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要約

提示されているのは、高齢のショウジョウバエモデルにおける ショウジョウバエ の睡眠行動をモニタリングすることにより、睡眠を改善するためのハイスループット薬物スクリーニングのプロトコルです。

要約

睡眠は、健康と全体的な幸福に不可欠な要素であり、睡眠時間の短縮と断片的なパターンを特徴とする睡眠障害を頻繁に経験する高齢者にとって、しばしば課題となります。これらの睡眠障害は、糖尿病、心血管疾患、精神障害など、高齢者のさまざまな病気のリスクの増加とも相関しています。残念ながら、睡眠障害に対する既存の薬は、認知障害や依存症などの重大な副作用と関連しています。そのため、より安全で効果的な睡眠障害治療薬の開発が急務となっています。しかし、現在の薬物スクリーニング法では、コストが高く、実験期間が長いため、依然として制限要因となっています。

このプロトコルは、哺乳類と比較して高度に保存された睡眠調節メカニズムを持つ種である ショウジョウバエのメラノガスターを利用する費用対効果の高いハイスループットスクリーニング方法を記述しており、高齢者の睡眠障害を研究するための理想的なモデルとなっています。老化したハエに様々な微量化合物を投与することで、睡眠障害に対する効果を評価することができます。これらのハエの睡眠行動は、赤外線モニタリングデバイスを使用して記録され、オープンソースのデータパッケージであるSleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020(SCAMP2020)で分析されます。このプロトコルは、睡眠調節のための低コストで再現性のある効率的なスクリーニングアプローチを提供します。ショウジョウバエは、ライフサイクルが短く、飼育コストが低く、取り扱いが容易なため、この方法の優れた被験者として機能します。一例として、試験薬の1つであるレセルピンは、高齢のハエの睡眠時間を促進する能力を実証し、このプロトコルの有効性を強調しています。

概要

睡眠は、人間の生存に必要な必須行動の1つであり、急速眼球運動(REM)睡眠と非急速眼球運動(ノンレム)睡眠の2つの主要な状態によって特徴付けられます1。ノンレム睡眠は、N1(覚醒から睡眠への移行)、N2(浅い睡眠)、N3(深い睡眠、徐波睡眠)の3段階からなり、覚醒から深い睡眠への進行を表しています1。睡眠は心身の健康に重要な役割を果たします2.しかし、加齢により、成人の総睡眠時間、睡眠効率、徐波睡眠率、レム睡眠率が低下します3。高齢者は、徐波睡眠に比べて浅い睡眠により多くの時間を費やす傾向があり、夜間の覚醒に敏感になります。覚醒回数が増えると、平均睡眠時間が短くなり、その結果、高齢者の睡眠パターンが断片化され、マウスのHcrtニューロンの過度の興奮と関連している可能性があります4。さらに、加齢に伴う概日リズムのメカニズムの低下は、睡眠時間の早期シフトに寄与します5,6。これらの要因は、身体的疾患、心理的ストレス、環境要因、および薬物使用と組み合わさって、不眠症、レム睡眠行動障害、ナルコレプシー、周期的な脚の動き、むずむず脚症候群、睡眠呼吸障害などの睡眠障害の影響を受けやすくなります7,8。

疫学研究により、睡眠障害は、うつ病10、心血管疾患11、認知症12などの高齢者の慢性疾患9と密接に関連していることが示されています。睡眠障害への対処は、慢性疾患の改善と治療、および高齢者の生活の質の向上において重要な役割を果たします。現在、患者は主にベンゾジアゼピン、非ベンゾジアゼピン、メラトニン受容体作動薬などの薬剤に頼って睡眠の質を高めています13。しかし、ベンゾジアゼピンは、長期使用後に受容体のダウンレギュレーションと依存を引き起こし、中止時に重度の離脱症状を引き起こす可能性があります14,15。非ベンゾジアゼピン系薬剤は、認知症16、骨折17、がん18などのリスクも伴います。一般的に使用されるメラトニン受容体作動薬であるラメルテオンは、睡眠潜伏期間を短縮しますが、睡眠時間を増加させず、広範な初回通過排泄のために肝機能関連の懸念があります19。メラトニン受容体作動薬およびセロトニン受容体拮抗薬であるアゴメラチンは、うつ病関連の不眠症を改善するが、肝障害のリスクももたらす20。そのため、睡眠障害の治療や緩和のために、より安全な薬剤が急務となっています。しかし、分子実験や細胞実験、自動システム、コンピューター解析を組み合わせた現在の薬物スクリーニング戦略は、高価で時間がかかります21。受容体の構造と特性に依存する構造ベースの創薬戦略は、受容体の3次元構造を明確に理解する必要があり、薬物効果の予測能力に欠けています22。

