新しい音響マイクロトランスミッターを用いたアメリカシャッドの稚魚を移植するためのハンドリングとタグ付け技術

要約

この記事では、最適な取り扱い方法と、アコースティックマイクロトランスミッターをアメリカンシャッドの幼魚に埋め込むための詳細な手順を提供します。私たちの実験室での研究の結果は、これらのタグ付け技術が、生存率の高いアメリカシャッドの稚魚の野外調査に実装できることを示唆しています。

要約

水力発電システムを通過するアメリカシャッドの幼魚(Alosa sapidissima)の行動と生存をよりよく理解するためのテレメトリー技術の使用は、シャッドが特に取り扱いに敏感であることが広く知られているため、困難でした。この研究の目的は、タグ付けプロセスの有害な影響を最小限に抑え、アメリカシャッドの稚魚のタグ付け後の生存率を最大化する、新しい音響マイクロトランスミッターを使用したタグ付けプロトコルを開発することでした。タグ付けの前後に水域外での取り扱いを制限し、汽水域の塩水(1000分の7.5)を使用することで、簡単な胸部移植法でタグ付けされたシャッドの生存率が向上しました。このプロトコルは、アコースティックトランスミッターで幼魚シャッドにタグを付けるための詳細なステップバイステップの手順を提供します。この手順でタグ付けし、実験室で60日間保持した魚の生存率は81.5%であったのに対し、タグを付けていない魚の生存率は70%でした。この研究で開発されたタグ付けと取り扱いの手法は、稚魚シャッドやその他の敏感な種のフィールドテレメトリー研究に適用できる可能性があります。

概要

アメリカンシャッド(Alosa sapidissima)は、米国東海岸原産の溯河性魚種です。生息地の利用可能性の低下と水力発電ダムの開発の増加により、シャッドの個体数は本来の生息域全体で減少しています^1,2。稚魚のシャッドやその他のアロジンは、海への回遊時に、水力発電構造を通過するときに特に怪我や死亡の影響を受けやすい可能性があります^3,4,5。水力発電ダムでの稚シャッドの通過と生存率を理解することは、これらの施設の再認可や種の回復の取り組みに情報を提供するために重要です。しかし、アメリカシャッドが海に回遊する際の通過率と生存率を評価するためのタグ付け技術は成功していません。テレメトリ研究のために送信機でタグ付けされたシャッドは、タグ付けされていない推論の母集団を代表するべきであり、タグまたはタグ付けプロセスによって悪影響を受けてはなりません^6,7。

太平洋岸北西部国立研究所(PNNL)は、稚魚のシャッドを追跡する能力を向上させるため、アメリカシャッドや同様の圧縮体型を持つ他の魚種を研究するための新しい音響マイクロトランスミッターを開発しました。アメリカンシャッドやその他のアロジンを研究する上での一般的な課題の1つは、他の種と比較して、取り扱い、輸送、タグ付けに対する感受性です。例えば、Raquelらは、彼らの研究において、アメリカシャッドの稚魚のハンドリングとトラック輸送の死亡率が、他の5種の稚魚よりも一貫して^{高いことを発見しました。} アメリカシャッドの稚魚にタグを付ける取り組みを評価した数少ない研究発表では、7日後に2%^から 9、タグ付け後48時間後には100%まで、幅広い生存率が報告されており^10、 タグ付けされた幼魚シャッドの長期生存率と伝達物質の保持に関する情報はほとんどありません。

アメリカシャッドのような繊細な種の取り扱いとタグ付けを成功させるための課題は、その移動、行動、生息地の利用に関する知識のギャップに光を当てています。水力発電ダムを通る動きを追跡する能力は、アメリカンシャッドの通過と生存率の理解を大きく前進させるでしょう。これは、既存の水力発電施設の管理上の決定や、これまで研究されていなかった魚種やライフステージへの影響を最小限に抑えるシステムの新しい設計に役立つでしょう。新しい変換器技術が開発されるにつれて、バイアスを最小限に抑え、継代と生存率を正確に評価するために、変換器とタグ付けプロセスの影響を理解することが不可欠です。この研究の目的は、新しい音響マイクロトランスミッターでタグ付けされたアメリカシャッドの稚魚の60日間の生存率を評価し、シャッドに対するタグ付けの悪影響を軽減し、タグ付けされていないシャッドと比較できるようにする取り扱いおよびタグ付けプロトコルを提供することでした。

