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  • プロトコル
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要約

ここでは、光透過凝集法を用いて血小板アゴニストのコラーゲン関連ペプチド架橋(CRP-XL)を標準化する方法を紹介します。プロトコルが血小板機能を目標としている間、実験プロセスは科学的な厳密さおよび再現性を保障するためにほとんどの生物的分子および生物検定に適用することができる。

要約

計測学(測定の科学)は、生物学者にとって不利益なほどに、ほとんど教えられないテーマです。シンプルな標準化プロセスを日常業務に適用することで、距離や時間にわたってデータに信頼性と再現性を持たせることができます。

この方法は、止血研究や臨床診療で広く使用されているコアラボ実験、具体的には、光透過凝集法(LTA)による血小板コラーゲン受容体(糖タンパク質[GP]VI)アゴニストコラーゲン関連ペプチド架橋(CRP-XL)への応答の測定を標準化する方法を示しています。このアプローチを使用することで、アゴニストの在庫やサプライヤーに関係なく、ラボ内の再現性とラボ間の調和が保証されます。重要なことに、この方法は他の血小板アゴニスト、そして実際、他の多くの生体分子やバイオアッセイにも適用できます。

以下に概説するプロセスでは、「標準」と「テスト」(チェックする材料)の6〜8ポイント希釈シリーズを作成し、選択したアッセイ(この場合はLTA)で並べて実行します。CRP-XLは質量/体積濃度で使用されますが、すべての材料が特定の濃度で同じ生物活性を示すわけではないため、希釈シリーズを作成して標準物質と試験物質を比較し、同等の活性を得るために必要な濃度を決定します。希釈系列は、0〜100%の凝集にまたがる必要があります。データは非線形回帰を使用してプロットされ、各サンプル(標準およびテスト)のEC50 値が決定されます。活性を割り当てるには、標準試料の EC50 値を試験値で割って、その効力の増減を判断し、それに応じて濃度を調整します。このアプローチにより、同じ生物学的「活性」がアッセイに何度も追加されることが保証されます。

概要

私たちの多くは、実験で生物学的アゴニストとアンタゴニストを使用し、ほとんどの場合、特定の条件下で細胞機能への影響を定量化する生物学的アッセイで使用します。本稿に記載の方法は、血小板を活性化し、その活性を種々のアッセイ(光透過凝集法、顕微鏡法、フローサイトメトリー、Ca2+ 放出など)で測定することができる糖タンパク質VIアゴニストである血小板アゴニストコラーゲン関連ペプチド架橋(CRP-XL)のためのものであるが、アゴニスト標準化プロトコルは、あらゆる生物学的アゴニスト/アンタゴニストおよび/またはバイオアッセイに適用可能である。物理科学は、日常業務における標準物質の使用に精通しており、商業部門でバイオ医薬品を開発している企業は、標準物質1を使用することの価値を理解していますが、多くの生物学者、特に学術研究コミュニティでは、標準物質が十分に活用されておらず、使用されていないことが科学的成果の質に悪影響を及ぼしています。

CRP-XLは、1995年の記述以来、血小板分野で数十年にわたって使用されてきた特異的なGPVI特異的アゴニストであり2、GPVIの役割を他のコラーゲン結合血小板タンパク質の役割から区別するのに役立っています3,4。このアゴニストは、さまざまな商業的供給源から調達することも、社内で製造することもできます。ペプチドモノマーは、サプライヤーから購入し、社内で架橋することも、サプライヤーが追加料金で行うこともできます。納品時に必要な純度を下げることで、さらなるコスト削減が可能です(たとえば、95%に対して70%)。また、CRP-XLの保存方法についてもコンセンサスが得られておらず、凍結保存を選択する人もいれば、冷蔵保存を選択する人もいれば、使用まで凍結乾燥する人もいれば、溶液(好みに応じて水または緩衝液)で保存する人もいます。したがって、ラボストックの品質と組成は標準化されておらず、調和していません。このアゴニストは活性単位ではなく定義された濃度(質量/体積)で使用されるため、あるラボ(例えば1 μg/mL)でのCRP-XLの効力は、別のラボと同じにはなりません。この分野で使用されている他の血小板アゴニストはすでに標準化されているため(例えば、トロンビンは質量/体積ではなく活性単位で供給および使用される)、質量/体積から生物学的単位への移行は、コミュニティにとってそれほど困難ではないはずです。また、CRP-XLを含む血小板アゴニストに対する患者の反応は、アゴニストに対する感受性や反応能力(奏効の程度)の点で変動するため5、アッセイで一貫した量のアゴニスト活性を使用することがさらに重要であることにも注意する必要があります。

