파킨슨병의 초파리 모델에서 변비 측정

요약

이 프로토콜은 파킨슨병의 알파 시누클레인 기반 초파리 모델에서 변비를 모델링하기 위한 분석을 제시합니다.

초록

파킨슨병(PD)의 비운동 증상은 흔하고 치료가 어려우며 삶의 질을 크게 떨어뜨립니다. 흔한 비운동 증상 중 하나는 변비인데, 변비는 파킨슨병 진단보다 수년 또는 수십 년 앞설 수 있습니다. 변비는 PD의 동물 모델에서 충분히 연구되지 않았으며 특별한 치료법이 부족합니다. 이 분석실험은 PD의 초파리 모형을 이용합니다 인간 알파 synuclein가 pan 신경 운전사의 밑에 표현되는 곳. 알파 synuclein를 표현하는 파리는 PD의 특징을 개발합니다: 도파민성 신경 세포의 손실, 운동 손상 및 알파 synuclein 포함.

이 프로토콜은 이 파리의 변비를 연구하는 방법을 설명합니다. 파리는 밤새 파란색 첨가물이 첨가된 플라이 사료에 넣은 다음 다음날 표준 사료로 옮깁니다. 그런 다음 8시간 동안 매시간 표준 플라이 푸드가 있는 새 바이알로 옮겨집니다. 각 이식 전에 바이알 벽의 총 분변 반점 대비 파란색 분변 반점의 비율이 계산됩니다. 알파 시누클레인이 결핍된 대조군은 알파 시누클레인을 발현하는 파리가 생기기 전에 모든 청색 염료를 배출합니다. 또한 장에서 파란색 음식물이 통과하는 것을 간단한 사진으로 모니터링할 수 있습니다. 이 분석법의 단순성으로 인해 전방 유전 또는 화학 스크리닝에서 초파리의 변비 조절 인자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

파킨슨병(Parkinson's disease, PD)은 진행성 신경퇴행성 질환으로, 서동, 경직, 떨림과 같은 운동 증상이 임상적으로 나타나 상당한 이환율을 초래한다¹. 병리학적으로, PD는 흑질에 있는 도파민 신경 세포의 손실 및 알파 synuclein의 misfolding에 의해 정의되, Lewy 몸 및 Lewy neurites의 대형으로 이끌어 내. 파킨슨병의 발병 기전은 아직 잘 알려져 있지 않은데, 이는 유전적 요인과 환경적 요인의 복잡한 상호작용에 기인하는 것으로 보인다 ^2,3. 현재로서는 질병 수정 요법을 사용할 수 없으며, 이는 부분적으로 진단 당시 병리학의 진행된 단계 때문일 수 있습니다. 연구에 따르면 흑질에 있는 도파민 뉴런의 60% 이상이 운동 증상의 시작으로 이미 소실된 것으로 나타났으며, 이는 질병 조기 발견을 위한 잠재적인 바이오마커를 탐색해야 할 필요성을 강조합니다⁴. 이러한 임상적 바이오마커 중 하나는 변비인데, 변비는 파킨슨^{병 환자에서} 흔히 발생하며^5,6 운동 증상 발현보다 수년 또는 수십 년 전에 나타날 수 있다.

운동 증상에 근거한 복막투석의 임상적 정의에도 불구하고, 변비는 증상적으로 치료하기 어렵고 환자의 삶의 질에 심각한 손상을 초래하는 여러 비운동 증상 중 하나이다⁷. 뇌와 장 신경계 사이의 양방향 통신을 나타내는 장-뇌 축의 변화는 PD 발병과 관련이 있습니다. 알파-시누클레인 응집체는^{PD 환자8}의 위장관에서 채취한 조직 샘플에서 발견되었으며, 동물 모델은 장 신경계의 알파-시누클레인 응집체가 프리온과 같은 방식으로 중추 신경계(⁹)에 퍼진다는 것을 시사한다. 또한, 복막투석 환자는 장내 마이크로바이옴(microbiome)¹⁰에 이상을 보이며 과도한 장내 염증을 경험할 수 있다¹¹. 파킨슨병의 변비는 파리(^12,13) 또는 설치류^(14,15)에서 파킨슨병과 관련된 변비에 대한 보고된 모델은 거의 없는 등 연구가 부족했다.

