていないが、それらの生物学的意義は理解されていないが、免疫炎症系との相互作用が注目されている。

動物におけるVGAの生物学的影響を調べるために、ショウジョウバエ(ショウジョウバエメラノガスター)が提供する実験上の利点を活用するために、シリアル麻酔アレイ(SAA)と呼ばれるシステムを開発しました。SAAは、直列に配置され、共通の流入に接続された8つのチャンバーで構成されています。一部の部品はラボで入手でき、他の部品は簡単に製造または購入できます。VGAの校正された投与に必要な気化器は、市販されている唯一のコンポーネントです。VGAは、バルク(通常95%以上)がキャリアガスであるため、運転中にSAAを流れる大気のごく一部にすぎません。デフォルトの運送業者は航空です。ただし、酸素やその他のガスは調査できます。

従来のシステムに対するSAAの主な利点は、複数のハエのコホートを正確に滴定可能な量のVGAに同時に曝露できることです。VGAの濃度は、すべてのチャンバーで数分以内に達成されるため、区別できない実験条件が得られます。各チャンバーには、単一のハエから数百のハエを含めることができます。例えば、SAAは、8つの異なる遺伝子型、または異なる生物学的変数(男性対女性、老人と若年者など)を持つ4つの遺伝子型を同時に調べることができます。SAAを使用して、神経炎症-ミトコンドリア変異体と外傷性脳損傷(TBI)に関連する2つの実験的ハエモデルでVGAの薬力学とその薬理遺伝学的相互作用を調査しました。

概要

側副麻酔効果(すなわち、すぐには観察できないが行動上の結果を遅らせる可能性のある効果)の存在は一般に受け入れられているが、それらのメカニズムと危険因子の理解は初歩的なままである^1,2。それらの遅延した発現と微妙さは、合理的な時間枠内で許容可能なコストで哺乳類モデルで調査できる潜在的に重要な変数の数を制限します。ショウジョウバエ(ショウジョウバエメラノガスター)は、神経変性疾患³および毒物学的スクリーニング⁴の文脈において、これまで麻酔薬の副次的効果の研究に適用されていない独自の利点を提供します。

私たちは、麻酔薬力学と薬理遺伝学の研究におけるショウジョウバエの使用を容易にするために、連続麻酔アレイ(SAA)を開発しました。SAAの主な利点は、複数のコホートの同一の実験条件に同時にばく露できることです。ショウジョウバエの実験の柔軟性と組み合わせると、SAAのハイスループットにより、哺乳類モデルでは不可能な規模での生物学的および環境変数の探索が可能になります。

原則として、SAAは、キャリアガスが揮発性物質を送達する一連の接続された麻酔場所(50mLバイアルで作られたチャンバー)です。システムの最初のチャンバーには、キャリアガスが加湿される蒸留水が含まれており(ハエは脱水に敏感です)、システムを通るガスの流れを示す単純な流量インジケータで終了します。接続チューブの開口部に配置された細かいネットは、チャンバー間のハエの移動を防ぐためにチャンバーを分離します。「直列」の場所の数は、加圧されていないガスの流れ(チューブ、ネット)に対する抵抗によって制限されます。

このSAAプロトタイプの動力学は、以前の出版物⁵で特徴付けられました。正確な薬物動態特性はSAAによって異なりますが、実験的にテストされた関連する基本は次のとおりです:(i)1.5〜2 L / minの初期流量は、すべてのチャンバー(総容量±550 mL)を2分以内に所望の麻酔薬濃度で平衡化します。(ii)チャンバーに送達される麻酔薬蒸気の濃度は、個々のチャンバー内のガスの量(50mL)に含まれる麻酔薬の量が任意の数のハエが吸収する量をはるかに超えているため、最初の場所と最後の場所の間でそれほど変化しません。(iii)チャンバーが平衡化したら、キャリアガスの流れを減らして(50〜100 mL /分以下)、廃棄物や環境汚染を回避できます(揮発性麻酔薬は温室効果ガスの特性を持っています)。蒸気の定常状態濃度を維持するために必要な最小流量は、ハエによる蒸気の取り込みが無視できるため、主にSAAの漏れに依存します。これらの標準条件(2%イソフルランおよび1.5 L / minキャリアガス流量)では、ハエは3〜4分以内にアレイのすべての位置で麻酔(すなわち、動かない)され、位置間の顕著な違いはない。VGAは数分から数時間投与でき、私たちの典型的な曝露パラダイムは15分から2時間の範囲です。システムをフラッシュするために、気化器をオフにし、アレイの約10倍のボリュームを交換するように流量を維持します(5分間で1.5 L / min)。麻酔薬の排泄速度は、設定された流量によって異なります。