血小板アゴニストを重量/体積ではなく、定義された活性で使用することで調和させることができれば、あるラボでの実験が他のラボでの実験と直接比較でき、自信を持って正確に再現できるようになります。CRP-XL活性の保存方法と標準化方法について分野が合意に達するまでは、材料を定期的にチェックして、使用されている数か月/数年にわたる一貫性を確保することが不可欠です。

生物学的標準物質の活性値の割り当ては、共同の多施設研究(6,7など)を通じて行う必要があり、専門知識が必要です。血小板作動薬の確立された生物学的基準の必要性は、最近、国際血栓止血学会(ISTH)が支援する共同多施設研究8によって強調されています。CRP-XLの国際標準が利用可能になるまで、研究者は独自の材料をローカルで標準化して、長期にわたる一貫性を確保し、商業的または社内で調達された新しい材料は、以前の準備やコミュニティの他の準備に匹敵する活動を行うことができます。

プロトコル

血液は、同意のある健康なボランティアから採取し、地域の規則に従って処理する必要があります。このプロトコルは、光透過凝集法(LTA)によって血小板リッチ血漿(PRP)のアゴニスト誘導血小板凝集を測定します。ISTHは、PRP調製のための2013メソッドおよびLTA9を含む標準化されたプロトコルを提供します。 地域の倫理委員会の規則に従って、ISTHの推奨事項に従って全血を4%クエン酸ナトリウムに収集します。過去2週間以内にNSAIDを服用したドナーを除外します。

1. アッセイ手順

  1. ストックCRP-XLのアリコートを採取し、アッセイ(Tyrodes10)バッファー(表1)で、最大の凝集を引き起こす開始濃度に希釈します(ステップ1.3の以下の注を参照)。
    注:文献では、1 μg/mL の濃度で最大の凝集が誘導されますが、一部のラボでは、同じ効果を得るためにより高い濃度が必要です - それに応じて希釈系列を調整してください
  2. 濃度が試験試薬と同じになるように、標準液(以下のステップ1.3および 図1の注を参照)で対応する希釈シリーズを作成します。
  3. 試験用に 6 〜 8 ポイントの希釈系列を作成し、再びアッセイバッファー中で、凝集レスポンスを 100% から 0% に引き上げます。8点希釈系列濃度曲線を示す例を 表2に示す。
    注:一部のラボでは、合計10%のアッセイ容量でアゴニストを添加し、例えば、50 μLのアゴニストを450 μLの血小板に添加し、アッセイで10倍の濃度を最終的な1倍の濃度に希釈しますが、他のラボでは、より少量の(より濃縮された)容量のアゴニスト、例えば、5 μLのアゴニストを495 μLの血小板に添加します - 希釈シリーズが体積の変位を念頭に置いてアッセイに適していることを確認してください血小板濃度に影響を与えます - 繰り返しになりますが、一貫してください。この例では、30μLの10xアゴニストを270μLの多血小板血漿(PRP)に添加します。
  4. 血小板を休ませて使用する準備ができたら、LTAキュベットに分注し、攪拌子を加えて、保持ウェルで37°Cに達するまで待ちます。
  5. 温度が上がったら、キュベットを凝集計に入れ、トレースの記録を開始します。アゴニストを(攪拌しながら)添加し、データを記録します。
  6. 曲線のプロットに必要なデータが収集されるまで、試験と標準試料の濃度ごとに手順 1.4 を繰り返します( 図 2 に示す曲線の例)。
  7. 標準試薬の効力と比較した試験試薬の効力を計算します。繰り返しになりますが、一貫性があり、分析モデルがデータに適切に適合している限り、任意のメトリック (最大集計または曲線下面積) を使用します。