이 분석실험은 파리가 범 뉴런 드라이버인 n-synaptobrevin의 통제하에 인간 알파-시누클레인 유전자를 발현하는 PD의 초파리 모델을 사용합니다. 이 파리는 알파-시누클레인 응집, 운동 기능 장애 및 노화 관련 신경 퇴행을 포함한 PD의 모든 특징을 나타내어 도파민 뉴런^16,17의 손실을 초래합니다. 이전 연구에서는 소화 시스템의 기능적 차이를 밝히기 위해 파리의 배설물 배출량을 측정하고, 파리의 배설물을 정량화하고, 다양한 유전 계통에 걸쳐 배설량을 비교하는 방법을 도입했습니다 18,19,20. 여기에서, 우리는 인간 알파 시누클레인을 발현하는 파리를 이용한 변비 분석을 시연한다. 이 간단하지만 유용한 도구를 사용하면 PD의 중요한 비운동 증상을 연구할 수 있습니다.

프로토콜

이 분석에 사용된 파리: 대조군: nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+; 알파 시누클레인 파리: nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-알파-시누클레인/+; 1일 및 10일 후 폐쇄; 수컷과 암컷(짝짓기 및 짝짓기 없음) 파리( 재료 표 참조).

1. 염색 된 플라이 푸드 준비

1. 파란색 소프트 젤 페이스트 식용 색소( 재료 표 참조)와 증류수를 1:1 비율(v/v)로 혼합합니다.
   참고: 일부 파란색 염료는 신경 보호 효과가 있는 것으로 나타났으므로 비흡수성 염료만 포함된 상업용 식용 색소를 사용하십시오²¹.
2. 음식이 액체나 슬러리로 녹을 때까지 10-15초 간격으로 표준 옥수수 가루 한천( 재료 표 참조)으로 구성된 플라이 푸드 바이알을 전자레인지에 돌립니다. 음식이 끓지 않도록 하십시오.
3. 염료 혼합물을 식품의 각 바이알에 첨가하여 바이알 사이에 균일한 착색을 얻습니다. 식품이 균일한 파란색이 될 때까지 염료 혼합물을 혼합합니다(그림 1). 음식의 색이 포화되고 바이알 사이의 색이 변하지 않도록 파란색 염료 혼합물을 약간 첨가하십시오.
   알림: 이 단계는 음식이 빨리 굳기 때문에 전자레인지 직후에 수행해야 합니다. 음식이 굳으면 바이알을 다시 전자레인지에 돌리십시오.
4. 염색된 음식의 바이알이 굳을 때까지 공기 중에서 말리십시오. 건조하는 동안 바이알 입구에 얇은 종이 타월을 놓아 길 잃은 파리가 바이알에 떨어지지 않도록 합니다.
5. 음식이 식고 굳어지면 테스트에 사용할 파리를 파란색 음식으로 옮깁니다.
   알림: 좁은 바이알(25mm)의 경우 각 바이알에 9-14개의 파리를 추가하는 것이 좋습니다. 넓은 바이알(28.5mm)의 경우 각 바이알에 10-20개의 파리를 추가하는 것이 좋습니다. 파리는 성별이나 짝짓기 경험에 의해 분리되지 않으며 짝짓기 된 암컷과 짝짓기하지 않은 암컷과 함께 수컷과 암컷의 혼합 개체군을 포함합니다.
6. 파리가 있는 바이알을 인큐베이터에서 25°C에서 밤새 배양합니다.

2. 파리 이미징

참고: 이 단계는 선택 사항입니다(그림 2).

1. 다음날 아침 (시간 0), 대표 파리를 60 초 동안 이산화탄소로 마취시킵니다. 복부 쪽이 위쪽을 향하도록 파리를 놓습니다.
2. 카메라( 재료 표 참조)를 사용하여 매시간 파리의 이미지를 캡처하여 소화 시스템에 남아 있는 파란색 음식의 양을 시각화합니다.
   알림: 이 파리는 마취가 결과에 영향을 미칠 수 있으므로 분석의 정량 부분(3단계)에 사용해서는 안 됩니다.
3. 매 시간마다 새로운 파리를 마취하고 이미지를 촬영하십시오.