プロトコル

PNNLは、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Careの認定を受けています。アメリカンシャッドは、実験動物の飼育と使用に関する連邦ガイドライン¹¹に従って取り扱われ、私たちの研究のプロトコルは、PNNLの施設動物ケアおよび使用委員会に準拠して実施され、承認されました。

1. タグ付け後回収タンクの準備

1. 汽水域の塩水(7.5 ppt)が容易に入手できない場合は、放出前の1〜2日間、適切な曝気と循環でシャッドを保持するための静的システムを使用します(図1)。
2. 静的な円形タンクには、エアリフトシステムを設置して曝気を行います。タンクの側面に塩ビパイプを接続して、ティーが上部にあり、別のティーが中央近くにあり、ふるい分けされたフィッティングがパイプの下部にねじ込まれるようにします。
3. 次に、エアストーンを圧縮空気ラインに接続し、エアストーンをパイプの下部のスクリーンの近くに置きます。
   注意: スクリーンは、魚が空輸システムに泳ぐのを防ぎます。
4. 空輸の出口ポート(中央のPVCティー)が約半分水没するまで、タンクに真水を入れます。次に、水を止めます。
   1. 次に、ポートから出る曝気された水が魚の向きを示す方向の流れを作り出すまで、空気の供給量を増やします。
5. 市販の海塩を加えて7.5pptの汽水塩水を作り、溶けるまでかき混ぜます。

2.海水魚源バケツと塩水麻酔液の準備

1. 水0.5Lあたり海塩7.5gを計量し、バケツに溶かします。
   注:ステップ3.5では、シャッドを含む同量の淡水を加えて、最終濃度を7.5pptにします。
2. 別のバケツで、水1リットルあたり7.5gの海塩を測定して溶かします。
   1. 塩水1リットルあたり120 mgの重炭酸ナトリウムで緩衝した120 mgのトリケインメタンスルホン酸塩(MS-222)を追加します。
   2. 麻酔薬バケツに補助空気を追加します。

3. 汽水域の塩水への水から水への移動によるシャッドの収集

1. 別のバケツに真水を部分的に入れ、事前にタグ付けされたソースタンクに横向きに置きます。
2. ネットや手を使って、シャッドをバケツに泳がせるようにそっと誘導します。
3. 適切な数の魚がバケツに入ったら、バケツを直立させ、穴の開いた蓋で固定します。
4. 蓋から余分な水を注ぎ、魚を淡水の目標量(つまり、最終的な7.5pptの塩水源バケツの半分の容量)に保ちます。
5. シャッドと淡水を、手順2.1で準備した塩水源バケツにそっと注ぎます。
   注:最終的な塩分濃度は7.5pptになります。
6. 水槽のエアポンプとエアストーンを使用して、タグ付け前の魚源バケットに補助空気を供給し、溶存酸素を許容レベル(>90%の飽和度が理想的)に維持します。

