パーキンソン病のショウ ジョウバエ モデルにおける便秘の測定

要約

このプロトコルはパーキンソン病のアルファ シヌクレインによって基づくショウ ジョウバエ モデルの模倣の便秘のための試金を示す。

要約

パーキンソン病(PD)の非運動症状は一般的で、治療が困難であり、生活の質を著しく損ないます。一般的な非運動症状の1つは便秘であり、PDの診断に数年または数十年先行することがあります。便秘はPDの動物モデルでは十分に調査されておらず、特定の治療法がありません。このアッセイは、ヒトα-シヌクレインが汎ニューロンドライバーの下で発現するPDの ショウジョウバエ モデルを利用しています。α-シヌクレインを発現するハエは、ドーパミン作動性ニューロンの喪失、運動障害、α-シヌクレイン封入体など、PDの特徴を発現します。

このプロトコルはこれらのはえの便秘を調査するための方法を概説する。ハエは、青色の着色料を添加したハエの餌に一晩置き、翌日に標準食に移します。その後、標準的なハエの餌が入った新しいバイアルに8時間毎時移されます。各移送の前に、バイアル壁の糞便斑点の合計に対する青色の糞便斑点の割合が計算されます。α-シヌクレインを欠損した対照ハエは、α-シヌクレインを発現するハエの数時間前にすべての青色色素を排出します。さらに、腸からの青い色の食べ物の通過は、簡単な写真で監視できます。このアッセイの簡便さは、 ショウジョウバエの便秘の修飾因子を特定するための前方遺伝学的または化学的スクリーニングでの使用を可能にします。

概要

パーキンソン病(PD)は進行性の神経変性疾患であり、運動緩慢、硬直、振戦などの運動症状の存在を臨床的に特徴とし、重大な罹患率^{をもたらします}1。病理学的には、PDは黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの喪失およびα-シヌクレインのミスフォールディングによって定義され、レビー小体およびレビー神経突起の形成につながる。パーキンソン病の病因は未だによくわかっておらず、遺伝的要因と環境的要因の複雑な相互作用に起因している可能性が高い^2,3。現在、疾患修飾療法は利用できませんが、これはおそらく診断時に存在する病理学の進行した段階が一因です。研究によると、黒質のドーパミン作動性ニューロンの60%以上が運動症状の発症によってすでに失われており、疾患の早期発見のための潜在的なバイオマーカーを探る必要性が強調されています⁴。そのような臨床バイオマーカーの1つが便秘であり、これはPD^患者によく見られ^5,6、運動症状の発症に数年または数十年先行する可能性があります。

運動症状に基づくPDの臨床的定義にもかかわらず、便秘はいくつかの非運動症状の1つであり、対症療法の治療がより困難であり、患者の生活の質に重大な障害を引き起こします⁷。脳と腸神経系の間の双方向のコミュニケーションを表す腸脳軸の変化は、PDの病因に関与しています。α-シヌクレイン凝集体はPD患者の消化管からの組織サンプル中に見出されており⁸、動物モデルでは、腸神経系のα-シヌクレイン凝集体がプリオン様に中枢神経系に広がることが示唆されている⁹。さらに、PD患者は腸内細菌叢に異常を示し¹⁰、過度の腸内炎症を経験する可能性がある¹¹。PDの便秘は十分に研究されておらず、ハエ^12,13またはげっ歯類^14,15におけるパーキンソン病関連便秘のモデルはほとんど報告されていません。

このアッセイは、ハエが汎ニューロンドライバーであるn-シナプトブレビンの制御下でヒトα-シヌクレイン遺伝子を発現するPDのショウジョウバエモデルを採用しています。これらのハエは、α-シヌクレイン凝集、運動機能障害、加齢に伴う神経変性など、PDのすべての特徴的な特徴を示し、ドーパミン作動性ニューロンの喪失をもたらします^16,17。以前の研究では、腸機能障害を評価するためにハエの糞便量を測定し、ハエの糞便を定量化し、さまざまな遺伝子系統の排泄物量を比較して、消化器系の機能的な違いを明らかにしました18,19,20。ここでは、ヒトα-シヌクレインを発現するハエを用いた便秘アッセイを実証します。このシンプルでありながら貴重なツールは、PDの重要な非運動症状の研究を可能にします。

