Técnicas de Manuseio e Marcação para Implantação de Shad Americano Juvenil com um Novo Microtransmissor Acústico

Resumo

Este artigo fornece um procedimento detalhado para práticas ideais de manuseio e implantação de um microtransmissor acústico em juvenis de sável americano. Os resultados de nosso estudo de laboratório sugerem que essas técnicas de marcação podem ser implementadas em estudos de campo de jovens americanos com alta probabilidade de sobrevivência.

Resumo

O uso de técnicas de telemetria para melhor compreender o comportamento e a sobrevivência de juvenis de sável americano (Alosa sapidissima), à medida que migram através de sistemas hidrelétricos, tem sido um desafio, pois o sável é amplamente conhecido por ser particularmente sensível ao manejo. O objetivo deste estudo foi desenvolver um protocolo de marcação usando um novo microtransmissor acústico que minimize os efeitos prejudiciais do processo de marcação e maximize a sobrevivência pós-marcação de juvenis de sável americano. A limitação do manuseio fora d'água e o uso de água salobra salobra (7,5 partes por mil) antes e depois da marcação melhoraram a sobrevivência do sável marcado usando um método simples de implantação peitoral. Este protocolo fornece um procedimento detalhado e passo a passo para a marcação de shad juvenil com transmissores acústicos. Os peixes marcados usando este procedimento e mantidos em laboratório por 60 dias tiveram uma taxa de sobrevivência de 81,5%, em comparação com 70% para seus homólogos não marcados. As práticas bem-sucedidas de marcação e manejo desenvolvidas neste estudo podem ser aplicadas a estudos de telemetria de campo de juvenis de sável e outras espécies sensíveis.

Introdução

O sável-americano (Alosa sapidissima) é uma espécie de peixe anádromo nativa da costa leste dos Estados Unidos. A redução da disponibilidade de habitat e o aumento do desenvolvimento de barragens hidrelétricas resultaram em declínios populacionais de sável em toda a sua área de distribuição nativa ^1,2. Juvenis de sável e outras alosinas, em sua migração para o oceano, podem ser especialmente suscetíveis a lesões e mortalidade ao passar por estruturas hidrelétricas ^3,4,5. Entender a passagem e as taxas de sobrevivência de juvenis de sável em barragens hidrelétricas é fundamental para informar o relicenciamento dessas instalações, bem como os esforços de restauração da espécie. No entanto, faltam técnicas de marcação bem-sucedidas para avaliar a passagem e as taxas de sobrevivência do sável americano à medida que migram para o oceano. O shad marcado com transmissores para estudos de telemetria deve ser representativo da população de inferência não marcada e não deve ser afetado negativamente pelo tag ou pelo processo de marcação ^6,7.

Para ajudar a melhorar a capacidade de rastrear juvenis de sável, o Laboratório Nacional do Noroeste do Pacífico (PNNL) desenvolveu um novo microtransmissor acústico para estudar o sável americano e outras espécies de peixes com tipos de corpo compressiformes semelhantes. Um dos desafios comuns de estudar o sável americano e outras alosinas é sua sensibilidade ao manuseio, transporte e marcação em comparação com outras espécies. Por exemplo, Raquel et ^al.8 verificaram que as mortalidades por manuseio e transporte rodoviário foram consistentemente maiores para juvenis de sável americano do que para as outras cinco espécies de peixes juvenis em seu estudo. Dos poucos estudos publicados que avaliaram os esforços para marcar o sável americano juvenil, uma ampla faixa de sobrevida foi relatada, de tão baixa quanto 2% após 7 dias⁹ e até 100% após 48 horas após a marcação¹⁰ e muito pouca informação sobre sobrevivência a longo prazo e retenção de transmissores para shad juvenil marcado está disponível.

Os desafios no manejo e marcação bem-sucedidos de espécies sensíveis, como o sável americano, lançaram luz sobre as lacunas de conhecimento sobre sua migração, comportamento e uso do habitat. A capacidade de rastrear o movimento através de barragens hidrelétricas avançaria muito a compreensão das taxas de passagem e sobrevivência do sável americano. Isso ajudaria a informar decisões de manejo para instalações hidrelétricas existentes e novos projetos para sistemas que minimizem os efeitos sobre as espécies de peixes e estágios de vida não estudados anteriormente. À medida que uma nova tecnologia de transmissor é desenvolvida, entender os efeitos do transmissor e o processo de marcação é imperativo para minimizar o viés e avaliar com precisão a passagem e a sobrevivência. Os objetivos deste estudo foram avaliar a sobrevida de 60 dias de juvenis de shad americano marcados com um novo microtransmissor acústico e fornecer um protocolo de manipulação e marcação que reduzisse os efeitos negativos da marcação no sável, tornando-os mais comparáveis aos seus homólogos não marcados.

