Массив серийной анестезии для высокопроизводительного исследования летучих агентов с использованием Drosophila melanogaster

Резюме

Плодовая муха (Drosophila melanogaster) широко используется для биологических и токсикологических исследований. Чтобы расширить полезность мух, мы разработали инструмент, массив последовательной анестезии, который одновременно подвергает несколько образцов мух воздействию летучих общих анестетиков (VGA), что позволяет исследовать побочные эффекты (токсические и защитные) VGA.

Аннотация

Летучие общие анестетики (VGA) используются во всем мире для миллионов людей всех возрастов и состояний. Высокие концентрации VGA (от сотен микромолей до низких миллимоляров) необходимы для достижения глубокого и нефизиологического подавления функции мозга, представляющего собой «анестезию» для наблюдателя. Полный спектр побочных эффектов, вызванных такими высокими концентрациями липофильных агентов, неизвестен, но были отмечены взаимодействия с иммунно-воспалительной системой, хотя их биологическое значение не изучено.

Чтобы исследовать биологические эффекты VGA у животных, мы разработали систему, называемую серийным анестезиологическим массивом (SAA), чтобы использовать экспериментальные преимущества, предлагаемые плодовой мухой (Drosophila melanogaster). SAA состоит из восьми камер, расположенных последовательно и соединенных с общим притоком. Некоторые детали доступны в лаборатории, а другие могут быть легко изготовлены или приобретены. Испаритель, который необходим для откалиброванного введения VGA, является единственным коммерчески производимым компонентом. VGA составляют лишь небольшой процент атмосферы, протекающей через SAA во время работы, поскольку основную часть (обычно более 95%) составляет газ-носитель; Перевозчиком по умолчанию является AIR. Тем не менее, кислород и любые другие газы могут быть исследованы.

Основное преимущество SAA по сравнению с предыдущими системами заключается в том, что он позволяет одновременно подвергать несколько когорт мух точно титруемым дозам VGA. Одинаковые концентрации VGA достигаются в течение нескольких минут во всех камерах, что обеспечивает неразличимые условия эксперимента. В каждой камере может содержаться от одной мухи до сотен мух. Например, SAA может одновременно исследовать восемь различных генотипов или четыре генотипа с различными биологическими переменными (например, мужской и женский, старый и молодой). Мы использовали SAA для исследования фармакодинамики VGA и их фармакогенетических взаимодействий в двух экспериментальных моделях мух, связанных с нейровоспалением-митохондриальными мутантами и черепно-мозговой травмой (ЧМТ).

Введение

Существование побочных анестезирующих эффектов (т.е. эффектов, которые не наблюдаются сразу, но могут иметь отсроченные поведенческие последствия) является общепризнанным, но понимание их механизмов и факторов риска остается рудиментарным ^1,2. Их отсроченное проявление и тонкость ограничивают количество потенциально важных переменных, которые могут быть исследованы в моделях млекопитающих в разумные сроки и по приемлемой цене. Плодовая муха (Drosophila melanogaster) обладает уникальными преимуществами в контексте нейродегенеративных заболеваний³ и токсикологического скрининга⁴, которые до настоящего времени не применялись для изучения побочных эффектов анестезии.

Мы разработали массив серийной анестезии (SAA) для облегчения использования плодовых мушек в изучении фармакодинамики и фармакогенетики анестезии. Ключевым преимуществом SAA является одновременное воздействие идентичных экспериментальных условий нескольких когорт. В сочетании с экспериментальной гибкостью плодовых мушек высокая пропускная способность SAA позволяет исследовать биологические и экологические переменные в масштабах, невозможных в моделях млекопитающих.

В принципе, SAA представляет собой просто серию соединенных мест анестезии (камер из флаконов по 50 мл), через которые газ-носитель доставляет летучие агенты. Первая камера системы содержит дистиллированную воду, через которую газ-носитель увлажняется (мухи чувствительны к обезвоживанию), и она заканчивается простым индикатором потока, который показывает поток газа через систему. Тонкие сетки, размещенные на отверстиях соединительной трубки, разделяют камеры, чтобы предотвратить миграцию мух между камерами. Количество мест «последовательно» ограничено сопротивлением потоку газа без давления (насосно-компрессорные трубы, сетки).