プロトコル

このアッセイで使用したハエ:コントロール:nSyb-QF2、nSyb-Gal4/+;α-シヌクレインは飛ぶ:nSyb-QF2、nSyb-Gal4、QUAS-α-シヌクレイン/+;閉鎖後1日および10日。オスとメス(交尾と非交尾)のハエ( 材料表を参照)。

1.染めたハエの餌を準備する

1. 青色のソフトジェルペースト食品着色料( 材料表を参照)と蒸留水を1:1の比率(v / v)で混合します。
   注:一部の青色染料には神経保護効果があることが示されているため、非吸収性染料のみを含む市販の食品着色料を使用してください²¹。
2. 標準的なコーンミール寒天( 材料表を参照)からなるハエの餌のバイアルを、餌が液体またはスラリーに溶けるまで10〜15秒間隔で電子レンジで加熱します。食べ物を沸騰させないでください。
3. 食品の各バイアルに染料混合物を添加して、バイアル間で均一な着色を得ます。食品が均一に青くなるまで色素混合物を混合します(図1)。食品の色が飽和し、バイアル間で色のばらつきがないように、青色染料混合物の量を追加します。
   注意: 食品はすぐに固まるため、この手順は電子レンジの直後に実行する必要があります。食品が固まった場合は、バイアルを再度電子レンジで加熱します。
4. 染色食品のバイアルが固まるまで自然乾燥させます。乾燥中にバイアルの開口部に薄いペーパータオルを置き、迷子のハエがバイアルに着地するのを防ぎます。.
5. 食品が冷えて固まったら、検査に使用するハエを青い食品に移します。
   注:幅の狭いバイアル(25 mm)の場合、各バイアルに9〜14匹のハエを追加することをお勧めします。幅広のバイアル(28.5 mm)の場合、各バイアルに10〜20匹のハエを追加することをお勧めします。ハエは性別や交尾経験によって分離されておらず、交尾した雌と交尾していない雌の両方を含む、雄と雌の混合個体群が含まれます。
6. バイアルをハエと一緒にインキュベーターで25°Cで一晩インキュベートします。

2. ハエの撮影

メモ:この手順はオプションです(図2)。

1. 翌朝(時刻0)、代表的なハエに二酸化炭素を60秒間麻酔します。腹側が上を向くようにフライを置きます。
2. カメラ( 材料表を参照)を使用して、毎時のハエの画像を撮影し、消化器系に残っている青い餌の量を視覚化します。
   注:これらのハエは、麻酔が結果に影響を与える可能性があるため、アッセイの定量的な部分(ステップ3)には使用しないでください。
3. 毎時間、麻酔をかけ、新しいハエを画像化します。

3. 便秘検査の実施

1. 残りの(麻酔されていない)ハエを標準的な ショウジョウバエ の餌と一緒にバイアルに移します。各バイアルに番号を付けます。
2. ハエをインキュベーターに25°Cで60分間放置します。
3. 60分後、ハエを標準的な ショウジョウバエ の餌を入れた新しいバイアルに移します。最初のバイアルセットからデータ記録を開始します。
4. バイアルの長さに点線を引き、カウントを開始するポイントをマークします。
5. 各バイアルの壁にある小さな丸い点の数を手動で数えます。食品やバイアルのプラグにあるドットを数えないでください。
6. 各バイアルの壁にある青い点の数を数えることから始めます。
7. 各バイアルの壁にある不透明で無色のドットの数を数えます。
   注:各ドットはハエの排泄物であり、尿と糞便²²の組み合わせです。時折、ハエが排泄物の上を歩いて痕跡を残すことがありますが、その場合は、痕跡の個々のマークではなく、元の点のみを数えます。
8. 各バイアルのドットの総数に対する青いドットの比率を記録します。
   注:ドットの総数は、バイアルの壁にある青い点の数に、同じバイアルの壁にある無色の点の数を加算したものです。これは、時間あたりの青色の糞便の割合を計算するために使用されます。
9. 手順 3.2 から 3.8 をさらに 7 回繰り返し、合計 8 時間にわたって 1 時間ごとにデータを収集します。

