野生型雌性昆虫における卵巣発生の解剖と等級分け

要約

プロトコルはサーチライトのトラップと捕獲される野生型渡り鳥のメスの昆虫のために適した簡単で、容易な解剖方法を示す。この手法は、野生型雌昆虫の交尾嚢と卵巣の発達という両方の生殖組織を比較することで、同じ種を有意に明らかにすることができます。

要約

渡り鳥の害虫は、世界中の食料生産と安全保障に深刻な課題をもたらしています。渡り鳥の害虫は、サーチライトトラップを使用して監視および捕獲できます。渡り性害虫予測の最も重要な手法の1つは、渡り鳥種を特定することです。しかし、ほとんどの場合、見た目だけでは情報を得ることは困難です。したがって、雌の生殖器系の系統的解析によって得られた知見を用いることは、サーチライトトラップで捕獲した野生型渡り昆虫の卵巣交尾嚢と卵巣発生の等級分けを組み合わせた解剖学的形態を理解するのに役立ちます。この方法の適用性を実証するために、卵巣の解剖学的構造については、 Helicoverpa armigera、 Mythimna separata、Spodoptera litura、 および Spodoptera exigua で卵巣の発達状態と卵粒の発達段階を直接評価し、卵巣交配嚢を Agrotis ipsilon、Spaelotis valida、Helicoverpa armigera、Athetis lepigone、Mythimna separata、Spodoptera litura、Mamestra brassicae、 および Spodoptera exiguaで研究しましたをクリックして、それらの関係を探ります。本研究では、野生型渡り昆虫を予測するための具体的な解剖法を示し、異なる渡り昆虫の固有の生殖システムを比較した。次に、両方の組織、すなわち卵巣と交尾嚢をさらに調査しました。この手法は、野生型雌性渡り昆虫の生殖器系の動態と構造発達の予測に役立つ。

概要

昆虫の移動は、中国で深刻な害虫として報告されているHelicoverpa armigera(ワタボリムシ)、Mythimna separate(東洋のアーミーワーム)、Spodoptera litura - タロイモの幼虫、Spodoptera exigua(ビートアーミーワーム)などの昆虫の世界的な昆虫分布の個体群動態に重要な役割を果たしています^1,2,3,4.長い移動距離、季節的な移動、渡り性害虫の高い繁殖力、および生態学的要因により、これらの害虫の予測、予測、および制御に大きな困難がもたら^{されました5。}病害虫の移動モニタリングは、気候変動やサイクルに応じて渡り病害虫を促進する適応性と行動変化を明らかにするために^{必要です6。}成長、繁殖、生存を維持するために、昆虫は進化の過程で連続的な適応性を獲得してきました。この一連の適応生活は、長い移動過程における卵巣の発達の制御につながる遊走戦略など、生殖器系に多くの変化をもたらしました。

卵巣の発達は渡り性害虫によく見られ、個体数の増加に影響を与えます⁷。そのため、卵巣の発生は長い間、渡り病害虫研究のホットな話題となってきました。一連の研究により、いくつかの卵巣発達指標と分類戦略が導かれました。これまで、卵巣の発達を解析するためにいくつかの方法が用いられてきたが、例えば、Loxostege sticticalis(草原の蛾の子房の発達で、初期の羽毛期、初期産卵期、産卵期、産卵期8の終わり^{を含む)がある}。一部の研究者は、S. exigua - ビートアーミーワーム、Pseudaletia unipuncta - 真のアーミーワーム、Cnaphalocrocis medinalis - イネの葉フォルダーなど、移動性の鱗翅目害虫の卵黄色の発達に基づいて卵巣レベルを分割しています^9,10,11,12.これまでの研究では、ワタボシやイネの葉のローラーなどの病害虫の卵巣発育レベルは、卵黄の堆積段階、卵粒の成熟段階、成熟した出産待機段階、卵形成のピーク期、産卵終了段階の5段階に分けられていました^13,14。ヨーロッパトウモロコシの卵巣の発達は、卵黄の堆積段階、卵の成熟、卵の配置前、産卵のピーク期、産卵末期の6つの発生段階に分けられました¹⁵。

さらに、同じ属の昆虫でも、秋のアーミーワームである Spodoptera frugiperda の卵巣の発達レベルは、卵黄の堆積段階、分娩を待つ成熟期、産卵陽性のピーク、産卵期の終わりの4つの段階に分類されるなど、発達段階が異なります¹⁶。一方、ビート蛾である Spodoptera exigua の卵巣の発達には、透明、硝子体形成、卵の成熟、卵の放出、および後期産卵レベルの5つのレベルがあります¹⁷。