揮発性麻酔薬は、免疫炎症系を含む、まだ同定されていない多数の標的と相互作用します⁶。主要アウトカムと付随的アウトカム(「麻酔状態」と長期および短期の「副作用」)に対する個々の分子標的の寄与はよくわかっていない。したがって、高感度でハイスループットのハエシステムは、ハエと哺乳類の明らかな違いにもかかわらず、高等動物での実験に情報を提供する価値があります⁷。実際、いくつかの違いは有利です。例えば、ハエの免疫系は、応答⁸の適応アームを欠いているという点で高等動物の免疫系とは異なります。これはヒトの疾患を理解するための制限のように思えるかもしれませんが、適応応答から分離してVGAと自然免疫炎症反応との相互作用を研究するユニークな機会を提供します⁹。これにより、炎症に対するVGAの薬理学的効果と、集団に存在するさまざまな遺伝的背景によるそれらの調節の研究が可能になります。

プロトコル

注意: プロトコルで使用されるすべての材料の詳細については、 材料の表 を参照してください。

1. SAAの構築

1. 木を切り、 図1Aの寸法を使用してフレームを組み立ててフレームを作成します。
2. 50 mLコニカルチューブキャップを変更します。
   1. 各キャップに9/32インチのドリルビットで2つの穴を開けます。穴を研磨して、ぼろぼろのプラスチックをきれいにします。キャップの上部を研磨して表面を粗くします(これは接着剤の接着に役立ちます)。
   2. 5 mLの血清学的ピペットをサイズ(流入の場合は3インチ、流出の場合は1.5インチ)にカットし、プラスチックを刻み目線できれいに分解します。切断/破損したピペットの端を研磨します。
   3. チューブにネットを接着します(接着剤の適切な乾燥時間を確保してください)。接着剤が乾いたら、ネットをチューブのサイズにカットします。
   4. チューブを円錐形キャップの穴に挿入し、両方のチューブをキャップの上に(3/4インチ)伸ばします。流入チューブが流出管よりも長くチューブ内に伸びていることを確認します(図1B)。
   5. チューブの周りのキャップの上部に接着剤を塗布して、部品を一緒に固定します(続行する前に、接着剤の適切な乾燥時間を確保してください)。
3. キャップをフレームに取り付け、チューブを配線します(図1C)。
   1. 粘着ケーブルの固定具をフレームに取り付けます(中央から中央に 3.25 インチ離して)。
   2. 結束バンドを使用してキャップをフレームに取り付けます。結束バンドの端を短く切ります。
   3. タイゴンチューブの長さ(9インチ)を切断し、変更された各キャップの流入/流出チューブに接続します(図1D)。上流端から始めて、最初に流入に取り付け、次に流出から次の位置の流入にチューブを取り付けます。
   4. 最も下流の「流入」にフローインジケータを追加します(位置10、 図1E)。
   5. 最初の位置に50 mLのコニカルチューブを置き、流入チューブのすぐ下まで水を入れます(図1F)。
4. 気化器のインターフェースを準備します。プランジャーを取り外し、2つの10 mLディスペンシングシリンジ(深さ1/2 x 幅1/4、図 1G)からノッチを切り取り、ノッチを気化器の前面に直接向けて気化器の流入と流出に挿入し、穴に合わせます(図1H)。オプション:改造したシリンジを所定の位置に接着します。手頃な価格の場合は、市販のマニホールドを使用してください(1つのオプションについては 、材料表 を参照してください)。
5. システム全体を接続します。タイゴンチューブを使用して、レギュレーター付きキャリアガスタンク>ガス固有の流量計>気化器>SAAの順序でコンポーネントを取り付けます(図1C)。
6. アレイの空の位置を空の50 mLコニカルチューブで満たします。ガスタンクの電源を入れ、 流量計 を ~2 L / minに開き、 気化器 を 0%にオンにします。気化器の上流の流量計とSAAの最後のチャンバーの下流にある流量計の流量を確認して、システム内のガスの流れを確認します。または、下流のチューブの端を水に挿入し、気泡を探します。
   注意: システムは加圧されていないため、数センチメートルを超える水柱は流れを停止します。アレイの下流端に流れがない場合は、次の点を確認してください:流れを可能にするには気化器をオンにする必要があります。タンクレギュレーターと流量計が流量を許可していることを確認してください。アレイの位置をチェックして、チューブがしっかりとねじ込まれていることを確認します。変更されたキャップの接着剤の周りに漏れがないか確認します。