2000年、1984年にキャンベルとトブラーが提唱した睡眠基準に基づいて23、研究者は睡眠24を研究するための単純な動物モデルを確立し、その中には睡眠のような状態を示すショウジョウバエ25,26も含まれていた。ショウジョウバエとヒトの解剖学的違いにもかかわらず、ショウジョウバエの睡眠を調節する多くの神経化学的要素とシグナル伝達経路は哺乳類の睡眠に保存されており、ヒトの神経疾患の研究を容易にしています27,28。ショウジョウバエは、ハエと哺乳類のコア振動子の違いにもかかわらず、概日リズムの研究にも広く使用されています29,30,31。したがって、ショウジョウバエは、睡眠行動の研究や睡眠関連の薬物スクリーニングを行うための貴重なモデル生物として機能します。

この研究は、高齢のハエを使用して睡眠障害を治療するための低分子薬をスクリーニングするための費用対効果の高いシンプルな表現型ベースのアプローチを提案しています。 ショウジョウバエ の睡眠調節は高度に保存されており25、加齢とともに観察される睡眠の減少は、薬物投与によって可逆的である可能性がある。したがって、この睡眠表現型に基づくスクリーニング法は、薬効を直感的に反映することができます。ハエに調査中の薬剤と餌の混合物を与え、ショウ ジョウバエ 活動モニター(DAM)32を使用して睡眠行動を監視および記録し、取得したデータをMATLABのオープンソースSCAMP2020データパッケージを使用して解析します(図1)。統計解析は、統計およびグラフ作成ソフトウェアを使用して実行されます( 材料表を参照)。一例として、睡眠を増加させると報告された小胞モノアミントランスポーターの低分子阻害剤であるレセルピンに関する実験データを提示することにより、このプロトコルの有効性を実証します33。このプロトコルは、加齢に伴う睡眠障害を治療するための薬剤を特定するための貴重なアプローチを提供します。

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プロトコル

このプロトコルは、ブルーミントンショウジョウバエストックセンター(BDSC_3605、材料表を参照)から30日齢のw1118ハエを使用します。

1.熟成したショウジョウバエの準備

  1. 食品の準備
    1. 50 g/Lのコーンフレーク、110 g/Lの砂糖、5 g/Lの寒天、および25 g/Lの酵母を混合して、標準的なコーンスターチ培地を調製します。コーンフレークと酵母を水で加熱して糊化し、すべての物質を完全に溶かします。
    2. 培地が50〜60°Cに冷えたら、6 mL/Lのプロピオン酸を加え、速やかに培養ボトルに詰めます。
  2. ハエの飼育と老化したハエの準備
    1. 標準的なコーンスターチ培地を含むボトルでハエ株 w1118を繁殖させ、ボトルを25°C、相対湿度68%、照明条件500〜1000ルクス、および12時間:12時間の明暗サイクルの恒温インキュベーターに入れます。
    2. ハエの成長サイクルに応じて7日ごとにハエを新しいボトルに移し、同じボトル内の個体の年齢を一定に保ちます。
    3. 元のボトルから孵化したハエを移してから3日後に集め、新しいボトルに入れます。7日ごとにボトルを交換するという原則に従い、生後30日頃まで培養します。