2. 濃度曲線の確認

  1. まず、濃度応答曲線が平行であることを確認します。これを行うソフトウェアパッケージは数多くありますが、ここではGraphpad Prismのプロセスについて説明します( 図3を参照)。
    1. log(濃度)がX軸に、応答(%最大凝集/AUC)がY軸になるようにデータを入力します(図3A)
    2. CRP-XL濃度の変換(図3B)
    3. 解析関数から非線形回帰を選択し、用量反応刺激/抑制の式を使用します。
    4. 対数(アゴニスト)と応答(可変傾き)の選択 - データに最適な方に応じて、3元または4方向の近似を使用します。
    5. [比較] タブ (図 3C を参照) を使用して曲線が平行かどうかを判断し、ボタンをクリックしてデータセットを比較し、傾斜角 (丘陵の傾斜角) と漸近線 (曲線の上部と下部) が等しいことを確認します。この例では、検定の丘陵勾配は2.279で、標準の勾配は2.025で、比率は1.125です。
    6. 傾きが平行で(たとえば、傾き比が0.8〜1.25の許容基準)、漸近線が等しい場合は、ステップ2.1.3および2.1.4を使用してポテンシー(EC50)計算に進みます。ここに示す例では、ステップ2.1.5の評価で漸近線が等価であることが確認されたため、漸近線が制約されています。
    7. 標準試料の EC50 値を試験値で割って、相対的な効力を決定します。ここに示す例では、test/standard (0.07259/0.1498) = 0.4846、つまり、「test」の効力は標準の半分です。
    8. 力価の違いを考慮して質量/体積濃度を調整します(例:標準試料が以前に 1 μg/mL で使用されていた場合、新しい材料は 1/0.4846 = 2.063 μg/mL)で使用され、同等の量の活物質が実験で使用されるようにします

代表的な結果

図 1 は希釈系列を図で表したもので、標準試料と試験の両方に希釈系列が必要であることを強調するためのものです。図2Aは標準品の集約トレースを示し、テスト・データは図2Bに示されています。0.075 μg/mL では、標準試料に対する明確なレスポンスがありますが、試験では、対応する濃度(0.075 μg/mL)は横ばい、つまりレスポンスがありません。これらのデータは、EC50を与えるための後続のグラフをプロットするために使用されます。ここに示す例では、図 3 に示すように、100% の最大凝集を使用して濃度-レスポンス曲線をプロットし、EC50 を決定しました。

figure-representative results-522
図 1:試験(左)と標準試料(右)の 2 つの希釈系列のグラフによる説明。 最高濃度(推奨濃度:10 μg/mL CRP-XL)から始めて、8 ポイント(>3 log 単位)にわたって連続した 1 in 2 希釈を並行して行います。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

figure-representative results-967
図2:標準液(左)と試験希釈系列(右)の凝集トレース。 血小板凝集が進むにつれて(x軸)、サンプルを通過してセンサーに到達する光の量が増加します(y軸)。(A) 標準。(B) テスト。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

figure-representative results-1422
図3:データ入力と分析。 (A)データが入力され、(B)変換され、(C,D)並列性が分析されます(ヒルの傾きと漸近線が比較可能かどうかをソフトウェアに尋ねてください[C])。(E)曲線が平行な場合、非線形回帰曲線フィッティングを使用して効力(EC50)を決定します。(F) 変換されたデータをプロットしたもの。詳しくは方法をご覧ください。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Tyrodesの緩衝9
成分濃度コメント
NaCl(ナトリウム)134ミリメートル
ナ2HPO40.34ミリメートル
KClの2.9ミリメートル
NaHCO 3(ナホ・シー・オーティー)12ミリメートル
4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)20ミリメートル
グルコース5ミリメートル
MgClの21ミリメートルpH値7.3

