Воспроизводимость и гармонизация в исследованиях с использованием биологических стандартов: на примере агониста тромбоцитов коллаген-связанного пептида

Резюме

В данной работе мы представляем метод стандартизации сшитого пептида, связанного с коллагеном, агонистом тромбоцитов (CRP-XL) с использованием аггрегометрии светопропускания. В то время как протокол нацелен на функцию тромбоцитов, экспериментальный процесс может быть применен к большинству биологических молекул и биотестов, чтобы обеспечить научную строгость и воспроизводимость.

Аннотация

Метрология - наука о измерении - это предмет, которому мало кто из ученых-биологов преподается в процессе обучения в ущерб себе; Применение простых процессов стандартизации в повседневной работе обеспечивает уверенность в данных и воспроизводимость в зависимости от расстояния и времени.

Этот метод демонстрирует, как стандартизировать основной лабораторный эксперимент, широко используемый в исследованиях гемостаза и клинической практике, в частности, измерение ответов на агонист рецептора тромбоцитарного коллагена (гликопротеин [GP]VI), сшитый пептид, связанный с коллагеном (CRP-XL), с помощью агрегометрии светопропускания (LTA). Использование этого подхода обеспечит внутрилабораторную воспроизводимость и межлабораторную гармонизацию, независимо от наличия агонистов или поставщика. Важно отметить, что этот метод применим и к другим агонистам тромбоцитов, и ко многим другим биологическим молекулам и биотестам.

Процесс, описанный ниже, включает в себя проведение серии 6-8-точечных разбавлений «стандарта» и «теста» (материала, который вы проверяете) и их параллельное выполнение в выбранном анализе (в данном случае LTA). CRP-XL используется при массовых/объемных концентрациях, но не каждый материал дает одинаковую биологическую активность при заданной концентрации, поэтому для сравнения стандартного и испытуемого материала и определения того, какая концентрация необходима для получения эквивалентной активности, делается серия разведений. Серия разбавления должна охватывать агрегацию от 0 до 100%. Данные строятся с помощью нелинейной регрессии, и определяется значение EC₅₀ для каждого образца (стандартного и тестового). Чтобы определить активность, разделите значение EC₅₀ стандарта на значение теста, чтобы определить, насколько он более или менее сильнодействующий, и соответствующим образом отрегулируйте концентрацию. Такой подход гарантирует, что одна и та же биологическая «активность» будет добавляться к анализу снова и снова.

Введение

Многие из нас используют биологические агонисты и антагонисты в своих экспериментах, чаще всего в биологическом анализе, который количественно оценивает их влияние на функцию клеток в определенных условиях. Метод, описанный здесь, предназначен для агониста тромбоцитов, связанного с коллагеном, сшитого (CRP-XL), агониста гликопротеина VI типа, который активирует тромбоциты и активность которого может быть измерена в различных анализах (агрегометрия светопропускания, микроскопия, проточная цитометрия, высвобождение Ca²⁺ и т. д.), но протокол стандартизации агонистов применим к любому биологическому агонисту/антагонисту и/или биотесту. Физические науки хорошо разбираются в использовании стандартов в своей повседневной работе, и компании, разрабатывающие биотерапевтические препараты в коммерческом секторе, понимают ценность использования референтных стандартов1, однако они по-прежнему недостаточно используются многими учеными-биологами, особенно в академическом исследовательском^{сообществе, и} их недостаточное использование негативно сказывается на качестве научной продукции.

CRP-XL является специфическим агонистом GPVI, который используется тромбоцитарным полем в течение десятилетий с момента его описания в 1995 году, помогая сообществу разграничить роль GPVI от роли других коллагенсвязывающих тромбоцитарных белков с момента ^3,4. Этот агонист может быть получен из различных коммерческих источников или произведен самостоятельно. Пептидный мономер может быть приобретен у поставщика, а затем сшит собственными силами, или это может быть сделано поставщиком за дополнительную плату. Дальнейшая экономия средств может быть достигнута за счет снижения требуемой чистоты при доставке (например, 70% против 95%). Также нет единого мнения о том, как следует хранить CRP-XL: некоторые выбирают криохранение, а другие — охлаждение, некоторые хранят материал лиофилизированным до использования, а другие хранят его в растворе (воде или буфере, в зависимости от предпочтений). Поэтому качество и состав лабораторных запасов не стандартизированы или гармонизированы. Поскольку этот агонист используется в определенной концентрации (масса/объем), а не в единицах активности, активность CRP-XL в одной лаборатории, например, в концентрации 1 мкг/мл, не будет такой же, как в другой. Стоит отметить, что другие агонисты тромбоцитов, используемые в этой области, уже стандартизированы (например, тромбин, который поставляется и используется в единицах активности, а не массы/объема), поэтому переход от массы/объема к единицам биологического не должен быть слишком сложным для сообщества. Следует также отметить, что реакция пациентов на агонисты тромбоцитов, включая СРБ-XL, варьирует с точки зрения их чувствительности к агонистам, а также их способности реагировать (степень ответа)⁵, поэтому еще более важно использовать в анализах последовательное количество активности агонистов.