3. 변비 분석 수행

1. 나머지 (마취되지 않은) 파리는 표준 초파리 사료가 담긴 바이알로 옮깁니다. 각 바이알에 번호를 매깁니다.
2. 파리를 25°C의 인큐베이터에서 60분 동안 그대로 둡니다.
3. 60분 후, 파리를 표준 초파리 사료와 함께 새 유리병으로 옮깁니다. 첫 번째 바이알 세트에서 데이터 기록을 시작합니다.
4. 바이알 길이 아래에 점선을 그려 카운팅이 시작되는 지점을 표시합니다.
5. 각 바이알의 벽에 있는 작고 둥근 점의 수를 수동으로 계산합니다. 음식이나 바이알 플러그에 있는 점을 세지 마십시오.
6. 각 바이알의 벽에 있는 파란색 점의 수를 세는 것으로 시작합니다.
7. 각 유리병의 벽에 있는 불투명하고 무색의 점의 수를 세십시오.
   참고: 각 점은 소변과 배설물의 조합인 파리 배설물입니다²². 때때로 파리가 배설물 위를 걸어 다니며 흔적을 남길 수 있으며, 이 경우 흔적의 각 개별 표시가 아닌 원래 점만 계산합니다.
8. 각 바이알의 총 점 수에 대한 파란색 점의 비율을 기록합니다.
   알림: 총 점 수는 동일한 바이알 벽에 있는 무색 점 수에 바이알 벽에 있는 파란색 점 수를 더한 것입니다. 이것은 시간당 파란색 배설물의 백분율을 계산하는 데 사용됩니다.
9. 3.2-3.8단계를 7번 더 반복하여 총 8시간 동안 매시간 데이터를 수집합니다.

4. 데이터 분석

1. 각 조건에 대해 시간당 파란색 배설물 비율을 그래프로 표시합니다.
2. 조건 간의 데이터를 비교합니다.
   참고: 통계적 유의성은 조건 간의 개별 시점을 비교하거나, 시간 경과에 따른 선의 기울기를 측정하거나, 곡선 아래 면적을 비교하는 3가지 방법으로 결정할 수 있습니다.

결과

초파리의 복부는 투명하기 때문에 살아있는 마취된 파리의 장 안에서 푸른 음식을 시각화할 수 있습니다. 장 이동의 질적 차이는 다양한 시점에서 파리의 이미지를 촬영하여 평가할 수 있습니다. 대조군 파리에서는 파란색 음식이 빠르게 배출되는 반면 알파 시누클레인 파리에서는 파란색 음식이 8시간 동안 장에 존재합니다(그림 2).

알파 synuclein 파리는 eclosion^{10 후에 10} 일까지 발달하는 튼튼한 표현형과 더불어 나이 관련 neurodegeneration를, 표시합니다. 이 시점에서 대조군과 비교할 때 장 통과 시간의 차이는 조건 간의 개별 시점을 비교하거나, 시간 경과에 따른 선의 기울기를 측정하거나, 곡선 아래 면적을 비교하여 확인할 수 있습니다(그림 3). 운동 역기능과 neurodegeneration가 또한 아직 출석하지 않을 때 통제와 알파 synuclein 파리 사이 내장 이동에서 다름은 또한 출석하지 않는 더 이른 시점, 1 일 후에 eclosion (숫자 4)에서 관찰되지 않습니다.