以前の研究では、卵黄の色成熟度、産卵、卵子の発育を使用して、単一卵巣から多発卵巣の発達レベルまでしか分類できませんが、生殖器系の解剖学的構造に基づいて分類することはできません。形態形成の解剖学的構造に基づく卵巣の発達は、あまり研究されていない分野です。ここでは、2種類の卵巣組織を用いて集団内の渡り雌を予測し、卵巣の発達段階と交尾嚢の解剖学的形態形成に基づいて生殖動態を精緻化し、渡り鳥の野生型雌を区別するための直接的な証拠を提供する解剖法を設計しました。

いくつかの研究によると、渡り鳥の昆虫種はサーチライトによって頻繁に捕獲された¹⁸。ほとんどの渡り性昆虫種の卵巣は、移動の初期段階で発生の初期段階にあり、移動の進行とともに卵巣レベルが上昇します。本研究では、サーチライトで捕捉された異なる雌集団害虫の2つの生殖組織を研究するために、卵巣発育グレードの解剖法について述べる。この手法は、渡り動態の解明研究だけでなく、昆虫の分類、昆虫生理学研究、病害虫予測、雌性害虫種の予測などの施設を前進させます。

プロトコル

注意: 野生型の渡り昆虫を捕獲する前に、安全対策に注意を払い、安全装備(手袋、長袖シャツ、ゴーグル)を着用することをお勧めします。また、他の安全上の問題やライトの過熱を避けるために、使用しないときはトラップをオフにしてください。体液や化学物質への暴露を防ぐために、手袋、ゴーグル、白衣の着用など、解剖前に安全プロトコルに従うことが重要です。

1. 渡り虫の捕獲

1. このプロトコルは、サーチライトランプを使用して昆虫を捕獲することから始めます。このプロトコルでは、テスト昆虫の源は済陽地区、済南都市、山東省、中国(36.977088° N、116.982747° E)です。
2. 錆びないスチール製のサーチライトランプ本体、長方形のボディであるボックス、出力1000WのGT75タイプのハロゲンヘッドランプを使用し、ヘッドランプを光源として中央に配置します。
3. 漏斗状の集虫水路をライトの内側と下部に置き、直径5cmの昆虫採集用の箱を置き、その後に60段の捕虫網袋(0.5m×0.5m)を置き、光で捕獲した昆虫を捕集します。既知の光の投影は、地上約500mです。
4. このプロトコルは野生型の女性および卵巣の発達の移動の原動力で強調する;したがって、さまざまな種類の昆虫を収集します(ここでは、2021年から2022年にかけて、4月から8月にかけて収集を行いました)。この実験では、小型で傷ついた昆虫の採集を避け、同じような大きさの大きな害虫を選びます。

2.昆虫の準備

1. 集めた昆虫を網袋(0.5m)から網かご(30cm×30cm)に移し、10%蜂蜜水の殺菌液を入れたシャーレを用意します(給餌は任意)。ケージを27±2°C、相対湿度65%±12%に置き、暗所で8〜12時間維持します。
2. 同じ日にケージ内を飛んだ野生型の雌を選び、慎重に個々のバイアルチューブに移し、各チューブを綿の蓋で閉じます。過度の圧力により害虫を傷つけたり傷つけたりする可能性のある直接の取り扱いは避けてください。
   注:すべての野生型雌は夜間に捕獲され、解剖は昼間に行われました。したがって、各実験は1日以内に行われました。

3. 昆虫麻痺法の準備(図1)

1. 選択した雌の害虫を真ん中のフライバイアルチューブに個別に入れ、ブローガンの針を握って_CO2 ガスを使用して雌に麻酔をかけ、軽度の麻痺を引き起こします。害虫が麻痺しているかどうかを確認するには、柔らかいブラシを使用して害虫をそっとつなぐか触れます。柔らかい刺激に反応しず、動かない場合は、麻痺が成功したことを示します。
   注:低温(-20°C)は、昆虫を麻痺させるための代替技術としても使用できます。