4. データ分析

1. 各条件の 1 時間あたりの青色の糞便の割合をグラフ化します。
2. 条件間のデータを比較します。
   注:統計的有意性は、条件間の個々の時点を比較する、時間の経過に伴う線の傾きを測定する、または曲線下の面積を比較することにより、3つの方法で決定できます。

結果

ショウジョウバエの腹部は透明であるため、麻酔をかけた生きたハエの腸内を青い餌で視覚化することができます。腸内輸送の質的な違いは、さまざまな時点でハエの画像を撮影することで評価できます。対照のハエでは、青い餌はすぐに排出されますが、α-シヌクレインハエでは、青い餌は8時間も腸内に残ります(図2)。

α-シヌクレインハエは加齢に伴う神経変性を示し、エクロジョン後10日までに頑健な表現型が発達する¹⁰。この時点において、対照ハエと比較した場合の腸内通過時間の違いは、条件間の個々の時点を比較したり、時間の経過に伴う線の傾きを測定したり、曲線下の面積を比較したりすることによって見られます(図3)。運動機能障害や神経変性もまだ見られない早期の時点(閉鎖後1日目)では、対照群とα-シヌクレインハエの腸内輸送に差は見られませんでした(図4)。

図1:青色の食品バイアルと糞便の斑点。 (A)すべてのバイアルには青色の食品が含まれています。この時点では、ハエが青い餌に導入されたばかりで、青い糞便は見えません。(B)w1118ハエが生鮮食品に1時間移された後のバイアルは、その後取り出されます。(C)では左のインセットが拡大され、(D)では右インセットが拡大されます。(C)ハエの餌が存在するために分析から除外された領域。(D)糞便の斑点を拡大し、青色(黒矢印)と非青色斑点(黄色矢印)を示す。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:染色食品の腸内移動の経時的な可視化。 対照のハエとニューロンにヒトα-シヌクレインを発現するハエを青色に染めた餌に一晩放置し、翌日標準培地に移した。ハエは、1時間ごとに新しい標準的なハエの餌に連続して移されました。転写後0時間、2時間、4時間、6時間、8時間後の代表的な画像を示す。対照群とα-シヌクレインハエは、時間ゼロ時に腸内に同様の青い餌の斑点を示します。その後の時点では、対照のハエはα-シヌクレインのハエよりも青色の餌が少なく、対照のハエの8時間時点ですべての青い餌がなくなります。各ハエ系統の遺伝子型は次のとおりです:コントロール(nSyb-QF2、nSyb-Gal4 / +);α-シヌクレイン(nSyb-QF2、nSyb-Gal4、QUAS-α-シヌクレイン/+)が飛ぶ。雌のハエは、サイズが大きいため腹部を視覚化しやすいため、イメージングに使用されます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:閉鎖後10日目の便秘アッセイ。 対照のハエとニューロンにヒトα-シヌクレインを発現するハエを青色に染めた餌に一晩放置し、翌日には標準的なハエの餌に移した。ハエは1時間ごとに新しい標準培地に連続して移されました。(A)時間あたりの青色糞便の割合。エラーバーは標準偏差を表します。N = 遺伝子型あたり6バイアル。各バイアルには9〜14匹のハエが含まれていました。すべての統計解析は、Graphpad Prismで行いました( 材料表を参照)。各時点における統計的有意性は、二元配置分散分析を用いて計算した。ラインの傾きと傾斜角間の差は、線形回帰分析を使用して計算されました。(B)各遺伝子型の曲線下面積を計算した。エラーバーは標準偏差を表します。各ハエ系統の遺伝子型は次のとおりです:コントロール(nSyb-QF2、nSyb-Gal4 / +);α-シヌクレイン(nSyb-QF2、nSyb-Gal4、QUAS-α-シヌクレイン/+)が飛ぶ。オスとメスの両方のハエがほぼ同じ数に含まれています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:閉鎖後1日目の便秘アッセイ。 対照のハエとニューロンにヒトα-シヌクレインを発現するハエを青色に染めた餌に一晩放置し、翌日標準培地に移した。ハエは、1時間ごとに新しい標準的なハエの餌に連続して移されました。(A)時間あたりの青色糞便の割合。エラーバーは標準偏差を表します。N = 遺伝子型ごとに最低 5 バイアル。各バイアルには9〜14匹のハエが含まれていました。すべての統計分析はGraphpad Prismで行いました。各時点における統計的有意性は、二元配置分散分析を用いて計算した。ラインの傾きと傾斜角間の差は、線形回帰分析を使用して計算されました。(B)各遺伝子型の曲線下面積を計算した。エラーバーは標準偏差を表します。各ハエ系統の遺伝子型は次のとおりです:コントロール(nSyb-QF2、nSyb-Gal4 / +);α-シヌクレイン(nSyb-QF2、nSyb-Gal4、QUAS-α-シヌクレイン/+)が飛ぶ。オスとメスの両方のハエがほぼ同じ数に含まれています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルには、アッセイを成功裏に完了させるのに役立ついくつかのステップがあります。まず、各バイアルの各ラウンド間の時間間隔が実験全体を通して一貫していることを確認することが重要です。バイアルに番号をラベル付けすると、長い遺伝子型の説明が不要になり、時間を節約できます。さらに、糞便²² を数える方法は、実験全体を通して一貫していることが重要です。食品やバイアルのプラグには青い糞便が見えますが、無色の糞便は見えません。したがって、食品またはバイアルプラグの青い点を数えないでください。