4. シャッドへの音響発信器の埋め込み

1. 変換器を70%エタノールで20分間消毒し、使用前に滅菌水ですすいでください。
2. 滑らかで極細なメッシュ(~0.4 mm)のディップネットを使用して、魚をソースバケツから麻酔バケツに入れます。シャッドは、水温やその他の水質パラメータに応じて、2~3分で平衡と脊髄反射を失うはずです。
3. ステージ⁴¹²まで完全に麻酔をかけたら、手袋をはめた手を使って魚を濡れた測定板にそっと置き、長さを測ります。
4. 風袋引きスケールで水で満たされた計量ボートに魚を移し、その重量を取得します。
5. 体長と体重、音響タグコード、および鱗の喪失や出血など、タグ付け前の魚の状態に関するコメントを記録します。
6. 麻酔薬の塩水で満たされた移送容器に魚を入れ、音響トランスミッターと一緒に魚の外科医に届けます。
7. 魚の左側を下にして、V溝で準備した濡れた耐水性のフォームパッドの上に置きます(図2A)。
   注意: V溝は、手順中に魚が滑りすぎないようにし、魚の口の周りに水が溜まるようにして、鰓に積極的に水を吸い込むことができます。
8. 重力給水タンクに取り付けられたチューブを介して魚の口に淡水を供給します。
9. 消毒済みまたは新品の#11ステンレス鋼手術用ブレードを使用して、胸鰭の遠位端近くの子宮筋の間に長さ3mmの切開を行います。
10. 必要に応じて、魚の皮膚を塞いでいる場合は、ブレードの先端にあるスケールを取り除きます。
    1. トランスミッターを切開部に慎重に挿入し、タグ全体が体腔内に収まるまで後方に押し込みます(図2B)。
    2. 必要に応じて、メスの鈍い端(または先端の細い鉗子)を使用して、タグを慎重に完全に挿入します。
11. タグを付けた魚を曝気のある7.5pptの塩水の小さな容器に入れて、魚が麻酔から回復できるようにします。
12. 魚が平衡を取り戻したら、回収容器から7.5pptの塩水が入ったタグ付け後の保持タンクに水から水への移し替えを行います。
13. タグ付けされた魚を放流前に1〜2日間塩水で回復させます。

結果

稚シャッドのタグ付けの有効性に対処するために、2020年の予備試験と2021年の長期保持試験の2つの一連のタグ付け評価が実施されました。2020年11月にPNNLで予備的な実験室評価が実施され、新しい音響マイクロトランスミッターをアメリカンシャッドに移植するための好ましい方法が決定されました。プロトタイプの送信機の設計(n = 4、P1-P4)を、異なるタグ付け位置(胃、胸、骨盤、および背側)と組み合わせて、合計4つの独自の音響送信機タグ付け位置処理(n = 40匹の魚を処理、 表1)しました。すべての試験魚は、処理水槽と飼育水槽に無作為に割り当てられました。試験魚は、2つの飼育水槽で、各処理から同数の魚(つまり、処理ごとに20匹)で14日間保持されました。評価の最初の 2 日間、シャッドは汽水域の塩水 (7.5 ppt) に保持され、タグ付けと取り扱いから回復しました。その後、タンクは評価期間の残りの間、フロースルー淡水に切り替えられました。

予備評価では、タグ付き魚とフィンクリップコントロールのサイズは、フォークの長さが50〜80mmの範囲でした。稚シャッドの生存率とタグ保持率は、他のタグ付け技術と比較して、胸部切開によって移植された魚で最も高かった(図3)。また、追加のパイロット評価では、水から水への移動などの取り扱い技術や、タグ付けなどのストレスの多いイベントの前後の汽水域の塩水での魚の保持が、生存率の向上に不可欠であることが示されました。

2021年にPNNLで、予備評価で成功したタグ付けと取り扱いのプロトコルを使用して、胸部切開タグ法を使用して音響送信機を移植した幼魚アメリカンシャッドの長期60日生存率とタグ保持を評価する実験室研究が実施されました。長期評価では、予備評価で使用したP1の設計と形状とサイズが類似した改良されたプロトタイプ設計であるダミー送信機P5(図4)を使用しました。ダミーP5タグの平均寸法・重量は、長さ7.6mm×直径2.3mm、空気中重量0.058g(標準偏差0.002g)で、タグの負担は<1%でした。機能部品を備えた音響トランスミッタのプロトタイプ(図4)は、長さ7.6 mm x 直径2.0 mmの寸法で、空気中の重量は0.050 gです。

長期評価に用いたアメリカンシャッドの稚魚は、試験時に4ヶ月間飼育下に置いていた。この実験は、2つの水槽に同数の処理魚と対照魚を60日間保持するように設計されましたが、タグ付け時の残りのシャッドの数は少なかった。したがって、シャッドに対するタグ付け技術の長期的な有効性をよりよく理解するために、対照群よりも多くのシャッドが対照群よりもタグ付けされた治療群にランダムに割り当てられました。2つの水槽には、それぞれ27匹の処理魚と9匹または10匹の対照魚がいました。しかし、タンクA(13.8%)の生存率はタンクB(78.4%)よりも有意に悪かったため、フィッシャーの正確検定、 p < 0.001)で、各タンク内のタグ付きグループとコントロールグループの間に生存率に差はなかったため、ここではタンクBの結果のみが含まれています。