Если агонисты тромбоцитов могут быть гармонизированы путем их использования с определенной активностью, а не с весом/объемом, можно гарантировать, что эксперимент в одной лаборатории будет напрямую сопоставим с экспериментом в других лабораториях и может быть точно воспроизведен с уверенностью. До тех пор, пока не будет достигнуто соглашение о том, как хранить и стандартизировать активность CRP-XL, важно проводить регулярные проверки материала, чтобы гарантировать его постоянство в течение месяцев/лет, в течение которых он используется.

Присвоение ценности деятельности для биологических стандартов должно осуществляться на основе совместных многоцентровых исследований (например, ^6,7) и требует специальных знаний. Необходимость установленных биологических стандартов для агонистов тромбоцитов была недавно подчеркнута совместным многоцентровым^{исследованием8}, проведенным при поддержке Международного общества тромбоза и гемостаза (ISTH); До тех пор, пока не появится международный стандарт CRP-XL, исследователи могут стандартизировать свои собственные материалы на местном уровне, чтобы обеспечить согласованность с течением времени, и чтобы новый материал, полученный коммерчески или собственными силами, имел сопоставимую активность с предыдущими препаратами, а также с другими препаратами.

протокол

Кровь должна быть взята у здоровых добровольцев и обработана в соответствии с местными правилами. Этот протокол измеряет агонист-индуцированную агрегацию тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме (PRP) с помощью агрегометрии светопропускания (LTA). ISTH предоставляет стандартизированные протоколы, в том числе метод 2013 года для подготовки PRP и LTA⁹.  Собирайте цельную кровь в 4% цитрат натрия в соответствии с рекомендациями ISTH в соответствии с правилами местного комитета по этике. Исключите доноров, принимавших какие-либо НПВП в течение последних 2 недель.

1. Процедура анализа

1. Возьмите аликвоту исходного CRP-XL и разбавьте его в пробирном буфере (Tyrodes¹⁰) (Таблица 1) до начальной концентрации, которая вызовет максимальную агрегацию (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже шага 1.3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В литературе концентрация 1 мкг/мл вызывает максимальную агрегацию, но в некоторых лабораториях для достижения того же эффекта требуются более высокие концентрации - скорректируйте серию разведения соответствующим образом
2. Сделайте соответствующую серию разбавлений со стандартом (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже шага 1.3 и Рисунок 1) таким образом, чтобы концентрации были такими же, как у исследуемого реагента.
3. Изготовьте серию 6-8-точечных разбавлений для теста и стандарта, опять же в буфере для анализа, который принимает реакцию агрегации от 100% до 0% агрегации. Пример, показывающий 8-точечную кривую концентрации ряда разбавлений, показан в таблице 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые лаборатории добавляют агонист в общей сложности 10% объема анализа, например, 50 мкл агониста на 450 мкл тромбоцитов, так что они разбавляют 10-кратную концентрацию до конечной 1-кратной концентрации в анализе, в то время как другие добавляют меньшие (более концентрированные) объемы агониста, например, 5 мкл агониста на 495 мкл тромбоцитов - просто убедитесь, что серия разведения подходит для анализа, принимая во внимание, как объемное смещение влияет на концентрацию тромбоцитов – опять же, будьте последовательны. В этом примере 30 мкл 10-кратного агониста добавляется к 270 мкл обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP).
4. После того, как тромбоциты отдохнут и будут готовы к использованию, натрите их в кюветы LTA, добавьте перемешиватель и дайте им нагреться до 37 °C в лунках для выдержки.
5. Как только температура нагреется, поместите кювету (кюветы) в агрегатометр и начните записывать следы (следы). Добавьте агонист (при перемешивании) и запишите данные.
6. Повторяйте шаг 1.4 для каждой концентрации теста и эталона до тех пор, пока не будут собраны данные, необходимые для построения кривых (примеры кривых показаны на рисунке 2).
7. Рассчитать эффективность испытуемого реагента относительно эффективности стандартного; Опять же, используйте любую метрику - максимальную агрегацию или площадь под кривой - при условии, что существует согласованность и модель анализа соответствующим образом соответствует данным.