Мы охарактеризовали кинетику этого прототипа SAA в предыдущей публикации⁵. Хотя точные фармакокинетические свойства будут варьироваться между ФАРМ, соответствующие основы, которые были проверены экспериментально, заключаются в следующем: (i) начальный поток 1,5-2 л / мин уравновешивает все камеры (общий объем ±550 мл) с желаемой концентрацией анестетика в течение 2 минут; (ii) концентрация анестетических паров, подаваемых в камеры, не изменяется заметно между первым и последним местом, поскольку количество анестетика, содержащегося в объеме газа в отдельной камере (50 мл), намного превышает количество, поглощаемое любым количеством мух; и (iii) после того, как камеры уравновешены, поток газа-носителя может быть уменьшен (50-100 мл/мин или менее), чтобы избежать отходов и загрязнения окружающей среды (летучие анестетики обладают свойствами парниковых газов). Минимальный расход, необходимый для поддержания стационарной концентрации пара, зависит, прежде всего, от негерметичности SAA, поскольку поглощение пара мухами незначительно. В этих стандартных условиях (2% изофлурана и поток газа-носителя 1,5 л/мин) мухи обезболиваются (т.е. неподвижны) во всех положениях массива в течение 3-4 минут, с незаметными различиями между положениями. VGA можно вводить от нескольких минут до нескольких часов, и наши типичные парадигмы воздействия находятся в диапазоне от 15 минут до 2 часов. Для промывки системы испаритель отключается, и поток поддерживается для обмена примерно 10-кратного объема массива (1,5 л/мин в течение 5 минут). Скорость выведения анестетика будет варьироваться в зависимости от заданной скорости потока.

Летучие анестетики взаимодействуют с многочисленными еще не идентифицированными мишенями, включая иммунно-воспалительную систему⁶. Вклад отдельных молекулярных мишеней в первичные и побочные исходы («анестезирующее состояние» по сравнению с долгосрочными и краткосрочными «побочными эффектами») плохо изучен. Таким образом, чувствительная, высокопроизводительная система мух ценна для информирования об экспериментах на высших животных, несмотря на очевидные различия между мухами и млекопитающими⁷. Некоторые различия могут, на самом деле, быть выгодными; Например, иммунная система мухи отличается от иммунной системы высших животных тем, что у нее отсутствует адаптивная рука ответа⁸. Хотя это может показаться ограничением для понимания болезни у людей, это дает уникальную возможность изучить взаимодействие VGA с врожденным иммунно-воспалительным ответом в отрыве от адаптивного ответа⁹. Это позволяет изучать фармакологические эффекты VGA на воспаление и их модуляцию различными генетическими фонами, присутствующими в популяции.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, используемых в протоколе.