図1:SAAの構造。 (A)SAAを支える木枠の概略図(測定値付き)。(B)5mLの血清学的ピペットで作られた流入および流出チューブを備えた修正キャップの測定を含む概略化された断面。(C)組み立てられたSAA(Olufsら⁵から複製)(D)流入管と流出管を示す修正された50mL円錐形キャップの詳細。(E)フローインジケータによる下流(位置10)の流出。(f)キャリアガスを加湿するための上流(位置1)の水充填チューブ。赤い矢印は水位を示します。(G)その場しのぎのマニホールド用に変更された10mLディスペンシングシリンジ。赤い円は、8 mLと10 mLのマークの間にあるカットアウトノッチ(または1/2インチx 1/4インチ)を強調しています。(h)改造シリンジの挿入と向きを示すTec7気化器の背面図。このビューでは、変更されたシリンジのノッチに合わせる必要のある穴(赤い矢印)を左側に表示するために、シリンジが1つだけ配置されています。注:この切り欠きノッチと流出開口部の位置がずれると、麻酔薬の投与が中断されます。この部分は、このカスタムメイドシステムの潜在的な弱点です。資金が利用可能な場合は、商用マニホールドを使用する必要があります。略称: SAA = 連続麻酔アレイ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2.麻酔薬曝露前

1. 麻酔薬曝露の24時間以上前に、好ましい方法(例えば、_CO2 またはエーテル)を使用して、実験に必要なハエコホートを分類する。

3. SAAの運営

1. ハエを食品バイアルから空の50mLコニカルチューブ(CO₂なし)に移します。
   1. 暴露する前に死んだハエを数えて記録します。
2. ハエの入った50 mLコニカルチューブのキャップを外し、SAAにねじ込みます。
3. キャリアガスをオンにし、希望の流量に設定します。
   注:通常、1〜2 L / minを使用します。
4. 麻酔気化器を希望の濃度に設定します。
   注:通常、イソフルランに2%、セボフルランに3.5%を使用しますが、これは哺乳類の等価用量です¹⁰。
5. 希望の期間(分:15分)ハエを露出させます。
   注:SAAの位置間で平衡にばらつきが生じる可能性を回避するために、15分以上の曝露時間が推奨されます。このシステムでは、麻酔薬がすべての位置で平衡化するのに2〜3分かかります。
6. 暴露の最後に、SAAの総体積の約10倍の体積に相当する1.5 L / minの新鮮なガスフロー(気化器を0%に設定)でシステムを5分間洗い流します。

4. 実験開始前のチェックリスト

1. 高圧レギュレーター(エアタンクの上部)を完全に開き、半回転閉じてキャリアガスの流れを確保します。
2. i)流量計とii)気化器(流入/流出が正しく接続されていることを確認してください)への各ラインのチューブをたどり、iii)気化器の麻酔レベルを確認します。
3. チャンバーに被験者を装填した後、気泡試験または流量インジケーターで空気/ガスが流れていることを確認します。
   注意: 一部の気化器は、ダイヤルがオフの位置にあるときに空気の流れを許可しません。
4. ガスが流れているときは、流量計と下流の流量インジケーターの両方が流量を示していることを確認してください。
5. 実験の最後に、麻酔薬を洗い流すために4〜5分の気流を見込んでください。

結果

SAAのビデオリンクはこちらからご覧いただけます: Perouansky 研究方法 - 麻酔科 - UW-マディソン (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) 私たちの研究室は、SAAを使用して(i)麻酔薬に対する行動感受性に対する遺伝子型の影響を研究しました⁵;(ii)麻酔薬の副次的効果についてミトコンドリア変異体をスクリーニング^する11;(iii)外傷性脳損傷(TBI)の結果に関するイソフルランとセボフルランの薬力学を調査する12,13,14,15,16,17。公表された結果は、遺伝的背景が、従来の麻酔の表現型および麻酔毒性の付随的効果の両方、ならびに組織保護に関して、臨床的に使用されるVGAの薬力学に影響を与えることを明確に示している5,11,13,14,15。