シャッド(フォークの長さ69-105 mm、重量3.9-11.7 g)は、胸部切開を使用してP5トランスミッターでタグ付けされるか(n = 27)、対照群に割り当てられました(n = 10)。対照魚は、手術パッドに~20秒間置かれるなど、同じ手順で取り扱われましたが、フィンクリップや切開は受けず、送信機も埋め込まれませんでした。タグ付け後、両方の処理群を汽水塩水(7.5 ppt)で1日間保持し、その後、研究の残りの期間、フロースルー河川水に切り替えました。60日生存率は、タグ付き群で81.5%、タグなし対照群で70%でした(図5)。この評価におけるタグ付き魚の生存は、タグの排出をテレメトリー研究の死亡イベントと区別できないため、生存率とタグ保持の両方として定義されました。2群間で生存率に有意差はなかった(フィッシャーの正確検定、 P = 0.884)。しかし、サンプルサイズが小さいため、差を検出する検出力は38.4%でした。治療間の違いを検出する検出力は低かったが、長期評価の結果、この取り扱いおよびタグ付けプロトコルを使用して、アメリカンシャッドに音響送信機を移植するのに適度な成功を収めることができることが示された。

図1:汽水塩水で満たされたタグ付け後の回収タンク。 エアリフトシステムは、静的タンクに酸素を供給します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2: アメリカシャッドの幼魚の音響送信機の埋め込み。 アメリカンシャッドの幼魚(A)は胸部を切開し、(B)はダミーのP5トランスミッターを切開部に挿入した。シャッドの口は、青いチューブから流れる水に部分的に浸かっていることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3: 1群のタグなし対照群と4群のタグ付きアメリカンシャッド幼魚による予備的な14日間の評価における生存率。 タグ付けされた治療は、4つのタグ付け場所(胃、胸、骨盤、背)で構成され、それぞれが独自のトランスミッタープロトタイプ(P1-P4)とペアになっています。タグ付けされた魚の生存は、生存とタグ保持の両方として定義されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4: アメリカシャッドの幼魚にタグを付けるための音響送信機とダミー送信機。 (A)機能音響マイクロトランスミッター (B)60日間の実験室生存試験で使用されたダミーのP5プロトタイプ送信機。定規の4〜7の数字はセンチメートルを表していることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5: 60日間の長期保持試験におけるアメリカンシャッドの生存率。 幼魚シャッドは、タグなし(Untagged Controls;実線)またはタグ付き(Tagged [Pectoral P5];破線)のいずれかで、ダミーの送信機を使用しました。タグ付けされたグループの生存は、生存とタグ保持の両方として定義されました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

タグの種類	タグの場所	N	フォークの長さ(mm)		平均タグ重量 (SD; g)	タグ負担 (%)	生存率(%)	Mean Time to Tag/Clip (s) (タグ/クリップまでの平均時間)
			範囲	平均値 (SD)
P1の	胃	40	50 - 76	60 (6.0)	0.058 (0.003)	1.5 - 5.2	45	12
P2の	胸	40	50 - 78	60 (7.3)	0.039 (0.001)	1.0 - 3.2	80	23
P3の	骨盤	40	50 - 70	58 (5.3)	0.039 (0.001)	1.0 - 4.1	55	26
P4の	背	40	50 - 80	61 (6.8)	0.088 (0.004)	0	60	57
コントロール	NA(クリップ)	40	50 - 80	59 (5.7)	該当なし	0	92.5	14

表1:予備評価の一環として、プロトタイプの送信機(P1-P4)を移植した、または上尾鰭クリップと下尾鰭クリップ(コントロール)でマークされたアメリカンシャッドのタグ付けと生存情報。対照群のタグの位置は、これらの魚がフィンクリップ(クリップ)のみを受け取ったため、該当なし(NA)です。タグタイプP4は中性浮力設計であったことに注意してください。平均の標準偏差(SD)は括弧内にリストされています。