Protocolo

O PNNL é credenciado pela Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care. O shad americano foi manuseado de acordo com as diretrizes federais para cuidados e uso de animais de laboratório¹¹, e os protocolos para o nosso estudo foram conduzidos de acordo e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do PNNL.

1. Preparação de um tanque de recuperação pós-marcação

1. Quando a água salobra salgada (7,5 ppt) não estiver prontamente disponível, use um sistema estático para segurar o barbear com aeração e circulação adequadas por 1-2 dias antes da liberação (Figura 1).
2. Em um tanque circular estático, instale um sistema de transporte aéreo para fornecer aeração. Conecte um tubo de PVC ao lado do tanque, de modo que uma camiseta esteja localizada na parte superior, outra camiseta fique perto do meio e um encaixe com tela seja rosqueado na parte inferior do tubo.
3. Em seguida, conecte uma pedra de ar a uma linha de ar comprimido e coloque a pedra de ar na parte inferior do tubo perto da tela.
   NOTA: A tela impede que os peixes nadam no sistema de transporte aéreo.
4. Encha o tanque com água fresca até que a porta de saída (tee de PVC médio) da ponte aérea esteja aproximadamente submersa. Em seguida, desligue a água.
   1. Em seguida, ligue e aumente o suprimento de ar até que a água aerada que sai do porto crie um fluxo direcional para os peixes se orientarem.
5. Adicione o sal marinho comercial para fazer uma solução salobra de água salobra de 7,5 ppt e mexa até dissolver.

2. Preparo de balde de fonte de peixe de água salgada e solução anestésica de água salgada

1. Meça 7,5 g de sal marinho para cada 0,5 L de água e dissolva em um balde.
   NOTA: Na etapa 3.5, um volume igual de água doce contendo o sável é adicionado para criar uma concentração final de 7,5 ppt.
2. Em outro balde, meça e dissolva 7,5 g de sal marinho para cada litro de água.
   1. Adicionar 120 mg de metanossulfonato de tricaína (MS-222) tamponado com 120 mg de bicarbonato de sódio por litro de água salgada.
   2. Adicione ar suplementar aos baldes anestésicos.

3. Coleta de sável com transferência de água para água salobra

1. Encha parcialmente outro balde com água fresca e coloque-o lateralmente no tanque de origem de pré-etiquetagem.
2. Use uma rede ou mão para guiar suavemente o barbear para nadar no balde.
3. Quando um número adequado de peixes estiver no balde, vire o balde na vertical e prenda-o com uma tampa perfurada.
4. Despeje qualquer excesso de água através da tampa, mantendo o peixe contido na quantidade alvo de água doce (ou seja, metade do volume do balde final de água salgada de 7,5 ppt).
5. Despeje suavemente o sável e a água doce no balde de água salgada preparado na etapa 2.1.
   NOTA: A salinidade final será de 7,5 ppt.
6. Forneça ar suplementar para o balde de fonte de peixe pré-etiqueta usando uma bomba de ar de aquário e pedra de ar para manter o oxigênio dissolvido em um nível aceitável (>90% de saturação é ideal).