2. Проверка кривых концентрации

1. Во-первых, убедитесь, что кривые реакции на концентрацию параллельны. Существует множество программных пакетов, которые делают это, но здесь процесс описан для Graphpad Prism (см. рис. 3).
   1. Введите данные так, чтобы log(концентрация) находился на оси X, а отклик (% максимальной агрегации/AUC) — на оси Y (рисунок 3A)
   2. Преобразование концентраций CRP-XL (Рисунок 3B)
   3. Выберите Non-Linear Regression (Нелинейная регрессия) из функций Analysis (Анализ) и используйте уравнение для стимуляции/торможения по принципу «доза-реакция».
   4. Выберите логарифм (агонист) и отклик (переменный наклон) - используйте 3- или 4-стороннюю аппроксимацию в зависимости от того, что лучше для данных.
   5. Определите, являются ли кривые параллельными, с помощью вкладки Compare (как показано на рисунке 3C) и нажмите кнопку, чтобы сравнить наборы данных, чтобы убедиться, что наклон (Уклон холма) и асимптоты ( Верх и Низ кривых) эквивалентны. В этом примере уклон холма для теста равен 2,279, а стандарт равен 2,025, что дает коэффициент 1,125.
   6. Если наклоны параллельны (например, критерий приемлемости отношения уклонов между 0,8-1,25) и асимптоты эквивалентны, продолжайте расчет потенции (EC₅₀), используя шаги 2.1.3 и 2.1.4. В приведенном здесь примере асимптоты были ограничены, так как вычисление на шаге 2.1.5 подтвердило, что асимптоты эквивалентны.
   7. Разделите значение EC₅₀ стандарта на значение теста, чтобы определить относительную эффективность. В приведенном здесь примере test/standard (0.07259/0.1498) = 0.4846, т.е. «тест» вдвое слабее стандарта.
   8. Скорректируйте массовую/объемную концентрацию с учетом разницы в эффективности, т.е. если стандарт использовался ранее в концентрации 1 мкг/мл, то новый материал будет использоваться в концентрации 1/0,4846 = 2,063 мкг/мл), чтобы обеспечить использование в экспериментах сопоставимых количеств активного материала

Результаты

На рисунке 1 приведено схематическое представление серии разбавлений, предназначенное для того, чтобы подчеркнуть, что серия разбавления необходима как для стандарта, так и для испытания. На рисунке 2A показаны трассировки агрегирования для стандарта, а тестовые данные показаны на рисунке 2B. При 0,075 мкг/мл наблюдается четкая реакция на стандарт, в то время как для теста соответствующая концентрация (0,075 мкг/мл) является плоской, т.е. отсутствует. Эти данные используются для построения последующих графиков, чтобы получить EC₅₀. В приведенном здесь примере для построения кривой «концентрация-реакция» и определения EC_{50 использовалась 100}%-ная максимальная агрегация, как показано на рисунке 3.

Рисунок 1: Графическое описание двух серий разведений теста (слева) и стандарта (справа). Начиная с максимальной концентрации (рекомендуемая концентрация: 10 мкг/мл CRP-XL), последовательные 1 из 2 разведений производятся параллельно в 8 точках (>3 log единицы). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Трассировки агрегации для стандартной (слева) и тестовой серии разведения (справа). По мере агрегации тромбоцитов (ось x) количество света, проходящего через образец и достигающего датчика, увеличивается (ось y). (А) Стандарт. (B) Тест. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Ввод и анализ данных. (A) Данные вводятся, (B) преобразуются и (C,D) анализируются на предмет параллелизма (попросите программное обеспечение определить, сопоставимы ли наклоны и асимптоты Хилла [C]). (E) Если кривые параллельны, определите потенцию (EC₅₀) с помощью аппроксимации кривой нелинейной регрессии. (F) Преобразованные данные на графике. Пожалуйста, обратитесь к методу для получения более подробной информации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Буфер Tyrodes9
Составляющих	Концентрация	Комментарии
NaCl	134 мМ
Дна2ХПО4	0,34 мМ
KCl	2,9 мМ
NaHCO3	12 мМ
4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинеэтансульфоновая кислота (HEPES)	20 мМ
Глюкоза	5 мМ
MgCl2	1 мМ	рН 7,3

Таблица 1: Состав буфера Tyrodes.

