야생형 암컷 곤충의 난소 발달 해부 및 등급

요약

이 프로토콜은 탐조등 트랩으로 포획한 야생형 철새 암컷 곤충에 적합한 간단하고 쉬운 해부 방법을 보여줍니다. 이 기술은 두 생식 조직, 즉 야생형 암컷 곤충의 짝짓기 주머니와 난소 발달을 비교하여 동일한 종을 크게 명확히 할 수 있습니다.

초록

철새 해충은 전 세계의 식량 생산과 안보에 심각한 문제를 제기합니다. 철새 해충은 탐조등 트랩을 사용하여 모니터링하고 포획할 수 있습니다. 철새 해충 예측을 위한 가장 중요한 기술 중 하나는 철새 종을 식별하는 것입니다. 그러나 대부분의 경우 외모만으로는 정보를 얻기 어렵습니다. 따라서 암컷의 생식기관을 체계적으로 분석하여 얻은 지식을 활용하면 탐조등 트랩으로 포획한 야생형 철새의 난소 짝짓기 주머니와 난소 발달 등급의 결합된 해부학적 형태를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 적용 가능성을 입증하기 위해 난소 해부학에 대해 Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura 및 Spodoptera exigua 에서 난소 발달 상태 및 난자 발달 단계를 직접 평가했으며 난소 짝짓기 주머니는 Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae 및 Spodoptera exigua에서 연구했습니다, 그들의 관계를 탐색합니다. 본 연구는 야생형 철새를 예측하기 위한 구체적인 해부방법을 제시하고, 철새에 따른 고유의 생식기관을 비교한다. 그런 다음 두 조직, 즉 난소와 짝짓기 주머니를 추가로 조사했습니다. 이 방법은 야생형 암컷 철새 곤충의 생식 시스템의 역학과 구조적 발달을 예측하는 데 도움이 됩니다.

서문

곤충의 이동은 중국에서 심각한 해충으로 보고된 Helicoverpa armigera - 면화 bollworm, Mythimna separate(동양 아미웜), Spodoptera litura - 토란 애벌레, Spodoptera exigua - 사탕무 아미웜과 같은 곤충의 전 세계 곤충 분포의 개체군 역학에 중요한 역할을 합니다 1,2,3,4 . 긴 이동 거리, 계절적 이동, 철새 해충의 높은 번식력, 생태학적 요인으로 인해 이러한 해충의 예측, 예측 및 통제에 큰 어려움이 있습니다⁵. 해충 이동 모니터링은 기후 변화 또는 주기에 따라 철새 해충을 촉진하는 적응성과 행동 변화를 밝히기 위해 필요하다⁶. 성장, 번식 및 생존을 유지하기 위해 곤충은 진화 과정에서 순차적 적응성을 획득했습니다. 이러한 일련의 적응 생활은 긴 이동 과정에서 난소 발달을 통제하는 이동 전략과 같은 생식 기관에 많은 변화를 일으켰습니다.

난소 발달은 철새 해충에서 흔히 발생하며, 이는 개체군의 성장에 영향을 미친다⁷. 따라서 난소 발달은 오랫동안 철새 해충 연구의 뜨거운 주제였습니다. 일련의 연구를 통해 여러 난소 발달 지표와 분류 전략이 도출되었습니다. 지금까지는 난소 발달을 분석하기 위해 여러 가지 방법이 사용되었는데, 예를 들어 Loxostege sticticalis - 초원 나방의 난소 발달은 초기 깃털 단계, 초기 산란 기간, 산란 기간 및 산란 종료⁸을 포함합니다. 일부 연구자들은 S. exigua(사탕무 아미웜), Pseudaletia unipuncta(진정한 아미웜), Cnaphalocrocis medinalis(벼잎 폴더 등)와 같은 철새 나비목 해충의 난황 발색을 기준으로 난황 수준을 나눕니다.^9,10,11,12. 선행 연구에서 목화충, 벼잎깍지와 같은 해충의 난소 발달 수준은 난황 침착 단계, 알갱이 성숙 단계, 성숙 출산 대기, 난소 형성 피크 기간, 산란 종료 단계의 5단계로 나뉘었다^13,14. 유럽 옥수수 천공충의 난소 발달은 난황 침착 단계, 알 성숙, 알 전 배치, 최대 산란 단계 및 최종 산란 단계¹⁵의 6가지 발달 단계로 나뉩니다.