1. Строительство САА

1. Изготовьте раму, распилив дерево и собрав раму, используя размеры, указанные на рисунке 1А.
2. Модифицируйте конические крышки пробирок объемом 50 мл.
   1. Просверлите по два отверстия в каждом колпачке сверлом 9/32 дюйма. Отшлифуйте отверстия, чтобы очистить рваный пластик. Отшлифуйте верхнюю часть колпачка, чтобы придать поверхности шероховатость (это помогает с адгезией клея).
   2. Разрежьте серологические пипетки объемом 5 мл по размеру (3 дюйма для притока и 1,5 дюйма для оттока), надрезав пластик, а затем разбив его на линии надбитых. Отшлифуйте концы разрезанных/сломанных пипеток.
   3. Приклейте сетку к тюбикам (обеспечьте надлежащее время высыхания клея). Обрежьте сетку по размеру трубки после того, как клей высохнет.
   4. Вставьте трубки в отверстия конических колпачков так, чтобы обе трубки выступали (на 3/4 дюйма) над крышкой; убедитесь, что впускная трубка простирается в трубку дольше, чем выпускная (рис. 1B).
   5. Нанесите клей на верхнюю часть колпачков вокруг тюбиков, чтобы скрепить детали вместе (прежде чем продолжить, обеспечьте надлежащее время высыхания клея).
3. Прикрепите колпачки к раме и проложите трубку (рис. 1C).
   1. Прикрепите к раме клейкие кабельные стяжки (3,25 дюйма друг от друга, от центра к центру).
   2. Прикрепите колпачки к раме с помощью стяжек; Коротко обрежьте концы бирки для застежки-молнии.
   3. Отрежьте и подсоедините отрезки (9 дюймов) трубок Tygon к входным/выпускным трубам на каждой модифицированной крышке (рис. 1D). Начиная с верхнего конца, прикрепите сначала к притоку, а затем впоследствии прикрепите трубку от оттока к притоку следующего положения.
   4. Добавьте индикатор расхода к самому последующему «притоку» (позиция 10, рис. 1E).
   5. Поместите коническую трубку объемом 50 мл в первое положение и наполните ее водой чуть ниже впускной трубки (рис. 1F).
4. Подготовьте сопряжение для испарителя. Снимите плунжеры, вырежьте насечки из двух дозирующих шприцев объемом 10 мл (1/2 дюйма в глубину x 1/4 дюйма в ширину, рис. 1G) и вставьте их во вход и выход испарителя так, чтобы насечки были обращены прямо к передней части испарителя, чтобы выровнять отверстия (рис. 1H). Дополнительно: Приклейте модифицированные шприцы на место. Если это возможно, используйте коммерческий коллектор (см. Таблицу материалов для одного из вариантов).
5. Подключите всю систему. Используйте трубку Tygon для соединения компонентов вместе в следующем порядке: газгольдер-носитель с регулятором > расходомер > испаритель > SAA (рис. 1C).
6. Заполните пустые позиции на массиве пустыми коническими пробирками объемом 50 мл. Включите бензобак, откройте расходомер до ~2 л/мин и включите испаритель на 0%. Подтвердите расход газа в системе, проверив расходомер перед испарителем и индикатор расхода после последней камеры SAA на предмет расхода. В качестве альтернативы вставьте конец трубки, расположенный ниже по потоку, в воду и ищите пузырьки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку система не находится под давлением, водяной столб выше пары сантиметров остановит поток. Если на нижнем конце массива нет потока, проверьте следующее: испаритель должен быть включен, чтобы обеспечить поток; убедитесь, что регулятор бака и расходомеры пропускают поток; проверьте положение массива, чтобы убедиться, что трубки плотно прикручены; и проверьте, нет ли утечек вокруг клея на модифицированных колпачках.

Рисунок 1: Конструкция САА. (А) Схема, с измерениями, деревянной рамы, поддерживающей САА. (B) Схематизированное поперечное сечение с измерениями модифицированного колпачка с входными и выпускными трубками, изготовленными из серологических пипеток объемом 5 мл. (C) Собранные SAA (воспроизведены из Olufs et ^al.5) (D) Детали модифицированного конического колпачка объемом 50 мл с изображением входных и выпускных трубок. (E) Последующий (позиция 10) отток с индикатором расхода. (F) Находящаяся выше по потоку (позиция 1) заполненная водой трубка для увлажнения газа-носителя. Красная стрелка указывает уровень воды. (G) Модифицированный дозирующий шприц объемом 10 мл для импровизированного коллектора. Красным кругом выделена вырезная выемка, расположенная между метками 8 мл и 10 мл (или 1/2 дюйма x 1/4 дюйма). (H) Вид испарителя Tec7 сзади с указанием установки и ориентации модифицированных шприцев. На этом снимке установлен только один шприц, чтобы слева было показано отверстие (красная стрелка), которое необходимо выровнять с выемкой модифицированного шприца. Примечание: Смещение этой выемки и выходного отверстия нарушит введение анестетика. Эта часть является потенциальным слабым местом в этой системе, изготовленной по индивидуальному заказу. При наличии средств следует использовать коммерческий коллектор. Аббревиатура: SAA = массив последовательной анестезии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Перед воздействием анестетика

1. За двадцать четыре часа или более до воздействия анестетика отсортируйте когорты мух по мере необходимости для эксперимента, используя предпочтительный метод (например, CO₂ или эфир).