그림 1: 파란색 식품 바이알과 배설물 반점. (A) 모든 바이알에는 파란색 식품이 들어 있습니다. 이 시점에서 파리는 이제 막 파란 음식에 들어갔고 파란 배설물은 보이지 않습니다. (B) w1118 파리가 날아간 후 바이알을 1시간 동안 신선한 음식으로 옮긴 다음 제거했습니다. 왼쪽 삽입은 (C)에서 확대되고 오른쪽 삽입은 (D)에서 확대됩니다. (C) 파리 먹이의 존재로 인해 분석에서 제외된 영역. (D) 파란색(검은색 화살표)과 파란색이 아닌 반점(노란색 화살표)을 나타내는 배설물 반점의 확대 보기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 시간 경과에 따른 염색된 식품의 장 이동의 시각화. 신경 세포에 있는 인간 알파 synuclein를 표현하는 대조군 파리 그리고 파리는 파랗 염색한 음식에 밤새 남겨두었다가 그 후에 표준 매체로 옮겼다. 파리는 매시간 새로운 표준 파리 먹이로 순차적으로 옮겨졌습니다. 전송 후 시간 0과 2, 4, 6, 8시간의 대표 이미지가 표시됩니다. 대조군과 알파 시누클레인 파리는 시간 0에서 장에 있는 파란 음식의 유사한 헝겊 조각을 보여줍니다. 후속 시점에서, 대조군 파리는 알파-시누클레인 파리보다 파란색 음식이 적고, 모든 파란색 음식은 대조군 파리의 8시간 시점에서 사라집니다. 각 플라이 라인의 유전자형은 다음과 같습니다: 대조군(nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); 알파-시누클레인(nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-알파-시누클레인/+)이 날아갑니다. 암컷 파리는 크기가 더 크기 때문에 복부를 시각화하는 능력이 더 쉽기 때문에 이미징에 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 폐실 후 10일째 변비 분석 . 신경 세포에 있는 인간 알파 synuclein를 표현하는 대조군 파리 그리고 파리는 밤새 파랗 염색한 음식에 남겨두었다가 그 후에 표준 비행거리 음식으로 옮겼다. 파리는 매시간 새로운 표준 매체로 순차적으로 옮겨졌습니다. (A) 시간당 파란색 배설물 비율. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. N = 유전자형당 6개의 바이알; 각 유리병에는 9-14마리의 파리가 들어 있었습니다. 모든 통계 분석은 Graphpad Prism에서 수행되었습니다( 재료 표 참조). 각 시점에서의 통계적 유의성은 이원 분산 분석을 사용하여 계산되었습니다. 선의 기울기와 기울기의 차이는 선형 회귀 분석을 사용하여 계산되었습니다. (B) 각 유전자형에 대한 곡선 아래 면적을 계산했습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 각 플라이 라인의 유전자형은 다음과 같습니다: 대조군(nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); 알파-시누클레인(nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-알파-시누클레인/+)이 날아갑니다. 수컷과 암컷 파리는 거의 같은 수로 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 폐실 후 1일차의 변비 분석. 신경 세포에 있는 인간 알파 synuclein를 표현하는 대조군 파리 그리고 파리는 파랗 염색한 음식에 밤새 남겨두었다가 그 후에 표준 매체로 옮겼다. 파리는 매시간 새로운 표준 파리 먹이로 순차적으로 옮겨졌습니다. (A) 시간당 파란색 배설물 비율. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. N = 유전자형당 최소 5개의 바이알; 각 유리병에는 9-14마리의 파리가 들어 있었습니다. 모든 통계 분석은 Graphpad Prism에서 수행되었습니다. 각 시점에서의 통계적 유의성은 이원 분산 분석을 사용하여 계산되었습니다. 선의 기울기와 기울기의 차이는 선형 회귀 분석을 사용하여 계산되었습니다. (B) 각 유전자형에 대한 곡선 아래 면적을 계산했습니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 각 플라이 라인의 유전자형은 다음과 같습니다: 대조군(nSyb-QF2, nSyb-Gal4/+); 알파-시누클레인(nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-알파-시누클레인/+)이 날아갑니다. 수컷과 암컷 파리는 거의 같은 수로 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜에는 분석을 성공적으로 완료하는 데 도움이 되는 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 각 바이알에 대한 각 라운드 사이의 시간 간격이 실험 전반에 걸쳐 일관되도록 하는 것이 중요합니다. 바이알에 번호를 표시하면 긴 유전자형 설명의 필요성을 피하고 시간을 절약하는 데 도움이 됩니다. 또한, 배설물(²² )을 계수하는 방법이 실험 전반에 걸쳐 일관되게 유지되는 것이 중요하다. 파란색 배설물은 음식과 바이알 플러그에서 볼 수 있지만 무색의 배설물은 보이지 않습니다. 따라서 음식이나 바이알 플러그의 파란색 점을 세지 마십시오.