Серия 8-точечного разбавления
Разбавление 1	10 мкг/мл
Разбавление 2	5 мкг/мл
Разбавление 3	2,5 мкг/мл
Разбавление 4	1,25 мкг/мл
Разбавление 5	0,625 мкг/мл
Разбавление 6	0,3125 мкг/мл
Разбавление 7	0,15625 мкг/мл
Разбавление 8	0,073125 мкг/мл

Таблица 2: Пример, показывающий 8-точечный ряд разбавления.

Обсуждение

Как показано здесь, процесс стандартизации материалов очень прост. Несмотря на то, что для оценки новых партий материала и/или проверки того, что текущая партия стабильна и не теряет активности с течением времени, требуется некоторое время, наградой является то, что эксперименты воспроизводимы снова и снова и сравнимы по годам, а не только по сроку службы партии реагента. Это также означает, что другие исследователи могут точно воссоздать условия анализа, и что сообщество гармонизируется на глобальном уровне. Важнейшие этапы протокола включают сбор цельной крови и подготовку PRP⁹, а также точность при проведении серии разведений. Также важно убедиться, что испытуемая и стандартная кривые параллельны, прежде чем приступать к сравнению EC₅₀ . Если линии не параллельны или асимптоты не эквивалентны, это может указывать на то, что тестовый и стандартный материал в некоторой степени отличаются.

Каждый, кто работает в биологических науках, знает, что биологические анализы не всегда работают последовательно, поэтому нужно помнить об этом при оценке данных. В приведенном здесь примере, несмотря на то, что мы используем одни и те же доноры для измерения эффективности двух очень похожих, если не идентичных, материалов, склоны холмов и асимптоты не идентичны. Тем не менее, мы допускаем некоторую степень изменчивости и заключаем, что кривые в данном случае параллельны и, следовательно, пригодны для сравнения и корректировки потенции. Биологические молекулы большие и сложные, и посттрансляционные модификации во время производства могут повлиять на их эффективность в биотестах. Стандартизация биомолекул и биотестов не может быть осуществлена только с использованием массы или объема и должна осуществляться путем количественной оценки и сравнения биологической активности в биопробе¹¹. Необходимо использовать свою подготовку и опыт, чтобы оценить данные в контексте анализа.

Ограничения метода заключаются в том, что, хотя данные могут указывать на проблему с реагентом (реагентами), он не может сказать вам, в чем заключается проблема. Потребуется дальнейшая работа, чтобы определить, почему материалы не сопоставимы. В идеальном мире любой материал, критически важный для экспериментов и последующих научных выводов, должен быть проверен с помощью масс-спектроскопии, но это не всегда возможно. Тем не менее, если данные не сопоставимы, дальнейшее расследование все же оправдано в том или ином качестве. Еще одним ограничением этого подхода является время и ресурсы, необходимые для его выполнения. В идеале тест и стандарт должны быть сравнены на 3-6 донорах, чтобы обеспечить некоторую уверенность в определении биологической активности материала, но мы считаем, что это оправдано поддержкой воспроизводимости и надежности. Стандартизация биологического материала не требуется каждый раз, когда проводятся эксперименты, но, как минимум, это следует делать для каждой новой партии агонистов, желательно чаще, в зависимости от стабильности и использования. В самом деле, если стандарт будет доступен, это то, что международные организации по стандартизации могут внести ясность.

Несмотря на то, что приведенный здесь пример относится к CRP-XL в контексте измерения агрегации тромбоцитов, протокол сравнения биологической активности биомолекул в биотестах широко применим во всем секторе.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4% sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804	Anticoagulant dissolved in water9
4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)	Sigma-Aldrich	54457
CRP-XL	Peptide Protein Research Ltd.		A crosslinked, triple-helical peptide2,4 with the sequence GCP*(GPP*)GCP*G (single letter amino acid code: P* = hydroxyproline was obtained as a custom order from Peptide Protein Research Ltd.
Cuvettes and stir bars	Stago	86921	Consumables for aggregometer
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
MgCl2	Sigma-Aldrich	M4880
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	Sigma-Aldrich
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014
Prism	Graphpad		Analysis software package
Platelet rich plasma			Isolated from whole blood from healthy volunteers free of non-steroidal anti-inflammatory drugs for a minimum of 10 days8.