4. Implantação de transmissor acústico em sável

1. Desinfetar os transmissores em etanol 70% por 20 min e enxaguar com água estéril antes do uso.
2. Usando uma rede de imersão com malha lisa e extrafina (~0,4 mm), retire um peixe do balde de origem e entre no balde anestésico. O shad deve perder o equilíbrio e os reflexos espinhais em ~2-3 min, dependendo da temperatura da água e de outros parâmetros de qualidade da água.
3. Uma vez totalmente anestesiado para o estágio^{quatro 12}, use uma mão enluvada para colocar suavemente o peixe em uma tábua de medição úmida para obter seu comprimento.
4. Mova o peixe para um barco de pesagem cheio de água em uma balança para obter seu peso.
5. Registre o comprimento e o peso, o código da etiqueta acústica e quaisquer comentários sobre a condição do peixe antes da marcação, como perda de escama ou hemorragia.
6. Coloque o peixe em um recipiente de transferência cheio de água salgada anestésica e entregue-o, juntamente com o transmissor acústico, ao cirurgião de peixes.
7. Coloque o peixe, do lado esquerdo virado para baixo, sobre uma almofada de espuma molhada e resistente à água, preparada com um sulco em V (Figura 2A).
   NOTA: O sulco em V evita que o peixe deslize muito durante o procedimento e permite que a água se acumule ao redor da boca do peixe para que ele possa ativamente puxar água sobre suas brânquias.
8. Forneça água doce à boca dos peixes através de tubulações conectadas a um reservatório de água alimentado por gravidade.
9. Usando uma lâmina cirúrgica de aço inoxidável #11 desinfetada ou novinha, faça uma incisão de 3 mm de comprimento verticalmente entre os miômeros perto da extremidade distal da nadadeira peitoral.
10. Se necessário, remova uma escama na ponta da lâmina se estiver obstruindo a pele do peixe.
    1. Inserir cuidadosamente o transmissor na incisão e empurrá-lo posteriormente até que todo o tag fique dentro da cavidade do corpo (Figura 2B).
    2. Se necessário, use a extremidade romba do bisturi (ou pinça de ponta fina) para inserir cuidadosamente a etiqueta completamente.
11. Coloque os peixes marcados em um pequeno recipiente de 7,5 ppt de água salgada com aeração para permitir que os peixes se recuperem da anestesia.
12. Uma vez que os peixes tenham recuperado o equilíbrio, faça uma transferência de água para água do recipiente de recuperação para o tanque de retenção pós-marcação contendo 7,5 ppt de água salgada.
13. Permita que os peixes marcados se recuperem em água salgada por 1-2 dias antes da liberação.

Resultados

Duas séries de avaliações de marcação foram conduzidas para abordar a eficácia da marcação de shad juvenil - ensaios preliminares em 2020 e um estudo de longo prazo em 2021. Avaliações laboratoriais preliminares foram realizadas no PNNL em novembro de 2020 para determinar um método preferido para implantar o shad americano com um novo microtransmissor acústico. Protótipos de transmissores (n = 4, P1-P4) foram pareados com diferentes locais de marcação (gástrico, peitoral, pélvico e dorsal) para um total combinado de 4 tratamentos únicos de localização acústica do transmissor (n = 40 peixes por tratamento, Tabela 1). Todos os peixes teste foram aleatoriamente alocados em um tanque de tratamento e retenção. Os peixes teste foram mantidos em 2 tanques de detenção com igual número de peixes de cada tratamento (ou seja, 20 peixes por tratamento) por tanque durante 14 dias. Durante os primeiros 2 dias de avaliação, o shad foi mantido em água salobra salobra (7,5 ppt) e permitiu a recuperação da marcação e manuseio. Em seguida, os tanques foram trocados para água doce de escoamento pelo restante do período de avaliação.

Para a avaliação preliminar, os peixes marcados e os controles cortados variaram em tamanho de 50-80 mm de comprimento de garfo. A sobrevivência dos juvenis e a retenção de etiquetas foram maiores para os peixes implantados por incisão peitoral em comparação com as outras técnicas de marcação (Figura 3). Avaliações piloto adicionais também demonstraram que técnicas de manuseio, como transferências de água para água e retenção de peixes em água salobra salobra antes e depois de eventos estressantes, como marcação, foram críticas para aumentar as taxas de sobrevivência.

Usando os protocolos bem-sucedidos de marcação e manuseio da avaliação preliminar, um estudo de laboratório foi conduzido no PNNL em 2021 para avaliar a sobrevivência a longo prazo de 60 d e retenção de etiquetas de shad americano juvenil implantado com um transmissor acústico usando o método de marcação por incisão peitoral. A avaliação a longo prazo utilizou o transmissor simulado P5 (Figura 4), um projeto de protótipo melhorado semelhante em forma e tamanho ao projeto P1 usado na avaliação preliminar. As dimensões e o peso médios do tag P5 simulado foram de 7,6 mm de comprimento × 2,3 mm de diâmetro e peso no ar de 0,058 g (desvio padrão de 0,002 g), o que resultou em uma carga de tag de <1%. O protótipo de transmissor acústico com componentes funcionais (Figura 4) tem dimensões de 7,6 mm de comprimento x 2,0 mm de diâmetro e peso no ar de 0,050 g.

Os juvenis americanos usados na avaliação de longo prazo haviam sido mantidos em cativeiro por 4 meses no momento do teste. Enquanto o experimento foi planejado para ter números iguais de peixes de tratamento e controle mantidos em dois tanques por um período de 60 dias, os números de sável restantes no momento da marcação foram baixos. Portanto, mais shad foram aleatoriamente atribuídos ao grupo de tratamento marcado do que ao grupo controle para obter uma melhor compreensão da eficácia a longo prazo da técnica de marcação no sável. Cada um dos dois tanques comportava 27 peixes de tratamento e 9 ou 10 peixes controle. No entanto, uma vez que a sobrevivência do Tanque A (13,8%) foi significativamente pior que a do Tanque B (78,4%; Teste exato de Fisher, p < 0,001) e não houve diferença na sobrevivência entre os grupos marcado e controle dentro de cada tanque, apenas os resultados para o tanque B estão incluídos aqui.