더욱이, 같은 속의 곤충은 난소 발달 단계(가을 아미웜)의 난소 발달 수준과 같이 발달 단계가 다르며, 난황 침착 단계, 성숙한 출산 대기, 최대 난소 양성, 최종 산란 단계¹⁶의 네 단계로 나뉩니다. 한편, 사탕무나방인 Spodoptera exigua의 난소 발달은 투명, 유리체 형성, 난자의 성숙, 난자 방출, 늦은 알을 낳^{는 등의 5}단계로 나뉜다.

이전 연구에서는 난황, 산란, 난자 발달의 색 성숙도를 사용하여 단일에서 다발성 난소 발달 수준까지만 분류할 수 있지만 생식계의 해부학적 구조에 따라 분류할 수 없습니다. 형태 형성 해부학에 기초한 난소의 발달은 덜 연구된 영역입니다. 여기서 해부법은 두 가지 난소 조직 유형을 사용하여 개체군에서 이주하는 암컷을 예측하고, 난소 발달 단계와 짝짓기 주머니의 해부학적 형태 기전을 기반으로 생식 역학을 정교화하여 이주하는 야생형 암컷을 구별할 수 있는 직접적인 증거를 제공하도록 설계되었습니다.

일부 연구에 따르면 이동하는 Noctuidae 곤충 종은 탐조등에 의해 자주 포착된다¹⁸. 대부분의 철새 Noctuidae 곤충 종의 난소는 이동 초기 단계에서 발달 초기 단계에 있으며 철새 진행에 따라 난소 수준이 증가합니다. 이 연구에서는 서치 라이트로 포착 된 서로 다른 여성 인구 해충의 두 생식 조직을 연구하기 위해 난소 발달 등급에 대한 해부 방법을 설명합니다. 이 방법은 철새 동태를 이해하기 위한 연구를 발전시킬 뿐만 아니라 곤충 분류, 곤충 생리학 연구, 해충 예측, 암컷 해충 종 예측 등의 기능을 제공합니다.

프로토콜

알림: 야생형 철새를 잡기 전에 안전 측정에 주의하고 안전 장비(장갑, 긴팔 셔츠, 고글)를 착용하는 것이 좋습니다. 또한 다른 안전 위험 및 조명 과열을 방지하기 위해 사용하지 않을 때는 트랩을 끄십시오. 체액 및 화학 물질에 대한 노출을 방지하기 위해 장갑, 고글, 실험실 가운을 착용하는 것과 같은 해부 전에 안전 프로토콜을 따르는 것이 중요합니다.

1. 철새의 포획

1. 탐조등 램프를 사용하여 곤충을 포획하여 이 프로토콜을 시작합니다. 이 프로토콜에서 테스트 곤충 출처는 중국 산둥성 지난시 지양구(북위 36.977088°, 동경 116.982747°)입니다.
2. 녹슬지 않은 강철로 만들어진 탐조등 램프의 본체, 직사각형 몸체인 상자, 1000W의 출력을 가진 GT75형 할로겐 헤드램프를 사용합니다.
3. 깔때기 모양의 곤충 수집 채널을 조명 내부와 바닥에 놓고 직경 5cm의 곤충 수집 상자를 놓고 빛에 갇힌 곤충을 수집하는 데 사용되는 60개의 곤충 수집 그물 가방(0.5m x 0.5m)을 놓습니다. 알려진 빛의 투영은 지상에서 약 500m입니다.
4. 이 프로토콜은 야생형 암컷의 이주 역학과 난소 발달을 강조합니다. 따라서 다양한 종의 곤충을 수집하십시오(여기서는 2021년부터 2022년까지 4월부터 8월까지 수집했습니다). 크기가 작고 다친 곤충을 수집하지 말고 이 실험을 위해 비슷한 크기의 큰 해충을 선택하십시오.