行動アッセイでは、ハエの行動の変動やアッセイに影響を与える未知の変数により、結果に一貫性がなくなる可能性が常にあります。すべての実験に、同じショウ ジョウバエ 培地、同じ食用色素、同じブランドのバイアルを使用することをお勧めします。興味深いことに、いくつかの試験では、ハエの概日リズムが原因で、ハエは午後の早い時間に排便する頻度が低くなる傾向があることが観察されました²³。しかし、この行動は対照のハエとα-シヌクレインを発現するハエの両方で一貫しているため、懸念はありません。

アッセイの開始時にハエが青色の糞便を排泄しない場合は、使用されている染料が十分に色素化されていない可能性があります。この場合、それに応じて蒸留水に対する染料の比率を増やすことができます。また、ハエの消化管に青い餌が少量しか残っていない場合、糞便が淡い青色か無色かを判断するのが難しい場合もあります。これが発生した場合は、バイアルの後ろに白い紙を置くと、糞便ドットの色を決定するのに役立ちます。糞便が非常に水色であっても、無色の糞便ではなく青色の糞便として記録するのが最善です。

このアッセイの限界の1つは、糞便の斑点を手作業で数える必要があることです。ハイスループットスクリーニングの可能性を高めるために、このプロトコルは将来、マルチウェルプレート内の個々のハエによって生成される青色の糞便スポットの自動定量を可能にするように変更される可能性があります。もう一つの限界は、α-シヌクレインモデルがPDの前駆体モデルに発展する可能性を秘めているが、神経変性を伴わずに便秘が存在する最適な時点がまだ特定されていないことである。

要約すると、この方法は、PDの ショウジョウバエ モデルで、研究が進んでいない非運動性PD症状である便秘をモデル化するためのシンプルで簡単なアプローチを提供します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1400 g sucrose	MP Biomedicals	904713
1800 g dextrose	MP Biomedicals	901521
2884 g yeast	MP Biomedicals	903312
428 g agar	Fisher Scientific	10253156
4600 mL molasses	Grandma's Molasses	7971942
68 L water	N/A	N/A
680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol)
6864 g cornmeal	Pearl Milling	125045
800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water)
cellSens Standard software	Olympus	N/A
Ethanol	Pharmco-Aper	111ACS200
Flugs for wide plastic vials	Genesee Scientific	49-101
Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene	Genesee Scientific	32-117
Graphpad Prism	GraphPad	N/A	Version 9.5.1
Olympus DP23 camera	Olympus	N/A
Olympus SZX12 Stereo Microscope	Olympus	N/A
Phosphoric Acid	Fisher Scientific	S25470A
Propionic Acid	Fisher Scientific	A258 - 500
Soft gel paste food color, Royal blue	AmeriColor	202
Tegosept	Apex	20-258
Drosophila Stocks
nSyb-QF2, nSyb-Gal4	All lines provided by Dr. Mel Feany	N/A	Lines are available directly from Dr. Feany
nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein		N/A
w1118		N/A