代表例1(図2):確実に再現可能な実験条件で検出されたイソフルラン毒性に対するレジリエンスの遺伝的ドリフト
別々に培養された ND23⁶⁰¹¹⁴ ハエの間でVGA誘発死亡率の漸進的な定量的変化の発見は、SAAを使用した実験グループ間の麻酔薬力学の信頼できる比較の有用性の一例です。 ND23 は、mETCの複合体Iのコアにあるサブユニットをコードする遺伝子です(哺乳類の Ndufs8 に類似)¹⁸。このサブユニットの突然変異は、致命的なミトコンドリア病であるリー症候群の原因です。標準的な実験室条件下で(すなわち、VGAに曝露することなく)同時に培養されたさまざまなホモ接合 ND23⁶⁰¹¹⁴ 株において、時間の経過とともにイソフルラン誘発死亡率表現型が徐々に弱まることを観察しました。イソフルラン毒性に対するこの進化的適応は、VGAへの曝露がない場合に起こり、おそらく変異株内の「適者生存」の付随的効果である。イソフルラン感受性のこの漸進的な変化は、実験条件がアッセイ全体および経時的に同一であるという私たちの自信がなければ、認識されないままでした。選択は ND23⁶⁰¹¹⁴の効果の修飾因子に有利であり、偶然にもイソフルラン毒性に対する回復力が高まったと結論付けた。中枢神経系の炎症はリー症候群の病因に重要な役割を果たしているため、目撃された耐性の進化は、自然免疫炎症反応の適応的変化によるものであり、イソフルラン毒性に対する耐性は偶発的な副産物である可能性があります。

図2:ND23⁶⁰¹¹⁴ハエの進化圧の結果としてのイソフルラン毒性誘発死亡率の変動。 単一集団から単離された7系統(A-G)は、シングルペア交配を通じて、拡大し、2%イソフルランへの2時間曝露後(10〜13日齢)の24時間死亡率(PM₂₄)についてテストされ、単一の集団から生じる表現型の変動を示しています。データは箱ひげ図とひげ図で示されています。ボックスはデータの第 2 四分位数と第 3 四分位数を表し、ひげは最小および最大のデータ ポイントまで拡張されます。平均と中央値は、それぞれ「+」と水平線で示されます。個々の反復の死亡率(N)は円で示されています。N = 20〜50ハエ/バイアルの3〜4バイアル。通常の一元配置分散分析のp値p = 0.012は、平均間の有意差を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

代表例2(図3):イソフルラン薬力学に対する遺伝的背景効果を明らかにするためのSAAのハイスループットアプリケーションの図
システムのハイスループットの一例として、図3は、外傷性脳損傷(TBI)16の前にイソフルラン(2%イソフルランの15分間)への同一曝露の影響を示しており、このフライモデル^13、15、19における麻酔薬プレコンディショニング(AP)をテストするプロトコルである。測定値は、自然減少を補正したTBIの24時間後の死亡率です(MI₂₄)。このモデルでは、すべてのハエはTBI後30分以内に可動性を取り戻した(すなわち、生きていた)し、MI₂₄に記録された死亡率は二次脳損傷(sBI)の結果であった。4つのフライラインにおいて、イソフルランを有するAPはMI₂₄を様々な程度に低下させ、APに対する応答性が量的形質であることを示している。炎症反応はsBIからの罹患率における重要な因子であるので、APは免疫系の調節を伴い得る²⁰。

図3:イソフルランによるプレコンディショニングによる死亡率(MI₂₄)の抑制に対する遺伝的背景の影響。2%イソフルラン(紫色)を15分間投与したプレコンディショニングハエは、w 1118株およびy¹w¹¹¹⁸株(それぞれp < 0.0001およびp = 0.036)において24時間(MI₂₄)における死亡率指数を低下させた。MI 24は、事前に調整されたオレゴンR(OR)およびカントンS(CS)ラインで有意に低くはありませんでした(それぞれp = 0.16およびp =_0.27)。データは箱ひげ図とひげ図で示されています。ボックスはデータの第 2 四分位数と第 3 四分位数を表し、ひげは最小および最大のデータ ポイントまで拡張されます。平均と中央値は、それぞれ「+」と水平線で示されます。個々の反復(N)のMI₂₄値は円で示されています。N = TBI処理ハエ用の30〜40ハエ/バイアルの15〜33バイアル。N = 未処理の対照のための30-40ハエ/バイアルの2-15バイアル。対応のない両側スチューデントのt検定からのp値。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