2. 곤충의 준비

1. 수집된 모든 곤충을 그물 주머니(0.5m)에서 그물 케이지(30cm x 30cm)로 옮긴 다음 10% 꿀물의 살균 용액이 포함된 페트리 접시를 제공합니다(먹이는 선택 사항). 케이지를 27 ± 2°C, 65% ± 12% 상대 습도에 놓고 8-12시간 동안 어두운 곳에 보관합니다.
2. 같은 날 케이지 내부로 날아간 야생형 암컷을 선택하여 개별 바이알 튜브에 조심스럽게 옮기고 면 뚜껑으로 각 튜브를 닫습니다. 과도한 압력으로 인해 해충을 손상시키거나 다치게 할 수 있는 직접적인 취급을 피하십시오.
   참고: 모든 야생형 암컷은 야간에 포획되었고 해부는 낮에 수행되었습니다. 따라서 각 실험은 하루 이내에 수행되었습니다.

3. 곤충 마비 방법의 준비(그림 1)

1. 선택한 암컷 해충을 중간에 있는 플라이 바이알 튜브에 개별적으로 넣고 블로우 건 바늘을 잡고_CO2 가스를 사용하여 암컷을 마취하여 경미한 마비를 일으킵니다. 해충이 마비되었는지 여부를 확인하려면 부드러운 브러시를 사용하여 해충을 부드럽게 찌르거나 만집니다. 부드러운 자극과 부동성에 대한 반응이 없으면 마비가 성공했음을 나타냅니다.
   알림: 저온(-20°C)은 곤충을 마비시키는 대체 기술로도 사용할 수 있습니다.

4. 곤충의 해부

1. 갓 마비된 여성을 절대 에탄올(10mL)이 포함된 해부 페트리 접시에 넣습니다. 해부 중 비늘 털과 날개 가루의 영향을 피하려면 살아있는 곤충이나 마비된 곤충에 절대 알코올을 침투시키고 깨끗한 물로 헹굽니다.
2. 두 쌍의 집게를 사용하여 가슴과 복부의 접합부에서 등쪽 날개를 분리합니다.
3. 적절한 양의 물(2-5mm 깊이)이 들어 있는 새로운 일회용 페트리 접시에 복부를 옮기고 해부 집게를 사용하여 뾰족한 입에서 꼬리까지 등쪽 복부 선을 따라 복부 외골격을 부드럽게 벗겨냅니다. 반대쪽도 같은 단계를 반복한 다음 깨끗한 물에 넣어 손상되지 않은 조직을 분산시킵니다.
4. 집게를 사용하여 표피 지방 조직을 정중하게 벗겨내고 난소를 부드럽게 당겨 풀어줍니다.
5. 해부 집게를 사용하여 난소 주변의 지방 입자와 기타 장기를 부드럽게 제거합니다. 일반적으로 해충 난소는 대부분 복부 양쪽에서 안쪽으로 접혀 난소를 펼치면서 액체 환경에서 작동하려고 시도하고 중간에서 교미 주머니를 천천히 벗겨내고 난소관에 붙어있는 지방 입자를 골라냅니다.
6. 수직 뒤쪽 끝에서 난소와 짝짓기 주머니를 부드럽게 잡고 조심스럽게 아래쪽으로 펼칩니다. 펼치는 동안 손상을 방지하려면 난소를 물이 들어 있는 새 접시 또는 깨끗한 페트리 접시에 옮기십시오. 난소 끝을 잡고 난소를 안쪽으로 펼칩니다. 난소의 손상을 방지하기 위해 이 단계를 조심스럽게 수행하십시오.