ディスカッション

水力発電施設周辺でのアメリカシャッドの稚魚の動きを研究する必要性から、タグ付きシャッドの生存率を向上させるための取り扱いとタグ付けのプロトコルの開発が促されています。PNNLでは、塩水を使わずに新しい音響発信器を幼魚シャッドに移植する最初の試みにより、24時間以内に100%の死亡率が得られました。その後、慎重に開発された取り扱いとタグ付けのプロトコルにより、アメリカンシャッドに音響マイクロトランスミッターを埋め込み、高い生存率(81.5%)で実験室で長期間保持できることが実証されました。タグ付けの前後に水外での取り扱いと汽水域の塩水の使用を最小限に抑えることは、アメリカシャッドの稚魚のタグ付けを成功させるために不可欠でした。

予備評価では、50mmほどの小さなシャッドに、4つの注入方法を用いてダミーの発信器をタグ付けしました。成体のシャッド13,14,15をタグ付けするための最も一般的な方法の1つである胃タグ付けは、パイロットテスト中に有望な結果を示しましたが、予備評価中にタグ損失の発生率が高かった。骨盤切開による移植は、成体のトウェイトシャッドの動きを研究するために成功裏に使用されており¹⁶、背中アタッチメントは幼体のアメリカンシャッド¹⁰の短期モニタリングに使用されています。最近では、胸部切開によるタグの埋め込みが、河川環境と海洋環境の両方での成体のシャッドの長期的な動きを研究するために使用されました¹⁷。PNNLでの予備評価では、胸部切開部位は評価された他の3部位よりも良好であり、タグ付け後の7日生存率は90%以上でした。

全体として、これらの評価の結果は、タグ付きシャッドの生存率は、音響送信機のバッテリー寿命(5秒ごとに音響信号が送信され、30~30日と予想される)を超えたタグなしシャッドの生存に匹敵することを示しました。

このトランスミッターの設計とタグ付けプロトコルは、アメリカシャッドのような小型で敏感で絶滅の危機に瀕している魚種を野外アプリケーションで研究するための大きな可能性を示しており、研究者は水力発電施設の近くで魚の動きに関する貴重な情報を得ることができます。例えば、このタグ付け技術は、水力発電ダムの余水吐や発電所に近づく際の音響タグ付き稚魚の挙動を研究するために、今後のフィールドアプリケーションで使用される予定です。河川での研究から得られた結果は、これらの施設での管理上の決定により良い情報を提供し、幼魚のライフステージ全体を通じて種を保護するのに役立ちます。今後の研究では、野外で河川に遡上する魚にタグを付け、追跡するためのこの手順の有効性を評価する必要があります。さらに、これらの技術は、シャッドやその他の敏感な種にパッシブ統合トランスポンダー(PIT)タグを埋め込むことに簡単に転用でき、ライフヒストリー全体を通じて長期的なモニタリングを提供できます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 stainless steel surgical blade	Exel	29502	purchased from Med-Vet International; no real preference on blade vendor
#11 stainless steel surgical blade	Miltex	MIL4-311	purchased from Med-Vet International; no real preference on blade vendor
2 gallon bucket	Leaktite	#2GL White Pail
acoustic transmitter for American shad	Pacific Northest National Laboratory	Patent-Pending	BattelleIPID: 32500
air stone	Pentair	AS3
aquarium air pump	Tetra	Whisper
dissolved oxygen meter	YSI	ProODO or ProSolo
ethanol	Decon Laboratories	2805HC
fine mesh net	Blue Ribbon	ABLEC8
fish holding tank	Reiff Manufacturing	NA	round aquaculture tank
foam garden kneeler	Tommyco	12003
plastic storage container	Ziploc	discontinued; 8oz container with lid
PVC cement	Oatey	30821
PVC pipe	Charlotte Pipe	NA	PVC Schedule 40 2" diameter
PVC primer	Oatey	30757
PVC tee	Charlotte Pipe	NA	2" PVC Schedule 40 S x S x S Tee
sea salt	InstantOcean	SS15-10
silicone tubing 3/16"	Pentair	tp30s	tubing to supply water during tagging
sodium bicarbonate	Fisher Chemical	S233-500
sterile water	NA	NA	water is sterilized using an autoclave
tricaine methanesulfonate	Syndel USA	15650
tubing for airline	Hydromaxx	1403038050