SAAの建設における重要なステップには、麻酔薬混合物のガスの漏れを防ぐためのタイトなフィッティングの確保が含まれます。SAAは、実験室スペースの汚染を避けるために、ヒュームフードに収納する必要があります。キャリアガスボンベからSAAの下流の流量インジケータまでのすべての要素は、チェックリストに概説されているようにチェックする必要があります。

VGAをハエに投与する他の方法は、操作が複雑(イブリオメーター)21、低スループット22、複数の集団の同時曝露を許容しない²³、麻酔薬濃度の正確な制御を可能にしない²¹、または臨床的に受け入れられた用語²⁴に変換することが困難な読み出しを有する。

SAAの現在のバージョンは市販の気化器に依存しているため、毒物学的研究は揮発性麻酔薬に限定されています。他の揮発性物質と一緒に使用する場合、出力を校正した後、気化器を「適応外」で使用できます。あるいは、揮発性物質を気化させる別の方法を適用することができ、これは、前述のように、薬物濃度を滴定するための専用の測定を必要とする^{であろう25}。

流量インジケータを除いて、アラームはありません(つまり、タンクが空になると、SAAを通る流れが中断されます)。使用の強度に応じて、SAAはタイゴンチューブの清掃、締め付け、場合によっては交換が必要になる場合があります。オリジナルのSAAの「メンテナンス」は、7年間の使用で2回実行しました。

ショウジョウバエを麻酔するためのこの方法は、ショウ ジョウバエ の研究者が利用できる遺伝子ツールボックスをハイスループットシステムで使用することができます。異なる集団(例えば、遺伝子型、年齢、性別)のハエの複数のコホートは、目前の研究課題に適した同一の麻酔薬濃度およびキャリアガス(空気、_O2、_N2O、希ガス)の所望の組み合わせに同時に曝露することができる。

ここでは、SAAが ND23⁶⁰¹¹⁴ フライラインのイソフルラン毒性に対する回復力の予期せぬ変化を明らかにするのに有用であり、標準的な実験室のフライラインはAPに対する応答性が異なることを示しています。 これらの発見を特定することは、実験条件の厳密な管理とSAAの高いスループットのために可能でした。

SAAは、昆虫(ミツバチなど)に対する他の揮発性有機化合物(VOC)の影響を研究するために適応させることができます。蒸気圧が揮発性麻酔薬に近いVOC(イソフルラン:20°Cで240mmHg)の場合、従来の気化器を使用できますが、出力を校正する必要があります。デスフルラン用の市販の気化器は加熱されており、柔軟性を高める可能性があります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Serial Anesthesia Array:
5 mL Serological Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10C	Polystyrene, 5mL serological pipette
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	1495949A	Polypropylene, 50 mL
Cable Tie Mounting Pad	Grainger	6EEE6	1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H
Dispensing Syringe	Grainger	5FVE0	10 mL with Luer-Lock Connection
Fabric Mesh Netting			1 mm mesh
Flow Indicator	Grainger	8RH52	5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style
Tygon Tubing	Tygon	E-3603	ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16
Wood Frame			10 feet of 2 inch x 3/4 inch
Zip Tie			>5inch
Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold):
Dispensing Syringe	Grainger	5FVE0	10 mL with Luer-Lock Connection
Commercial Manifold and Vaporizers:
1/4 inch Equal Barbed Y Connector	Somni Scientific	BF-9000
1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic)	Somni Scientific	BF-9004
AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob	Somni Scientific	FP-4002
Flowmeter auxiliary mounting bracket	Somni Scientific	NonInvPart
Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male	Somni Scientific	GF-11012
TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6' color coded tubing X2. (Vaporizer not Included)	Somni Scientific	TT-17000
Tec 7 Isoflurane Vaporizer	GE Datex-Ohmeda	1175-9101-000	Agent-specific vaporizer (Isoflurane)
Tec 7 Sevoflurane Vaporizer	GE Datex-Ohmeda	1175-9301-000	Agent-specific vaporizer (Sevoflurane)