2.モニタリング用の薬用食品とガラス管の調製

注:ガラス管調製の手順は、Jinらの研究に変更を加えた34に従ったものである。

  1. ガラス管の洗浄・乾燥
    1. ガラス管(直径5mm×長さ65mm、 材料表参照)を大きめのビーカーに入れて浸し、二重蒸留水で20分間沸騰させます。これを3回繰り返します。
    2. ガラス管を取り外して束ね、内部を二重蒸留水で3〜5回すすぎ、オーブンに入れて乾燥させます。
  2. 簡易培地(100mL)の調製
    1. 寒天1.5gとショ糖5gを二重蒸留水に溶解し、加熱し、100mLまで濃縮します。
    2. 培地が約70°Cに冷えたらプロピオン酸600μLを加え、恒温水浴で固化を防ぎます。
    3. 薬物が20 μMまたは50 μMに達するまで、約4 mLの単用培地とレセルピン( 材料表を参照)を10 mLの小さなビーカーに加えます。 ジメチルスルホキシド(DMSO)をネガティブコントロールグループの濃度0.2%に添加します。
  3. 薬品を含有するガラス管の調製
    1. 培地の流れを促進するために、適切な長さのガラス管を小さなビーカーに慎重に挿入します。媒体は大気圧により自然にガラス管に入ります。
    2. 培養液が完全に固まったらガラス管を引き出し、外壁を拭き取ると、一端に薬剤を含む培養液が入ったモニタリングガラス管が得られます。
    3. 固体パラフィンをビーカーで70°Cで溶けるまで加熱し、ガラス管の端を食品に近づけてパラフィン液に約5mm入れ、すばやく取り出します。パラフィンが固まるのを待って、ガラス管の食品端を密封します。

3. 実験計画とハエ処理

  1. 表1に従ってハエ処理の実験を計画します。

4. ショウジョウバエ の集合と睡眠モニタリング

注:ショウ ジョウバエ の組み立ての手順は、Jinらの研究に変更を加えて34 に従います。

  1. ハエをCO2 ガスで麻酔し、パラフィンで密封されたガラス管(チューブごとに1本)に入れ、吸収性の綿球で非食品の端を塞いで、ハエの逃げを防ぎ、空気の循環を確保します。
  2. 赤外線モニターにチューブをロードして監視します。
    1. ハエの入ったガラス管を赤外線モニターに同じ方向に組み立て、各薬剤に対応するモニター番号と穴番号を記録します。
    2. 各チューブのアライメントを調整し、赤外線がハエの活動範囲の中心を垂直に通過するようにします。
    3. 指定された設定に従って、フライスリープ暗室にある25°Cのインキュベーター内にモニターを配置します:25°C温度、Zeitgeber 12(ZT12)(現地時間08:00に相当)、およびZT24(現地時間08:00に相当)。このセットアップにより、ハエは12時間の明暗の周期を交互に経験します。
      注意: モニタリング中にインキュベーター内の安定した環境を維持するために、モニタリングデータの収集が完了するまでドアを開けないようにしてください。
    4. DAM2システムを使用して監視を開始します( 材料表を参照)。
    5. 監視が完了したら、収集したデータを.txt形式でシステムからダウンロードします。