表1:チロデス緩衝液の組成

8点希釈シリーズ
希釈 110 μg/mL
希釈 25 μg/mL
希釈 32.5 μg/mL
希釈 41.25 μg/mL
希釈 50.625 μg/mL
希釈 60.3125 μg/mL
希釈 70.15625 μg/mL
希釈 80.073125 μg/mL

表2:8点希釈系列を示す例。

ディスカッション

ここに示すように、材料を標準化するプロセスは非常に簡単です。新しいバッチの材料を評価したり、現在のバッチが安定していて、時間の経過とともに活性が失われていないことを確認したりするには少し時間がかかりますが、その見返りは、実験が何度も再現可能であり、試薬のバッチの寿命だけでなく、何年にもわたって比較できることです。また、他の研究者がアッセイ条件を正確に再現でき、コミュニティがグローバルレベルで調和していることも意味します。プロトコルの重要なステップには、全血採取とPRP調製9、および希釈シリーズを作成する際の精度が含まれます。また、EC50 の比較を進める前に、テスト曲線と検量線が平行であることを確認することも重要です。線が平行でない場合、または漸近線が同等でない場合は、試験材料と標準材料がある程度異なることを示している可能性があります。

生物科学に携わる人なら誰でも、生物学的アッセイが常に一貫して機能するとは限らないことを知っているため、データを評価する際にはこの点に注意する必要があります。ここに示す例では、同一ではないにしても非常によく似た 2 つの材料の効力を測定するために同じドナーを使用していますが、丘陵の斜面と漸近線は同一ではありません。しかし、ある程度のばらつきを受け入れ、この場合、曲線は平行であり、したがって効力の比較と調整に適していると結論付けます。生体分子は大きく複雑であり、製造中の翻訳後修飾がバイオアッセイにおけるその効力に影響を与える可能性があります。生体分子とバイオアッセイの標準化は、質量や体積だけでは行えず、バイオアッセイにおける生物 活性 の定量化と比較によって行う必要があります11。1つは、アッセイのコンテキストでデータを評価するために彼/彼女のトレーニングと経験を使用する必要があります。

この手法の限界は、データが試薬の問題を示していることはあっても、問題が何であるかを知ることができないことです。材料が比較できない理由を特定するには、さらなる作業が必要です。理想的な世界では、実験とその後の科学的結論に不可欠な材料は質量分析法によって検証されますが、これは常にオプションであるとは限りません。ただし、データが比較できない場合でも、ある程度の範囲でさらなる調査が必要です。このアプローチのもう一つの制限は、それを行うために必要な時間とリソースです。理想的には、3〜6人のドナーで試験と標準を比較して、材料に生物学的活性を割り当てることにある程度の信頼性を提供する必要がありますが、これは再現性と信頼性をサポートすることで正当化されると考えています。生物学的物質の標準化は、実験を実行するたびに必要というわけではありませんが、少なくとも、安定性と用途に応じて、アゴニストの新しいバッチごとに、できればより頻繁に行う必要があります。実際、規格が利用可能になれば、国際標準化団体が明確にすることができます。

ここで示した例は、血小板凝集を測定する際のCRP-XLに関するものですが、バイオアッセイにおける生体分子の生物学的活性を比較するプロトコルは、この分野に広く適用できます。

開示事項

著者は何も宣言していません。

謝辞

何一つ。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
4% sodium citrateSigma-AldrichS1804Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Sigma-Aldrich54457
CRP-XLPeptide Protein Research Ltd.A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir barsStago86921Consumables for aggregometer
GlucoseSigma-AldrichG7021
KClSigma-Aldrich P5405
MgCl2 Sigma-AldrichM4880
Na2HPO4Sigma-AldrichS5136
NaClSigma-AldrichSigma-Aldrich
NaHCO3Sigma-AldrichS6014
PrismGraphpadAnalysis software package
Platelet rich plasmaIsolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.

参考文献

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