3. Деятельность САА

1. Переложите мух из пищевых флаконов в пустые конические пробирки объемом 50 мл (без CO₂).
   1. Подсчитайте и запишите всех мертвых мух до воздействия.
2. Снимите крышку и прикрутите конические пробирки объемом 50 мл с мухами к SAA.
3. Включите газ-носитель и установите желаемый расход.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы используем 1-2 л/мин.
4. Установите испаритель анестетика на желаемую концентрацию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы используем 2% для изофлурана и 3,5% для севофлурана, которые являются эквипотентными дозами у млекопитающих¹⁰.
5. Экспонируйте мух в течение желаемого времени (мин.: 15 мин).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется минимальное время экспозиции 15 минут, чтобы избежать возможной изменчивости равновесия в разных положениях SAA. В этой системе требуется 2-3 минуты, чтобы анестетики уравновесились во всех положениях.
6. В конце экспозиции промывайте систему потоком свежего газа (испаритель установлен на 0%) со скоростью 1,5 л/мин в течение 5 мин, что соответствует примерно 10-кратному объему от общего объема SAA.

4. Контрольный список перед началом эксперимента

1. Полностью откройте регулятор высокого давления (сверху воздушного бака), а затем закройте его на пол-оборота, чтобы обеспечить поток газа-носителя.
2. Следуйте трубкам для каждой линии к i) расходомерам и ii) испарителю (убедитесь, что вход/отток подключены правильно) и iii) проверьте уровень анестетика в испарителях.
3. После загрузки камер испытуемыми убедитесь, что воздух / газ течет с помощью пузырькового теста или индикатора потока.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые испарители не пропускают поток воздуха, когда циферблат находится в выключенном положении.
4. Когда газ течет, убедитесь, что расходомер и индикатор расхода ниже по потоку показывают расход.
5. В конце эксперимента дайте 4-5 минутам воздушного потока вымыть анестетик.

Результаты

Ссылка на видео SAA предоставлена здесь: Методы исследования Перуанского - Отделение анестезиологии - UW-Madison (wisc.edu) (https://anesthesia.wisc.edu/research/researchers/perouansky-laboratory/perouansky-research-methods/) Наша лаборатория использовала SAA для (i) изучения влияния генотипа на поведенческую чувствительность к анестетикам⁵; (ii) скрининг митохондриальных мутантов на предмет побочных эффектов анестетиков¹¹; и (iii) исследовать фармакодинамику изофлурана и севофлурана в отношении исходов при черепно-мозговой травме (ЧМТ)12,13,14,15,16,17. Опубликованные результаты наглядно демонстрируют, что генетический фон влияет на фармакодинамику клинически применяемых ВГА как в отношении традиционного фенотипа анестезии, так и в отношении побочных эффектов анестезирующей токсичности, а также защиты тканей 5,11,13,14,15.

Репрезентативный пример 1 (рис. 2): Генетический дрейф в устойчивости к токсичности изофлурана, обнаруженный в надежно воспроизводимых экспериментальных условиях
Открытие постепенного количественного изменения смертности, индуцированной VGA, среди отдельно культивируемых мух ND23⁶⁰¹¹⁴ является примером полезности надежных сравнений фармакодинамики анестетика в экспериментальных группах с использованием SAA. ND23 — ген, кодирующий субъединицу в ядре комплекса I mETC (аналог Ndufs8 у млекопитающих)¹⁸. Мутации в этой субъединице являются причиной синдрома Ли, смертельного митохондриального заболевания. Мы наблюдали постепенное ослабление фенотипа смертности, индуцированного изофлураном, с течением времени в различных гомозиготных запасах ND23⁶⁰¹¹⁴ , культивируемых одновременно в стандартных лабораторных условиях (т.е. без воздействия VGA). Эта эволюционная адаптация к токсичности изофлурана происходила при отсутствии какого-либо воздействия VGA и, вероятно, является побочным эффектом «выживания наиболее приспособленных» в мутантных группах. Это постепенное изменение чувствительности к изофлурану осталось бы незамеченным без нашей уверенности в том, что экспериментальные условия были идентичны во всех анализах и с течением времени. Мы пришли к выводу, что отбор благоприятствует модификаторам эффектов ND23⁶⁰¹¹⁴ с одновременной повышенной устойчивостью к токсичности изофлурана. Поскольку воспаление в центральной нервной системе играет важную роль в патогенезе синдрома Ли, наблюдаемая эволюция резистентности может быть связана с адаптивными изменениями во врожденном иммунно-воспалительном ответе, при этом резистентность к токсичности изофлурана является случайным побочным продуктом.