5. データ処理

注:DAMシステム、DAMFileScan107、およびSCAMPを使用したデータ処理は、公式Webサイトの指示に従って実行されました( 資料表を参照)。

  1. 上記のtxtファイルをDAMFileScan107ソフトウェアにインポートしてスキャンし、必要に応じて分割して睡眠データを取得します。
    1. セグメンテーションデータの開始時刻を、モニター起動後3日目の8:01(1分セグメンテーション)または8:00(30分セグメンテーション)とし、開始時刻の3日後の午前8:00を終了時刻とする(図2A1)。
      注:ハエは少なくとも1日は監視環境に適応する必要があります。したがって、分割データの開始時刻を、モニター開始から 3 日目の午前 8 時に設定できます。
    2. 1 分間隔と 30 分間隔でデータを分割します。オプション「ビンの長さ」を1分に変更し、オプション「出力ファイルタイプ」をチャネルファイルに変更し、名前を変更して出力します。30分間のデータセグメンテーション方法は上記と同じです(図2A2-5)。
      注: 1 分間隔と 30 分間隔でデータ セグメンテーションを実行する場合、2 つのファイルの最終的な名前変更は一貫している必要があります。そうしないと、後続の MATLAB 処理中に読み取れなくなる可能性があります。必要に応じて、出力後にファイル名を変更して、区別を容易にすることができます。
  2. SCAMP2020を使用したデータ処理
    1. MatlabでプログラムパッケージSCAMP2020を開き、Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP)をダブルクリックします(図2B)。
    2. そのサブフォルダ「Vecsey SCAMP Scripts」をパスに追加し、そのフォルダで「scamp.m」ファイルを見つけて実行します。次のポップアップウィンドウで、プロセス1分と30分のフォルダを順番に選択します(図2C、D)。
    3. モニターを選択し、 Load individual See Plots to preview(図3A1)をクリックして、表示される画像を確認します。死んだハエの対応するチャネルのチェックを外します(図3A2、 図3B)。
    4. 上記の手順を繰り返して、すべてのモニターを確認します。
    5. 各モニターの各チャンネルの名前を、テストする薬剤に基づいて変更し(図3A3)、すべてのモニターを選択して、分析のために選択したデータの分析をクリックします(図3A4)。
    6. 選択したオプションをデフォルトとし、[Analyze for Chosen Bin]をクリックし、[ Export Data]をオンにして、最後に[ Graph 30 min Data Types for All Days for Selected Groups]と[EXPORT All Data ]をクリックして結果を出力します(図3C)。
  3. CSVファイルからs30というファイルを選択し、各モニターの対応する平均値と標準誤差データを見つけ、Excelにバックアップして修正・調整し、GraphPad Prism(材料表参照)に貼り付けてスリープ状態図を描きます(図4A,B)。
  4. 「stdur」という名前のファイルを見つけて、3日以内の各ハエの昼間、夜間、総睡眠の平均値を計算します(図4A、C)。データをPrismソフトウェアに貼り付けて差分検定を完了し、グラフを描きます。

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結果

レセルピンは小胞性モノアミントランスポーター(VMAT)の低分子阻害剤であり、シナプス前小胞へのモノアミンの再取り込みを阻害し、睡眠時間の増加をもたらす33。レセルピンの睡眠促進効果は、30日齢のハエで調べられ、対照群には溶媒ジメチルスルホキシド(DMSO)のみが与えられました。レセルピン群では、高齢のハエはDMSO群と比較して、昼夜ともに有意に増加した睡眠?...

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ディスカッション

記載された方法は、中小規模の睡眠薬を迅速にスクリーニングするのに適している。現在、主流のハイスループット薬物スクリーニング法のほとんどは、生化学的および細胞レベルに基づいています。例えば、受容体の構造および特性は、それに結合することができる特異的リガンドを探索するために検査される22。別のアプローチでは、質量分析による核磁気共鳴(NMR)を用...

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開示事項

著者らは、競合する利害関係がないことを宣言します。

謝辞

Junhai Han教授の研究室メンバーの議論とコメントに感謝します。この研究は、Y.T.32170970の中国国家自然科学基金会と、江蘇省のZ.C.Z.の「シアニンブループロジェクト」の支援を受けました。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AgerBIOFROXX8211KG001
Artificial Climate BoxPRANDTPRX-1000Aofficial website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity MonitorTriKineicsDAM2official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2systemTriKineicsversion:v3.03official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScanTriKineicsversion:1.0.7.0official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl SulfoxideSIGMA276855
Drosophila Activity Monitoring IncubatorTritech ResearchDT2-CIRC-TKofficial website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila BottlesBiologix51-17720official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118Bloomington Drosophila Stock Center BDSC_3605
ExcelMicrosoftversion:Excel 2016official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubesTriKineticsPPT5x65official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022bMathWorksversion:9.13.0.2049777official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
PrismGraphPadVersion:Prism 8.0.1official website:https://www.graphpad.com/features
ReserpineMACKLINR817202-1g
SaccharoseSIGMA1245GR500
SCAMPVecsey LabN/Aofficial website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

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