행동 분석에서는 파리 행동의 변동 또는 분석에 영향을 미치는 알 수 없는 변수로 인해 결과가 일치하지 않을 가능성이 항상 있습니다. 모든 실험에 동일한 초파리 배지, 동일한 식용 염료 및 동일한 브랜드의 바이알을 사용하는 것이 좋습니다. 흥미롭게도, 몇몇 실험에서 파리는 이른 오후에 배변을 덜 하는 경향이 있는 것으로 관찰되었는데, 이는 아마도 파리의 일주기 리듬²³ 때문일 것이다. 그러나, 이 행동은 알파 synuclein를 표현하는 대조군 파리 그리고 파리 둘 다에서 일관됩니다, 그래서 우려를 일으키면 안됩니다.

분석 초기에 파리가 푸른 배설물을 배설하지 않으면 사용된 염료가 충분히 착색되지 않았을 수 있습니다. 이 경우 그에 따라 염료와 증류수의 비율을 높일 수 있습니다. 또한 파리의 소화관에 소량의 파란색 음식만 남아 있을 때 배설물이 옅은 파란색인지 무색인지 판단하기 어려울 수도 있습니다. 이런 일이 발생하면 바이알 뒤에 흰색 종이를 놓으면 배설물 점의 색상을 결정하는 데 도움이 됩니다. 배설물이 매우 연한 파란색일지라도 무색의 배설물보다는 파란색 배설물로 기록하는 것이 가장 좋습니다.

이 분석의 한 가지 한계는 대변 반점을 수동으로 계산해야 한다는 것입니다. 고처리량 스크리닝의 가능성을 개선하기 위해 이 프로토콜은 향후 다중 웰 플레이트에서 개별 파리에 의해 생성된 청색 분변 반점을 자동으로 정량화할 수 있도록 수정될 수 있습니다. 또 다른 한계는, 알파 synuclein 모형이 PD의 전구 모형으로 발전되는 잠재력이 있더라도, 변비가 neurodegeneration 없이 출석하는 최선 시점이 아직 확인되지 않았다 입니다.

요약하면, 이 방법은 PD의 초파리 모델에서 연구가 부족한 비운동 PD 증상인 변비를 모델링하는 간단하고 직접적인 접근 방식을 제공합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1400 g sucrose	MP Biomedicals	904713
1800 g dextrose	MP Biomedicals	901521
2884 g yeast	MP Biomedicals	903312
428 g agar	Fisher Scientific	10253156
4600 mL molasses	Grandma's Molasses	7971942
68 L water	N/A	N/A
680 mL tegosept mix (1200 g tegosept in 6 L ethanol)
6864 g cornmeal	Pearl Milling	125045
800 mL acid mix (83 mL phosphoric acid in 1 L water + 836 mL propionic acid in 1 L water)
cellSens Standard software	Olympus	N/A
Ethanol	Pharmco-Aper	111ACS200
Flugs for wide plastic vials	Genesee Scientific	49-101
Flystuff wide Drosophila vials, polystyrene	Genesee Scientific	32-117
Graphpad Prism	GraphPad	N/A	Version 9.5.1
Olympus DP23 camera	Olympus	N/A
Olympus SZX12 Stereo Microscope	Olympus	N/A
Phosphoric Acid	Fisher Scientific	S25470A
Propionic Acid	Fisher Scientific	A258 - 500
Soft gel paste food color, Royal blue	AmeriColor	202
Tegosept	Apex	20-258
Drosophila Stocks
nSyb-QF2, nSyb-Gal4	All lines provided by Dr. Mel Feany	N/A	Lines are available directly from Dr. Feany
nSyb-QF2, nSyb-Gal4, QUAS-alpha synuclein		N/A
w1118		N/A