5. 난소 조직 해부학을 위한 데이터 분석

1. 이 단계에서는 알의 색상과 크기에 따라 각 곤충의 알 발달을 평가하여 성숙도를 판단합니다. 그런 다음 난자 발달에 따라 난소 등급을 판단합니다.
   참고: 다양한 난소 발달 수준의 구분은 주로 난자를 낳기 전 또는 난황 강수 수준으로 나뉩니다. 곤충의 달걀 알갱이 발달은 난황 발생 단계, 난황 성숙 단계 및 난황 소멸 단계와 같은 보다 명확한 단계로 더 나뉩니다. 달걀 알갱이의 성숙도는 달걀의 충만함, 색, 크기에 따라 성숙도를 판단합니다.
2. 해부 후 암컷의 짝짓기 주머니 조직을 온전한 난소에서 분리하고 대부분의 짝짓기 주머니 해부학이 종마다 다르기 때문에 형태를 관찰하여 종을 구별합니다. 따라서 짝짓기 주머니를 사용하여 종을 구별하십시오.
3. 이 단계에서 난소 해부학을 평가하고 난소 발달 등급을 분석합니다. 난소 조직을 5개의 등급(1등급에서 5등급)으로 나눕니다.
   1. 조직을 구성하기 위해 다음과 같은 변화와 구조를 찾으십시오 : 1 학년 (1)은 발달 초기 단계 (유백색 투명), 전체 복부, 부드럽고 뚱뚱한 몸은 푹신하고 밝은 색이며 껍질을 벗기기 어렵습니다. 2등급(2)은 난황 침착 단계이며 더 길고 두꺼운 난관을 관찰한 후 필요한 경우 난소를 별도로 등급을 매깁니다. 3학년(3)은 뚱뚱한 몸체가 적고 난소에 붙어있는 과립이 몇 개뿐입니다. 4학년(4)은 탄력이 떨어지고 깨지기 쉬우며, 자궁관 중간에 난자가 있을 수 있습니다. 5학년(5)은 뚱뚱하거나 전혀 체지방이 적거나 전혀 없고, 위축되고 연약한 난소를 쉽게 식별할 수 있습니다.
4. 실험적 필요에 따라 디지털 카메라를 사용하여 이미지를 캡처합니다.

결과

달걀의 발달
위의 프로토콜은 난소에서 난자의 발달을 분석하기 위해 적용되었습니다. 이를 위해 첫째, 알을 일반적으로 4단계로 분류하여 모든 종(예: 볼웜, 아미웜, 토란 애벌레, 사탕무나방) 중에서 알의 발달 초기 단계와 성숙 단계를 구분하였다. 여기에서 깃털 형성의 초기 단계 (유백색 투명 단계)가 관찰되었습니다. 그림 2A 는 난소가 아직 발달하기 시작...

토론

난소 분석 방법은 식물 보호에 일상적으로 사용되며, 19,20,21을 예측하기 위해 곤충의 비행 및 개체군의 이동을 설명하고 곤충의 생리적 변화를 자세히 설명합니다. 볼웜, 아미웜, 토란 애벌레, 사탕무 나방과 같은 일반적인 농업 해충의 독특한 이동과 빠른 분산 능력으로 인해 다른 지역에서 예측하기 어려운 것으로 나타났습?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Digital camera	Canon ( China ) co., LTD	EOS 800D
Dropper	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Ethanol absolute (99.7%)	Shanghai Hushi Laboratory Equipmentco., LTD
Forceps	Vetus Tools co., LTD	ST-14
GT75 type halogen headlamp (1000 W)	Shanghai Yadeng Industry co., LTD
Helicoverpa armigera, Mythimna separate, Spodoptera litura, Spodoptera exigua	Jiyang district, Jinan city, Shandong province, China
Measuring cylinder, beaker, flask	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Net bag	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		0.5 m
Net cages	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		30 cm x 30 cm
Petri dishes	Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD		60 mm diameter