Рисунок 2: Изменение смертности, вызванной токсичностью изофлурана, в результате эволюционного давления у мух ND23⁶⁰¹¹⁴. Семь линий (A-G), выделенных из одной популяции путем спаривания одной пары, расширенных и проверенных на 24-часовую смертность (PM₂₄) после 2-часового воздействия 2% изофлурана (в возрасте 10-13 дней), демонстрируют вариабельность фенотипа, возникающего из одной популяции. Данные отображаются в виде прямоугольных и усовых графиков. Прямоугольники представляют собой второй и третий квартили данных, а усы простираются до минимальной и максимальной точек данных. Среднее значение и медиана обозначаются знаком «+» и горизонтальными линиями соответственно. Процент смертности индивидуума (N) показан в виде кругов. N = 3-4 флакона по 20-50 мух/флакон. P-значение для обычной односторонней ANOVA; p = 0,012 указывает на существенную разницу между средними значениями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Репрезентативный пример 2 (рис. 3): Иллюстрация высокопроизводительного применения SAA для выявления влияния генетического фона на фармакодинамику изофлурана
В качестве примера высокой пропускной способности системы на рисунке 3 показаны эффекты идентичного воздействия изофлурана (15 мин 2% изофлурана) до черепно-мозговой травмы (ЧМТ)16, протокол тестирования предварительного кондиционирования анестетика (АП) в этой модели^{мухи 13,15,19}. Показания - смертность через 24 ч после ЧМТ с поправкой на естественное истощение (ИМ₂₄). В этой модели все мухи восстановили подвижность (т.е. были живы) в течение 30 минут после ЧМТ, а смертность, зарегистрированная в MI₂₄, была результатом вторичной черепно-мозговой травмы (sBI). В четырех линиях мух АР с изофлураном снижал ИМ₂₄ в разной степени, что указывает на то, что реакция на АП является количественным признаком. Поскольку воспалительная реакция является важным фактором заболеваемости от sBI, AP может включать модуляцию иммунной системы²⁰.

Рисунок 3: Влияние генетического фона на подавление смертности (ИМ₂₄) путем прекондиционирования изофлураном. Предварительное кондиционирование мух с 15 мин 2% изофлурана (фиолетового) снижало индекс смертности через 24 ч (MI₂₄) у штаммов w 1118 и y¹w¹¹¹⁸ (p < 0,0001 и p = 0,036 соответственно ). MI₂₄ не был значительно ниже в предварительно подготовленных линиях Oregon R (OR) и Canton S (CS) (p = 0,16 и p = 0,27 соответственно ). Данные отображаются в виде прямоугольных и усовых графиков. Прямоугольники представляют собой второй и третий квартили данных, а усы простираются до минимальной и максимальной точек данных. Среднее значение и медиана обозначаются знаком «+» и горизонтальными линиями соответственно. Значения MI₂₄ отдельных реплик (N) показаны в виде кругов. N = 15-33 флакона по 30-40 мух/флакон для мух, обработанных ЧМТ. N = 2-15 флаконов по 30-40 мух/флакон для необработанного контроля. P-значения из непарного двустороннего t-критерия Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Важнейшие этапы строительства SAA включают обеспечение герметичных фитингов во избежание утечки анестезирующей смеси газов. SAA должен быть размещен в вытяжном шкафу, чтобы избежать загрязнения лабораторного помещения. Все элементы, от газовых баллонов-носителей до индикатора расхода после SAA, должны быть проверены, как указано в контрольном списке.