O shad (comprimento do garfo 69-105 mm; peso 3,9-11,7 g) foi marcado com o transmissor P5 usando a incisão peitoral (n = 27) ou atribuído ao grupo controle (n = 10). Os peixes controle foram manuseados com os mesmos procedimentos, inclusive sendo colocados no coxim cirúrgico por ~20 s, mas não receberam um clipe de nadadeira ou uma incisão nem foram implantados com um transmissor. Após a marcação, ambos os grupos de tratamento foram mantidos em água salobra salobra (7,5 ppt) por 1 dia e, em seguida, trocados para água de fluxo através do rio para o restante do estudo. A sobrevida em 60 dias foi de 81,5% para o grupo marcado e 70% para o grupo não marcado (Figura 5). A sobrevivência para peixes marcados nesta avaliação foi definida como sobrevivência e retenção de etiquetas, pois a expulsão de tags não pode ser diferenciada de um evento de mortalidade em um estudo de telemetria. Não houve diferença significativa na sobrevida entre os dois grupos (teste exato de Fisher, P = 0,884); no entanto, o poder de detectar uma diferença foi de 38,4% devido ao pequeno tamanho da amostra. Embora o poder de detectar diferença entre os tratamentos tenha sido baixo, os resultados da avaliação a longo prazo mostram que este protocolo de manipulação e marcação pode ser usado com sucesso moderado para implantar o shad americano com transmissores acústicos.

Figura 1: Tanque de recuperação pós-marcação preenchido com água salobra salobra. Um sistema de transporte aéreo fornece oxigênio para o tanque estático. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Implantação de transmissor acústico de um sável americano juvenil. Juvenil americano shad (A) com incisão peitoral e (B) com o transmissor simulado P5 inserido na incisão. Note-se que a boca do sável está parcialmente submersa na água que flui da tubulação azul. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 3: Porcentagem de sobrevivência em uma avaliação preliminar de 14 d com um grupo de controles não marcados e quatro grupos marcados de sável americano juvenil. Os tratamentos marcados consistiram de quatro locais de marcação (gástrico, peitoral, pélvico e dorsal), cada um pareado com um protótipo único de transmissor (P1-P4). A sobrevivência dos peixes marcados foi definida como sobrevivência e retenção de marcação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Transmissores acústicos e fictícios para marcação de juvenis de sável americano. (A) Microtransmissor acústico funcional e (B) o protótipo de transmissor simulado P5, que foi utilizado no estudo de sobrevivência laboratorial de 60 d. Observe que os números 4-7 na régua representam centímetros. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Figura 5: Porcentagem de sobrevida do shad americano em um estudo de longo prazo com retenção de 60 d. Os juvenis foram não marcados (Untagged Controls; linha sólida) ou marcados (Tagged [Pectoral P5]; tracejado line) com um transmissor fictício. A sobrevida do grupo marcado foi definida como sobrevivência e retenção de tags. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 

Tipo de tag	Localização da tag	N	Comprimento do garfo (mm)		Peso médio do tag (DP; g)	Carga de tags (%)	Sobrevida (%)	Tempo médio para marcar/clipar (s)
			Gama	Média (DP)
P1	Gástrico	40	50 - 76	60 (6.0)	0.058 (0.003)	1.5 - 5.2	45	12
P2	Peitoral	40	50 - 78	60 (7.3)	0.039 (0.001)	1.0 - 3.2	80	23
P3	Pélvico	40	50 - 70	58 (5.3)	0.039 (0.001)	1.0 - 4.1	55	26
P4	Dorsal	40	50 - 80	61 (6.8)	0.088 (0.004)	0	60	57
Controle	NA (Clipe)	40	50 - 80	59 (5.7)	NA	0	92.5	14

Tabela 1:Informações de marcação e sobrevivência do shad americano implantado com protótipos de transmissores (P1-P4) ou marcado com clipes da nadadeira caudal superior e caudal inferior (Controle) como parte da avaliação preliminar. O local da marca para o grupo de controle é Não Aplicável (NA), pois esses peixes receberam apenas clipes de barbatana (Clip). Note, que o tipo de tag P4 era um design flutuante neutro. O desvio padrão (DP) da média está entre parênteses.