4.昆虫の解剖

1. 麻痺したばかりの女性を無水エタノール(10 mL)を含む解剖ペトリ皿に入れます。解剖中の鱗屑毛や翅の粉末の影響を避けるために、生きている昆虫または麻痺した昆虫に無水アルコールを浸透させ、きれいな水ですすいでください。
2. 2対の鉗子を使用して、胸部と腹部体の接合部から背翼を分離します。
3. 腹部を適量の水(深さ2〜5 mm)を含む新しい使い捨てシャーレに移し、解剖鉗子を使用して、尖った口から尾までの背側腹側線に沿って腹部外骨格をそっと剥がします。反対側でも同じ手順を繰り返し、きれいな水に入れて無傷の組織を分散させます。
4. 鉗子を使用して表皮脂肪組織を慎重に剥がし、卵巣をそっと引っ張って解放します。
5. 解剖鉗子を使用して、卵巣の周りの脂肪粒子やその他の臓器を優しく取り除きます。一般的に、害虫の卵巣は腹部の両側で内側に折りたたまれていることがほとんどで、卵巣を広げながら液体環境で操作しようとし、交尾嚢を真ん中からゆっくりと剥がし、卵管に付着した脂肪粒子を摘み取ります。
6. 卵巣と交配嚢を垂直の後端からそっと持ち、慎重に下向きに広げます。展開中の損傷を避けるために、卵巣を水を含む新しいまたは清潔なペトリ皿に移します。卵巣の先端を持ち、卵巣を内側に広げます。卵巣の損傷を避けるために、この手順を慎重に実行してください。

5. 卵巣組織の解剖学的構造に関するデータの解析

1. このステップでは、卵の色と大きさに従って、各昆虫の卵の発達を評価し、その成熟度を判断します。次に、卵子の発育に応じて卵巣のグレードを判断します。
   注:さまざまな卵巣の発達レベルの区分は、主に産卵前または卵黄の沈殿レベルでの産卵前に分割されます。昆虫の卵粒の発達は、卵黄の発生段階、卵黄の成熟段階、卵黄の終焉段階など、より明確にするためにさらに段階に分けられます。卵粒の成熟度は、卵の満腹度、色、大きさによって判断されます。
2. 解剖後、無傷の卵巣から雌の交尾嚢組織を分離し、ほとんどの交配嚢の解剖学的構造が種ごとに異なるため、形態を観察して種を区別します。したがって、交配嚢を使用して種を区別します。
3. このステップでは、卵巣の解剖学的構造を評価し、卵巣の発達の等級付けを分析します。卵巣組織を5つのグレード(グレード1からグレード5)に分けます。
   1. 組織を整理するために、次の変化と構造を探します:1年生(1)は発達の初期段階(乳白色の透明)、完全な腹部、柔らかく、脂肪体はふわふわ、明るい色、剥がれにくいです。2グレード(2)は卵黄の沈着段階であり、より長くて厚い卵巣管を観察した後、必要に応じて卵巣を別々にグレード付けします。3年生(3)は脂肪体が少なく、卵巣に付着した顆粒が少ない。小学4年生(4)は弾力性が低く、割れやすく、子宮管の真ん中に卵子が入ることもあります。5年生(5)は、脂肪体が少ない、またはまったくない、萎縮性で壊れやすい卵巣で識別しやすいです。
4. 実験的なニーズに応じてデジタルカメラを使用して画像をキャプチャします。

結果

卵の発育
上記のプロトコルは、卵巣内の卵子の発生を分析するために適用されました。この目的のために、まず、卵を4つの段階に分類し、卵の発育の初期段階と成熟段階をすべての種(ボールワーム、アーミーワーム、タロイモの幼虫、ビートガなど)で区別しました。ここでは、フェザリングの初期段階(乳白色の透明段階)が観察されました。 図2A は、?...

ディスカッション

卵巣分析法は、昆虫の飛翔と個体数の動きを解明して予測し、^19,20,21を予測し、昆虫の生理学的変異を詳しく説明するために、植物保護に日常的に使用されています。ボロワーム、アーミーワーム、タロイモの幼虫、ビートガなどの一般的な農業害虫の独特の移動と急速な分散能力により、他の地域からの予測が困難であ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Canon ( China ) co., LTD	EOS 800D
Dropper	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Ethanol absolute (99.7%)	Shanghai Hushi Laboratory Equipmentco., LTD
Forceps	Vetus Tools co., LTD	ST-14
GT75 type halogen headlamp (1000 W)	Shanghai Yadeng Industry co., LTD
Helicoverpa armigera, Mythimna separate, Spodoptera litura, Spodoptera exigua	Jiyang district, Jinan city, Shandong province, China
Measuring cylinder, beaker, flask	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Net bag	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		0.5 m
Net cages	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		30 cm x 30 cm
Petri dishes	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		60 mm diameter