Другие методы введения VGA мухам сложны в эксплуатации (небриометр)21, имеют низкую пропускную способность 22, не допускают одновременного воздействия нескольких популяций 23, не позволяют точно контролировать концентрацию анестетика 21 или имеют показания, которые трудно перевести в клинически принятые термины ²⁴.

Текущая версия SAA основана на коммерческом испарителе, и, следовательно, токсикологические исследования ограничены летучими анестетиками. При использовании с другими летучими веществами испаритель можно использовать «не по прямому назначению» после калибровки выхода. В качестве альтернативы может быть применен другой метод испарения летучих веществ, который потребует специальных измерений для титрования концентраций лекарственного средства, как описано ранее²⁵.

Кроме индикаторов расхода, нет никаких аварийных сигналов (т.е. если резервуары опустеют, поток через SAA будет прерван). В зависимости от интенсивности использования SAA может потребоваться очистка, затяжка и, возможно, замена трубки Tygon. За 7 лет использования мы дважды проводили «техническое обслуживание» нашего оригинального SAA.

Этот метод обезболивания плодовых мушек позволяет использовать генетический инструментарий, доступный исследователям дрозофилы , в высокопроизводительной системе. Несколько когорт мух разных популяций (например, генотипа, возраста, пола) могут одновременно подвергаться воздействию одинаковых концентраций анестетика и желаемой комбинации газа-носителя (воздух,_O2, N₂O, инертные газы), подходящей для рассматриваемого вопроса исследования.

Здесь мы показываем, что SAA был полезен для выявления неожиданных изменений в устойчивости к токсичности изофлурана в линии мух ND23⁶⁰¹¹⁴ и что стандартные лабораторные линии мух различаются по своей чувствительности к AP. Идентификация этих результатов стала возможной благодаря жесткому контролю экспериментальных условий и высокой пропускной способности SAA.

SAA может быть адаптирован для изучения воздействия других летучих органических соединений (ЛОС) на насекомых (например, медоносных пчел). Для ЛОС с давлением паров, близким к давлению летучих анестетиков (изофлуран: 240 мм рт.ст. при 20 °C), можно использовать обычные испарители, но выход должен быть откалиброван. Коммерческий испаритель для десфлурана нагревается, что потенциально обеспечивает дополнительную гибкость.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Serial Anesthesia Array:
5 mL Serological Pipettes	Fisher Scientific	13-676-10C	Polystyrene, 5mL serological pipette
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	1495949A	Polypropylene, 50 mL
Cable Tie Mounting Pad	Grainger	6EEE6	1.25 inch L x 1 inch W x 0.28 inch H
Dispensing Syringe	Grainger	5FVE0	10 mL with Luer-Lock Connection
Fabric Mesh Netting			1 mm mesh
Flow Indicator	Grainger	8RH52	5/16 to 1/2 inch connection size, paddle wheel style
Tygon Tubing	Tygon	E-3603	ID: 5/16, OD: 7/16, wall: 1/16
Wood Frame			10 feet of 2 inch x 3/4 inch
Zip Tie			>5inch
Vaporizer Interface (Budget Alternative to Manifold):
Dispensing Syringe	Grainger	5FVE0	10 mL with Luer-Lock Connection
Commercial Manifold and Vaporizers:
1/4 inch Equal Barbed Y Connector	Somni Scientific	BF-9000
1/8 inch NPT to 1/4 inch Barbed Elbow (Plastic)	Somni Scientific	BF-9004
AIR 0-4 LPM Flowmeter w/ black knob	Somni Scientific	FP-4002
Flowmeter auxiliary mounting bracket	Somni Scientific	NonInvPart
Medical Air, 1/8 inch NPT Male x DISS Male	Somni Scientific	GF-11012
TT-2 Table Top Anesthesia System, built in dual diverter valve system. Includes 6' color coded tubing X2. (Vaporizer not Included)	Somni Scientific	TT-17000
Tec 7 Isoflurane Vaporizer	GE Datex-Ohmeda	1175-9101-000	Agent-specific vaporizer (Isoflurane)
Tec 7 Sevoflurane Vaporizer	GE Datex-Ohmeda	1175-9301-000	Agent-specific vaporizer (Sevoflurane)