Discussão

A necessidade de estudar os movimentos juvenis do sável americano em torno de instalações hidrelétricas levou ao desenvolvimento de um protocolo de manuseio e marcação para melhorar a sobrevivência do sável marcado. No PNNL, as tentativas iniciais de implantar o shad juvenil com um novo transmissor acústico, sem o uso de água salgada, resultaram em 100% de mortalidade em 24 horas. O protocolo de manuseio e marcação subsequente e cuidadosamente desenvolvido demonstrou que o shad americano pode ser implantado com um microtransmissor acústico e mantido a longo prazo em um ambiente de laboratório com alta taxa de sobrevivência (81,5%). Minimizar o manuseio fora d'água e o uso de água salobra salobra antes e depois da marcação foi essencial para o sucesso da marcação de juvenis de sável americano.

Na avaliação preliminar, o barbear de até 50 mm foi marcado com um transmissor simulado usando quatro métodos de implantação. A marcação gástrica, um dos métodos mais comuns de marcação de shad adulto13,14,15, teve resultados promissores durante o teste piloto, mas teve uma alta incidência de perda de etiqueta durante a avaliação preliminar. O implante através de uma incisão pélvica tem sido usado com sucesso para estudar os movimentos do shad Twaite^adulto16 e os anexos dorsais têm sido usados para monitoramento de curto prazo do shad americano^juvenil10. Mais recentemente, o implante de tag através de uma incisão peitoral foi utilizado para estudar movimentos de longo prazo do sável adulto em ambientes ribeirinhos e marinhos¹⁷. Na avaliação preliminar no PNNL, a localização da incisão peitoral apresentou melhor desempenho do que as outras três localizações avaliadas, e a sobrevida pós-marcação 7-d foi superior a 90%.

Em geral, os resultados dessas avaliações mostraram que a sobrevivência do shad marcado foi comparável à sobrevivência do shad não marcado além da duração da vida útil da bateria do transmissor acústico, que se espera que seja de ~30 dias com um sinal acústico transmitido a cada 5 segundos.

Este projeto de transmissor e protocolo de marcação são uma grande promessa para o estudo de espécies de peixes pequenas, sensíveis e ameaçadas, como o sável americano, em aplicações de campo, permitindo que os pesquisadores obtenham informações valiosas sobre os movimentos dos peixes perto de instalações hidrelétricas. Por exemplo, esta técnica de marcação será usada em uma próxima aplicação de campo para estudar o comportamento de juvenis marcados acústicamente à medida que se aproximam do vertedouro e da casa de força de uma barragem hidrelétrica. Os resultados obtidos com estudos fluviais podem informar melhor as decisões de manejo nessas instalações e podem ajudar a conservar as espécies ao longo de sua fase de vida juvenil. Estudos futuros devem avaliar a efetividade desse procedimento na marcação e rastreamento de peixes a fio d'água em condições de campo. Além disso, essas técnicas são facilmente transferíveis para a implantação de sável ou outras espécies sensíveis com etiquetas de Transponder Integrado Passivo (PIT), que podem fornecer monitoramento de longo prazo ao longo de sua história de vida.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
#11 stainless steel surgical blade	Exel	29502	purchased from Med-Vet International; no real preference on blade vendor
#11 stainless steel surgical blade	Miltex	MIL4-311	purchased from Med-Vet International; no real preference on blade vendor
2 gallon bucket	Leaktite	#2GL White Pail
acoustic transmitter for American shad	Pacific Northest National Laboratory	Patent-Pending	BattelleIPID: 32500
air stone	Pentair	AS3
aquarium air pump	Tetra	Whisper
dissolved oxygen meter	YSI	ProODO or ProSolo
ethanol	Decon Laboratories	2805HC
fine mesh net	Blue Ribbon	ABLEC8
fish holding tank	Reiff Manufacturing	NA	round aquaculture tank
foam garden kneeler	Tommyco	12003
plastic storage container	Ziploc	discontinued; 8oz container with lid
PVC cement	Oatey	30821
PVC pipe	Charlotte Pipe	NA	PVC Schedule 40 2" diameter
PVC primer	Oatey	30757
PVC tee	Charlotte Pipe	NA	2" PVC Schedule 40 S x S x S Tee
sea salt	InstantOcean	SS15-10
silicone tubing 3/16"	Pentair	tp30s	tubing to supply water during tagging
sodium bicarbonate	Fisher Chemical	S233-500
sterile water	NA	NA	water is sterilized using an autoclave
tricaine methanesulfonate	Syndel USA	15650
tubing for airline	Hydromaxx	1403038050